CN106577297A

CN106577297A - 一种白玉兰组织培养基及其制备方法

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Publication number: CN106577297A
Application number: CN201611213685.3A
Authority: CN
Inventors: 叶宗瑞
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-12-24
Filing date: 2016-12-24
Publication date: 2017-04-26

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种白玉兰组织培养基及其制备方法。本发明提供的白玉兰组织培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述的添加剂的成分以终浓度计，包括：腺嘌呤110～130mg/L、谷胱甘肽12～16mg/L、氨基乙酸12～14mg/L、萘乙酸10～20mg/L、蛋白胨45～55mg/L、二甲基硒脲6～8mg/L、硫胺素4～10mg/L、活性炭0.04～0.1g/L和烟酸0.02～0.04mg/L。本发明的技术优势在于：成分明确且价格较低，有利于日常应用、广泛推广和产业化培养；在相同培养时间内所得细胞生物量高，更有利于白玉兰组织细胞的生长和繁殖。

Description

一种白玉兰组织培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种白玉兰组织培养基及其制备方法。

背景技术

19世纪30年代德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年德国植物学家哈伯兰特指出细胞全能性的理论是植物组培的理论基础。纵观国内外组培技术的发展，以花卉业和橡胶业为标志的植物组织培养已经开始步入实际应用阶段，植物组织培养技术不仅已经成为现代农林业实现科技创新、跨越式发展的坚实基础，而且也将成为易于普及和掌握，应用广泛地一种育苗技术手段。

目前的观赏植物培养基配方一般采用标准MS培养基，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。但是由于MS培养基坚固度不足，经过第一段时间后，瓶内的小植物容易发生倾斜，甚至全部沉入培养基中。也有的一些培养基中添加凝固剂，这些凝固剂不利于植物生长，生命周期太短。中国专利申请CN106069764A公开了一种观赏植物培养基、瓶装观赏植物及其制作方法，其配方以1/2MS培养基为基础原料，同时添加琼脂、植物凝胶、二氨基庚二酸、PQQ和卡那霉素，本发明针对的是大多数观赏植物而并不针对某一种植物，所以对于不同的植物其效果液并不相同。

白玉兰是玉兰花中开白色花的品种，又名木兰、玉兰等，属木兰科落叶乔木。目前国内为已经报道了较多白玉兰组织培养技术，但是白玉兰每一生长阶段所需的营养物质不同，因此，培养基的成分可能影响白玉兰组织培养的效果。现有培养基通常存在芽诱导效果差以及出根、长苗效果不佳的问题。中国专利申请CN105684912A公开了白玉兰组织培养基，包括芽诱导培养基、生根培养基和壮苗培养基，芽诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，添加赤霉素，生根培养基是以2/3MS培养基为基本培养基，添加吲哚乙酸、葡萄糖和赖氨酸，壮苗培养基是以1/2MS培养基为基本培养基添加萘乙酸、有机硒和蛋白胨，虽该培养基所得芽粗壮，整齐，出根量大，但是培养机制备及培育方法较为繁琐。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种白玉兰组织培养基及其制备方法。

本发明一种白玉兰组织培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述的添加剂的成分以终浓度计，包括：腺嘌呤110～130mg/L、谷胱甘肽12～16mg/L、氨基乙酸12～14mg/L、萘乙酸10～20mg/L、蛋白胨45～55mg/L、二甲基硒脲6～8mg/L、硫胺素4～10mg/L、活性炭0.04～0.1g/L和烟酸0.02～0.04mg/L。

优选的，所述的白玉兰组织培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：腺嘌呤120mg/L、谷胱甘肽14mg/L、氨基乙酸13mg/L、萘乙酸15mg/L、蛋白胨50mg/L、二甲基硒脲7mg/L、硫胺素7mg/L、活性炭0.07g/L和烟酸0.03mg/L。

再优选的，所述的基础培养基为MS培养基。

另外，本发明还提供了一种白玉兰组织培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、向基础培养基中加入腺嘌呤、谷胱甘肽、氨基乙酸、萘乙酸和蛋白胨，搅拌30-40分钟，再加入二甲基硒脲、硫胺素、活性炭和烟酸，继续搅拌20-30分钟，得混合物；

