CN106577282A - 一种采用顶芽培养绿萝的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用顶芽培养绿萝的方法。本发明的方法包括以下步骤：(1)提供一顶芽；(2)将所述顶芽进行诱导培养，形成愈伤组织；(3)将所述愈伤组织进行继代培养；(4)将经所述继代培养的愈伤组织进行诱导培养，形成丛生芽；(5)将所述丛生芽进行生根培养，形成绿萝根苗；(6)将所述绿萝根苗栽培。本发明的培养方法，以绿萝顶芽作为外植体材料，利用组织培养对绿萝进行快速繁殖，不受季节与气候的限制，可有效地大量繁殖绿萝后代，极大的缩短了生产周期，且后代遗传性状与亲本高度一致，为绿萝规模化生产提供了一条有效途径。

Description

一种采用顶芽培养绿萝的方法
技术领域
本发明涉及绿萝培养的技术领域，具体而言，涉及一种采用顶芽培养绿萝的方法。
背景技术
绿萝原产地在印度尼西亚所罗门群岛的热带雨林中，性喜温暖、潮湿环境，要求土壤疏松肥沃、排水良好。在热带地区常攀援生长于岩石和树干上，成为巨大的观赏藤本植物，我国南方各地均有栽植。绿萝耐阴性强，终年常绿，叶面有较厚的角质层，能适应室内干燥的环境条件，是优良的室内观叶植物。此外，还能吸附和去除室内空气中的甲醛、苯、三氯乙烯等污染物，是天然的“空气净化器”，具有较大的市场前景。
现有技术中，绿萝主要通过扦插繁殖，插条用量大，占地面积广，同时，绿萝生长环境高温高湿，扦插繁殖的后代极易感病菌，生产中经常出现大规模茎腐、根腐现象，影响其繁殖率。
发明内容
有鉴于此，本发明一方面在于提供一种采用顶芽培养绿萝的方法，该方法的繁殖率较高，且繁殖周期较短。
一种采用顶芽培养绿萝的方法，包括以下步骤：
(1)提供一茎段顶芽；
(2)将所述顶芽进行诱导培养，形成愈伤组织；
(3)将所述愈伤组织进行继代培养；
(4)将经所述继代培养的愈伤组织进行诱导培养，形成丛生芽；
(5)将所述丛生芽进行生根培养，形成绿萝根苗；
(6)将所述绿萝根苗栽培。
进一步地，提供所述茎段顶芽具体为，取5～8cm顶芽由先之后依次进行消毒和清洗，再修剪至长度为2～3cm。
进一步地，形成愈伤组织的诱导培养包括第一阶段培养以形成膨大体，以及第二阶段培养以形成愈伤组织；所述第一阶段和第二阶段培养的温度均为25～28℃，湿度均为50～65％；所述第一阶段培养的天数为28～32d；所述第二阶段培养的天数为38～42d；
优选地，第一阶段的培养基包含412.5mg/L硝酸铵、475mg/L硝酸钾、110mg/L氯化钙、92.5mg/L硫酸镁、42.5mg/L二氢磷酸钾、0.415mg/L碘化钾、3.1mg/L硼酸、11.15mg/L硫酸锰、4.3mg/L硫酸锌、0.125mg/L钼酸钠、0.0125mg/L硫酸铜、0.0125mg/L氯化钴、13.9mg/L硫酸亚铁、18.65mg/L EDTA二钠、1～5mg/L肌醇、0.5～3mg/L烟酸、0.5～2盐酸吡哆醇、3～6mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、50mg/L精氨酸、100mg/L天冬氨酸、150mg/L谷氨酸、1.0～3.0mg/L 6-BA、0.08～0.12mg/L植物生长调节剂TDZ、0.1～0.3mg/Lα-萘乙酸、0.03～0.07mg/L 2,4-D、25～35g/L蔗糖和5～10g/L琼脂粉；
第二阶段的培养基包含825mg/L硝酸铵、950mg/L硝酸钾、220mg/L氯化钙、185mg/L硫酸镁、85mg/L二氢磷酸钾、0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L硫酸铜、0.025mg/L氯化钴、27.8mg/L硫酸亚铁、37.3mg/LEDTA二钠、1～5mg/L肌醇、0.5～3mg/L烟酸、0.5～2盐酸吡哆醇、3～6mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L精氨酸、50mg/L天冬氨酸、200mg/L谷氨酸、2.0～4.0mg/L 6-BA、0.4～0.6mg/L IBA、25～35g/L蔗糖、200～500g/l的水解酪蛋白和5～10g/L琼脂粉。。
进一步地于，所述继代培养的培养基包含1650mg/L硝酸铵、1900mg/L硝酸钾、440mg/L氯化钙、370mg/L硫酸镁、170mg/L二氢磷酸钾、0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L硫酸铜、0.025mg/L氯化钴、27.8mg/L硫酸亚铁、37.3mg/L EDTA二钠、1～5mg/L肌醇、0.5～3mg/L烟酸、0.5～2盐酸吡哆醇、3～6mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、1.0～3.0mg/L 6-BA、0.9～1.1mg/L玉米素、0.2～0.4mg/L吲哚乙酸α-萘乙酸、40～60mg维生素C、20～30g/L蔗糖和5～10g/L琼脂粉；
优选地，所述继代培养在1500～2000Lx的强度光照下进行，所述光照的时间为10～15h/d，温度为25～28℃，湿度为50～65％，培养的天数为38～42d。
进一步地，形成从生芽的诱导培养所采用的诱导培养基包含MS培养基、0.05～0.1mg/L 6-BAα-萘乙酸、1～2mg/L吲哚丁酸、0.5～1mg/Lα-萘乙酸、25～35g/L蔗糖、25～35g/L香蕉和5～10g/L琼脂粉；注意，这里，MS培养基为公知的培养基，其组成为：1650mg/L硝酸铵、1900mg/L硝酸钾、440mg/L氯化钙、370mg/L硫酸镁、170mg/L二氢磷酸钾、0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L硫酸铜、0.025mg/L氯化钴、27.8mg/L硫酸亚铁、37.3mg/L EDTA二钠、100mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、0.5盐酸吡哆醇、0.1mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸。
优选地，形成从生芽的诱导培养在1500～2000Lx的强度光照下进行，所述光照的时间为10～15h/d，温度为25～28℃，湿度均为50～65％，培养的天数为30～60d。
进一步地，所述生根培养的培养基包含MS培养基、0.05～0.1mg/Lα-萘乙酸、0.01～0.05mg/L吲哚乙酸、25～35g/L蔗糖、30～50g/L土豆泥和5～10g/L琼脂粉；
优选地，所述生根培养在1500～2000Lx的强度光照下进行，所述光照的时间为12～16h/d，温度为25～28℃，湿度为50～65％；所述生根培养的天数为55～65d。
进一步地，所述栽培包括以下步骤：
(61)将所述绿萝根苗进行炼苗；
(62)将经所述炼苗的绿萝根苗进行移栽；
(63)对所述移栽的绿萝根苗进行田间管理以使其生长。
进一步地，所述炼苗在1500～2000Lx的强度光照下进行，所述光照的时间为10～15h/d，温度为25～28℃，湿度均为50～65％，所述炼苗的天数为12～16d。
进一步地，所述移栽所采用的基质包含质量比为1：2～4的珍珠岩和椰糠。
进一步地于，所述炼苗之后且在移栽之前还包括使用多菌灵可湿性粉剂的稀释液进行消毒。
上述MS培养基的组成浓度可采用常规的，于此不详述。
如上文所述之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量分数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)；
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，井且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
以上未述及之处适用于现有技术。