S2、调节步骤S1所得的混合物的pH至5.5-6.0，116-120℃、5MPa压力下灭菌，灭菌时间为20-30分钟即得。

优选的，所述步骤S1搅拌35分钟。

优选的，所述步骤S1继续搅拌25分钟。

优选的，所述的步骤S1所得混合物的pH至5.8。

优选的，所述步骤S2中118℃灭菌。

再优选的，所述步骤S2灭菌25分钟。

腺嘌呤(CAS号73-24-5)：腺嘌呤分子式C₅H₅N₅化学成分维生素B₄，其化学名称为磷酸腺嘌呤，白色结晶性粉末，味微酸，溶于沸水和氢氧化钠溶液，微溶于冷水、稀盐酸，不溶于乙醇和氯仿，是核酸的主要成分，参与RNA和DNA的合成。

谷胱甘肽(CAS号70-18-8)：分子式C₁₀H₁₇O₆N₃S，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用。

氨基乙酸(CAS号56-40-6)：结构简式NH₂CH₂COOH，俗称甘氨酸、胶糖，白色单斜晶系或六方晶系晶体。

萘乙酸(CAS号86-87-3)：分子式C₁₂H₁₀O₂，分子量：186.21。萘乙酸是促进植物根系生长的植物生长调节剂，也是萘乙酰胺的中间体。萘乙酸用作植物生长调节剂，在医药上用作鼻眼净和眼可明的原料。萘乙酸具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，增加坐果，防止落果，改变雌、雄花比率等。萘乙酸可经叶片、树枝的嫩表皮、种子进入到植物体内，随同营养流输导到作用部位。通常用于小麦、水稻、棉花、茶、桑、番茄、苹果、瓜类、马铃薯、林木等，是一种良好的植物生长刺激素。

蛋白胨(CAS号68308-36-1)：是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息，含有丰富的有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类，可以为植物生长提供C源、N源、生长因子等营养物质。

二甲基硒脲(CAS号5117-16-8)：分子式C₃H₈N₂Se，含有氮元素和硒元素为植物生长提供所需的元素。

硫胺素(CAS号：70-16-6)：又称维生素B1，为白色晶体，在有氧化剂时容易被氧化产生脱氢硫胺素。由嘧啶环和噻唑环通过亚甲基结合而成的一种B族维生素，为白色结晶或结晶性粉末。

活性炭：活性炭可以降低组织培养物的有害代谢物浓度，对细胞生长有利。活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5—羟甲基糖醛及激素等。

烟酸(CAS号59-67-6)：烟酸也称作维生素B3，或维生素PP，分子式：C₆H₅NO₂，耐热，能升华。烟酸又名尼克酸、抗癞皮病因子。是一种水溶性维生素，属于维生素B族。

本发明配伍合理、科学，各组分相互配合、协同作用，使该白玉兰组织培养基对白玉兰组织细胞的生长和繁殖具有很好的促进作用。

与现有技术相比，本发明的技术优势在于：成分明确且价格较低，有利于日常应用、广泛推广和产业化培养；在相同培养时间内所得细胞生物量高，更有利于白玉兰组织细胞的生长和繁殖。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的保护范围。

本发明MS培养基可购自青岛海博生物技术有限公司。

实施例1、一种白玉兰组织培养基

所述的白玉兰组织培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：腺嘌呤110mg/L、谷胱甘肽12mg/L、氨基乙酸12mg/L、萘乙酸10mg/L、蛋白胨45mg/L、二甲基硒脲6mg/L、硫胺素4mg/L、活性炭0.04g/L和烟酸0.02mg/L。

所述的基础培养基为MS培养基。

制备方法：

S1、向基础培养基中加入腺嘌呤、谷胱甘肽、氨基乙酸、萘乙酸和蛋白胨，搅拌30分钟，再加入二甲基硒脲、硫胺素、活性炭和烟酸，继续搅拌20分钟，得混合物；

S2、调节步骤S1所得的混合物的pH至5.5，116℃、5MPa压力下灭菌，灭菌时间为20分钟即得。

实施例2、一种白玉兰组织培养基

所述的白玉兰组织培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：腺嘌呤120mg/L、谷胱甘肽14mg/L、氨基乙酸13mg/L、萘乙酸15mg/L、蛋白胨50mg/L、二甲基硒脲7mg/L、硫胺素7mg/L、活性炭0.07g/L和烟酸0.03mg/L。