本发明的培养方法，以绿萝茎段顶芽作为外植体材料，利用组织培养对绿萝进行快速繁殖，不受季节与气候的限制，可有效地大量繁殖绿萝后代，极大的缩短了生产周期，且后代遗传性状与亲本高度一致，为绿萝规模化生产提供了一条有效途径。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面合实施例来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
步骤一、外植体的选取。具体为，选取形态正常、生长旺盛的健壮母株进行预处理(使用80％多菌灵可湿性粉剂1000倍液灌根，每10天一次)，切取茎生长点处5cm茎段顶芽，经表面除杂、清洗后的外植体转入超净工作台进行消毒处理，此消毒为先在体积分数为75％的酒精浸泡15s，再置入0.1wt％HgCl溶液中浸泡13min，消毒完毕后使用无菌水清洗3～5遍后，得到无菌的绿萝茎段。
步骤二、愈伤组织的诱导培养。具体为，将绿萝茎段在超净工作台上及无菌条件下修剪至长度为2cm的段样，接种到愈伤组织诱导培养基(包含412.5mg/L硝酸铵、475mg/L硝酸钾、110mg/L氯化钙、92.5mg/L硫酸镁、42.5mg/L二氢磷酸钾、0.415mg/L碘化钾、3.1mg/L硼酸、11.15mg/L硫酸锰、4.3mg/L硫酸锌、0.125mg/L钼酸钠、0.0125mg/L硫酸铜、0.0125mg/L氯化钴、13.9mg/L硫酸亚铁、18.65mg/L EDTA二钠、1mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、0.5盐酸吡哆醇、3mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、50mg/L精氨酸、100mg/L天冬氨酸、150mg/L谷氨酸、1.0mg/L 6-BA、0.08mg/L植物生长调节剂TDZ、0.1mg/Lα-萘乙酸、0.03mg/L 2,4-D、25g/L蔗糖和5g/L琼脂粉)中，在温度为25℃，湿度为65％的条件下进行暗培养，培养38天后得到绿萝茎段膨大体。
然后将将得到的膨大茎段纵切后转接入愈伤组织诱导培养基(包含825mg/L硝酸铵、950mg/L硝酸钾、220mg/L氯化钙、185mg/L硫酸镁、85mg/L二氢磷酸钾MS培养基、0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L硫酸铜、0.025mg/L氯化钴、27.8mg/L硫酸亚铁、37.3mg/L EDTA二钠、1mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、0.5盐酸吡哆醇、3mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L精氨酸、50mg/L天冬氨酸、200mg/L谷氨酸、2.0mg/L 6-BA、0.4～0.6mg/L IBA、25g/L蔗糖、200g/l的水解酪蛋白和5g/L琼脂粉)中，在温度为25℃，湿度为50％的条件下暗培养42天，获得愈伤组织。
步骤三、愈伤组织的继代培养。具体为，将愈伤组织在超净工作台上及无菌条件下，转接到继代培养基(包含1650mg/L硝酸铵、1900mg/L硝酸钾、440mg/L氯化钙、370mg/L硫酸镁、170mg/L二氢磷酸钾、0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L硫酸铜、0.025mg/L氯化钴、27.8mg/L硫酸亚铁、37.3mg/LEDTA二钠、1mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、0.5盐酸吡哆醇、3mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、1.0mg/L 6-BA、0.9mg/L玉米素、0.2mg/L吲哚乙酸、40mg维生素C、20g/L蔗糖和5g/L琼脂粉)中，然后将其置于LED灯作为光源的环境下，在光照强度为15001x，每日光照时间为15h，温度为25℃，湿度为50％的条件下，进行愈伤组织的继代培养，经过42天，获得新一代愈伤组织。
步骤四、丛生芽培养。具体为，在超净工作台上及无菌条件下，将愈伤组织接种到芽诱导培养基(MS培养基、0.05mg/L 6-BA、1mg/L吲哚丁酸、0.5mg/Lα-萘乙酸、25g/L蔗糖、25g/L香蕉和5g/L琼脂粉)中培养，培养条件：光照强度为15001x，每日光照时间为15h，温度为25℃，湿度为50％，培养60天后获得绿萝丛生芽。
步骤五、生根培养。具体为，在超净工作台上及无菌条件下，将绿萝丛生芽按照芽苗数量切分成单株，切掉基部组织和部分叶片，然后接种到生根培养基(MS培养基、0.05mg/Lα-萘乙酸、0.01mg/L吲哚乙酸、25g/L蔗糖、30g/L土豆泥和5g/L琼脂粉)中培养，培养条件：光照强度为15001x，每日光照时间为10小时，温度为25℃，湿度为50％培养55～65天后获得绿萝试管苗。
步骤六、炼苗。具体为，将已生根的绿萝容器苗转移至育苗温室放置12天。要求室内光照强度20001x，每日光照时间15小时，温度25℃，湿度60％。
步骤七、出苗。将炼苗后的绿萝组培苗从容器中取出，用清水将培养基清洗干净，使用80wt％多菌灵可湿性粉剂的1000倍液浸泡消毒1min。
步骤八、移栽。将清洗干净并消毒的绿萝组培苗种植到口径90cm的花盆中，基质采用珍珠岩和椰糠按照1：2的质量比混合，移栽完成后浇透水，使用80wt％多菌灵可湿性粉剂的1000倍液喷雾处理。
步骤九、田间管理。具体为，在移栽后15天内，控制光照强度为2000～25001x，每日光照时间为12小时，温度为22℃，湿度为85％；移栽15天后控制光照强度为25001x，每日光照时间为12小时，温度为24℃，湿度为60％；在移栽30天后控制光照强度为25001x，每日光照时间为12小时，温度为24℃，湿度为60％，开始进行施肥管理和病虫害防控。
实施例2
步骤一、外植体的选取。具体为，选取形态正常、生长旺盛的健壮母株进行预处理(使用80％多菌灵可湿性粉剂1000倍液灌根，每10天一次)，切取茎生长点处8cm茎段顶芽，经表面除杂、清洗后的外植体转入超净工作台进行消毒处理，此消毒为先在体积分数为75％的酒精浸泡15s，再置入0.1wt％HgCl溶液中浸泡13min，消毒完毕后使用无菌水清洗3～5遍后，得到无菌的绿萝茎段。
步骤二、愈伤组织的诱导培养。具体为，将绿萝茎段在超净工作台上及无菌条件下修剪至长度为3cm的段样，接种到愈伤组织诱导培养基(包含412.5mg/L硝酸铵、475mg/L硝酸钾、110mg/L氯化钙、92.5mg/L硫酸镁、42.5mg/L二氢磷酸钾、0.415mg/L碘化钾、3.1mg/L硼酸、11.15mg/L硫酸锰、4.3mg/L硫酸锌、0.125mg/L钼酸钠、0.0125mg/L硫酸铜、0.0125mg/L氯化钴、13.9mg/L硫酸亚铁、18.65mg/L EDTA二钠、5mg/L肌醇、3mg/L烟酸、2盐酸吡哆醇、6mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、50mg/L精氨酸、100mg/L天冬氨酸、150mg/L谷氨酸、3.0mg/L 6-BA、0.12mg/L植物生长调节剂TDZ、0.3mg/Lα-萘乙酸、0.07mg/L 2,4-D、35g/L蔗糖和10g/L琼脂粉)中，在温度为28℃，湿度为65％的条件下进行暗培养，培养42天后得到绿萝茎段膨大体。
然后将将得到的膨大茎段纵切后转接入愈伤组织诱导培养基(包含825mg/L硝酸铵、950mg/L硝酸钾、220mg/L氯化钙、185mg/L硫酸镁、85mg/L二氢磷酸钾MS培养基、0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L硫酸铜、0.025mg/L氯化钴、27.8mg/L硫酸亚铁、37.3mg/L EDTA二钠、5mg/L肌醇、3mg/L烟酸、2mg/L盐酸吡哆醇、6mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L精氨酸、50mg/L天冬氨酸、200mg/L谷氨酸、4.0mg/L 6-BA、0.6mg/L IBA、35g/L蔗糖、500g/l的水解酪蛋白和10g/L琼脂粉)中，在温度为28℃，湿度为65％的条件下暗培养38天，获得愈伤组织。