所述的基础培养基为MS培养基。

制备方法：

S1、向基础培养基中加入腺嘌呤、谷胱甘肽、氨基乙酸、萘乙酸和蛋白胨，搅拌35分钟，再加入二甲基硒脲、硫胺素、活性炭和烟酸，继续搅拌25分钟，得混合物；

S2、调节步骤S1所得的混合物的pH至5.8，118℃、5MPa压力下灭菌，灭菌时间为25分钟即得。

实施例3、一种白玉兰组织培养基

所述的白玉兰组织培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：腺嘌呤130mg/L、谷胱甘肽16mg/L、氨基乙酸14mg/L、萘乙酸20mg/L、蛋白胨55mg/L、二甲基硒脲8mg/L、硫胺素10mg/L、活性炭0.1g/L和烟酸0.04mg/L。

所述的基础培养基为MS培养基。

制备方法：

S1、向基础培养基中加入腺嘌呤、谷胱甘肽、氨基乙酸、萘乙酸和蛋白胨，搅拌40分钟，再加入二甲基硒脲、硫胺素、活性炭和烟酸，继续搅拌30分钟，得混合物；

S2、调节步骤S1所得的混合物的pH至6.0，120℃、5MPa压力下灭菌，灭菌时间为30分钟即得。

对比例1、一种白玉兰组织培养基

所述的白玉兰组织培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：腺嘌呤120mg/L、谷胱甘肽27mg/L、萘乙酸15mg/L、蛋白胨50mg/L、二甲基硒脲7mg/L、硫胺素7mg/L、活性炭0.07g/L和烟酸0.03mg/L。

所述的基础培养基为MS培养基。

制备方法与实施例2类似。

与实施例2的区别在于：未添加氨基乙酸，增加谷胱甘肽的浓度。

对比例2、一种白玉兰组织培养基

所述的白玉兰组织培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：腺嘌呤120mg/L、谷胱甘肽14mg/L、氨基乙酸13mg/L、萘乙酸15mg/L、蛋白胨50mg/L、硫胺素14mg/L、活性炭0.07g/L和烟酸0.03mg/L。

所述的基础培养基为MS培养基。

制备方法与实施例2类似。

与实施例2的区别在于：未添加二甲基硒脲，增加硫胺素的浓度。

产品性能评价测试

本发明白玉兰组织培养基对白玉兰的培养效果。

试验对象：本发明实施例1-3和对比例1-2所得白玉兰组织培养基。

细胞培养：将白玉兰细胞按5g鲜重/瓶的量分别接种于实施例1-3和对比例1-2所得培养基，置于摇床中进行悬浮培养，在25℃温度下培养，摇床转速100r/min，暗培养，细胞培养15天后，测定细胞生物量。

细胞生物量的测定：取白玉兰细胞悬浮培养液，用滤纸过滤，将细胞置于烘箱中，60℃烘50h至恒重，称得其干重，为细胞生物量。

不同培养基所得细胞生物量如表1所示。

表1不同培养基所得细胞生物量比较

培养基	实施例1	实施例2	实施例3	对比例1	对比例2
						细胞生物量(g/L)	18.2	21.5	19.3	11.2	13.6

从表1可以看出，在相同的培养时间内，生长在本发明实施例1-3培养基中所得细胞生物量，明显高于生长在对比例1-2培养基中所得细胞生物量。这说明，本发明实施例1-3培所得的白玉兰组织培养基更有利于白玉兰组织细胞的生长繁殖。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选的实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种白玉兰组织培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述的添加剂的成分以终浓度计，包括：腺嘌呤110～130mg/L、谷胱甘肽12～16mg/L、氨基乙酸12～14mg/L、萘乙酸10～20mg/L、蛋白胨45～55mg/L、二甲基硒脲6～8mg/L、硫胺素4～10mg/L、活性炭0.04～0.1g/L和烟酸0.02～0.04mg/L。

2.根据权利要求1所述的白玉兰组织培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：腺嘌呤120mg/L、谷胱甘肽14mg/L、氨基乙酸13mg/L、萘乙酸15mg/L、蛋白胨50mg/L、二甲基硒脲7mg/L、硫胺素7mg/L、活性炭0.07g/L和烟酸0.03mg/L。

3.根据权利要求1或2所述的白玉兰组织培养基，其特征在于，所述的基础培养基为MS培养基。

4.根据权利要求1-3任一项所述的白玉兰组织培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的白玉兰组织培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S1搅拌35分钟。

6.根据权利要求4所述的白玉兰组织培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S1继续搅拌25分钟。

7.根据权利要求4所述的白玉兰组织培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S1所得混合物的pH至5.8。

8.根据权利要求4所述的白玉兰组织培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中118℃灭菌。

9.根据权利要求4所述的白玉兰组织培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S2灭菌25分钟。