步骤三、愈伤组织的继代培养。具体为，将愈伤组织在超净工作台上及无菌条件下，转接到继代培养基(包含1650mg/L硝酸铵、1900mg/L硝酸钾、440mg/L氯化钙、370mg/L硫酸镁、170mg/L二氢磷酸钾、0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L硫酸铜、0.025mg/L氯化钴、27.8mg/L硫酸亚铁、37.3mg/LEDTA二钠、5mg/L肌醇、3mg/L烟酸、2盐酸吡哆醇、6mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、3.0mg/L 6-BA、1.1mg/L玉米素、0.4mg/L吲哚乙酸、60mg维生素C、30g/L蔗糖和10g/L琼脂粉)中，然后将其置于LED灯作为光源的环境下，在光照强度为20001x，每日光照时间为10h，温度为28℃，湿度为65％的条件下，进行愈伤组织的继代培养，经过42天，获得新一代愈伤组织。
步骤四、丛生芽培养。具体为，在超净工作台上及无菌条件下，将愈伤组织接种到芽诱导培养基(0.1mg/L 6-BA、2mg/L吲哚丁酸、1mg/Lα-萘乙酸、35g/L蔗糖、35g/L香蕉和10g/L琼脂粉)中培养，培养条件：光照强度为20001x，每日光照时间为10h，温度为28℃，湿度为65％，培养60天后获得绿萝丛生芽。
步骤五、生根培养。具体为，在超净工作台上及无菌条件下，将绿萝丛生芽按照芽苗数量切分成单株，切掉基部组织和部分叶片，然后接种到生根培养基(MS培养基、0.1mg/Lα-萘乙酸、0.05mg/L吲哚乙酸、35g/L蔗糖、50g/L土豆泥和10g/L琼脂粉)中培养，培养条件：光照强度为20001x，每日光照时间为15小时，温度为28℃，湿度为65％；培养60天后再将绿萝芽苗转接至生根培养基中培养，培养条件：光照强度为20001x，每日光照时间为16小时，温度为28℃，湿度为65％，培养32天后获得绿萝生根苗。
步骤六、炼苗。具体为，将已生根的绿萝容器苗转移至育苗温室放置16天。要求室内光照强度30001x，每日光照时间10小时，温度28℃，湿度75％。
步骤七、出苗。将炼苗后的绿萝组培苗从容器中取出，用清水将培养基清洗干净，使用80wt％多菌灵可湿性粉剂的1000倍液浸泡消毒1min。
步骤八、移栽。将清洗干净并消毒的绿萝组培苗种植到口径90cm的花盆中，基质采用珍珠岩和椰糠按照1：4的质量比混合，移栽完成后浇透水，使用80wt％多菌灵可湿性粉剂的1000倍液喷雾处理。
步骤九、田间管理。具体为，在移栽后15天内，控制光照强度为25001x，每日光照时间为12小时，温度为24℃，湿度为90％；移栽15天后控制光照强度为30001x，每日光照时间为12小时，温度为28℃，湿度为75％；在移栽30天后控制光照强度为30001x，每日光照时间为12小时，温度为28℃，湿度为70％，开始进行施肥管理和病虫害防控。
实施例3
步骤一、外植体的选取。具体为，选取形态正常、生长旺盛的健壮母株进行预处理(使用80％多菌灵可湿性粉剂1000倍液灌根，每10天一次)，切取茎生长点处6.5cm茎段顶芽，经表面除杂、清洗后的外植体转入超净工作台进行消毒处理，此消毒为先在体积分数为75％的酒精浸泡15s，再置入0.1wt％HgCl溶液中浸泡13min，消毒完毕后使用无菌水清洗3～5遍后，得到无菌的绿萝茎段。
步骤二、愈伤组织的诱导培养。具体为，将绿萝茎段在超净工作台上及无菌条件下修剪至长度为2.5cm的段样，接种到愈伤组织诱导培养基(412.5mg/L硝酸铵、475mg/L硝酸钾、110mg/L氯化钙、92.5mg/L硫酸镁、42.5mg/L二氢磷酸钾、0.415mg/L碘化钾、3.1mg/L硼酸、11.15mg/L硫酸锰、4.3mg/L硫酸锌、0.125mg/L钼酸钠、0.0125mg/L硫酸铜、0.0125mg/L氯化钴、13.9mg/L硫酸亚铁、18.65mg/L EDTA二钠、1～5mg/L肌醇、1.8mg/L烟酸、1.25盐酸吡哆醇、4.5mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、50mg/L精氨酸、100mg/L天冬氨酸、150mg/L谷氨酸、2mg/L 6-BA、0.10mg/L植物生长调节剂TDZ、0.2mg/Lα-萘乙酸、0.05mg/L 2,4-D、30g/L蔗糖和7g/L琼脂粉)中，在温度为26℃，湿度为58％的条件下进行暗培养，培养40天后得到绿萝茎段膨大体。
然后将将得到的膨大茎段纵切后转接入愈伤组织诱导培养基(包含825mg/L硝酸铵、950mg/L硝酸钾、220mg/L氯化钙、185mg/L硫酸镁、85mg/L二氢磷酸钾MS培养基、0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L硫酸铜、0.025mg/L氯化钴、27.8mg/L硫酸亚铁、37.3mg/L EDTA二钠、3mg/L肌醇、1.8mg/L烟酸、1.25盐酸吡哆醇、4.5mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L精氨酸、50mg/L天冬氨酸、200mg/L谷氨酸、3mg/L 6-BA、0.5mg/L IBA、30g/L蔗糖、350g/l的水解酪蛋白和7g/L琼脂粉)中，在温度为26℃，湿度为58％的条件下暗培养40天，获得愈伤组织。
步骤三、愈伤组织的继代培养。具体为，将愈伤组织在超净工作台上及无菌条件下，转接到继代培养基(包含1650mg/L硝酸铵、1900mg/L硝酸钾、440mg/L氯化钙、370mg/L硫酸镁、170mg/L二氢磷酸钾、0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L硫酸铜、0.025mg/L氯化钴、27.8mg/L硫酸亚铁、37.3mg/LEDTA二钠、3mg/L肌醇、1.8mg/L烟酸、1.25盐酸吡哆醇、4.5mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、2.0mg/L 6-BA、1mg/L玉米素、0.3mg/L吲哚乙酸、50mg维生素C、25g/L蔗糖和7g/L琼脂粉)中，然后将其置于LED灯作为光源的环境下，在光照强度为18001x，每日光照时间为12h，温度为26℃，湿度为58％的条件下，进行愈伤组织的继代培养，经过40天，获得新一代愈伤组织。
步骤四、丛生芽培养。具体为，在超净工作台上及无菌条件下，将愈伤组织接种到芽诱导培养基(0.075mg/L 6-BAα-萘乙酸、1.5mg/L吲哚丁酸、0.75mg/Lα-萘乙酸、30g/L蔗糖、30g/L香蕉和7g/L琼脂粉)中培养，培养条件：光照强度为18001x，每日光照时间为12h，温度为26℃，湿度为58％，培养45天后获得绿萝丛生芽。
步骤五、生根培养。具体为，在超净工作台上及无菌条件下，将绿萝丛生芽按照芽苗数量切分成单株，切掉基部组织和部分叶片，然后接种到生根培养基(MS培养基、0.075mg/Lα-萘乙酸、0.03mg/L吲哚乙酸、30g/L蔗糖、40g/L土豆泥和7g/L琼脂粉)中培养，培养条件：光照强度为18001x，每日光照时间为12小时，温度为26℃，湿度为58％；培养45天后再将绿萝芽苗转接至生根培养基中培养，培养条件：光照强度为18001x，每日光照时间为14小时，温度为26℃，湿度为58％，培养30天后获得绿萝生根苗。
步骤六、炼苗。具体为，将已生根的绿萝容器苗转移至育苗温室放置14天。要求室内光照强度25001x，每日光照时间12小时，温度26℃，湿度68％。
步骤七、出苗。将炼苗后的绿萝组培苗从容器中取出，用清水将培养基清洗干净，使用80wt％多菌灵可湿性粉剂的1000倍液浸泡消毒1min。
步骤八、移栽。将清洗干净并消毒的绿萝组培苗种植到口径90cm的花盆中，基质采用珍珠岩和椰糠按照1：3的质量比混合，移栽完成后浇透水，使用80wt％多菌灵可湿性粉剂的1000倍液喷雾处理。
步骤九、田间管理。具体为，在移栽后15天内，控制光照强度为22001x，每日光照时间为12小时，温度为23℃，湿度为87％；移栽15天后控制光照强度为27001x，每日光照时间为12小时，温度为26℃，湿度为68％；在移栽30天后控制光照强度为28001x，每日光照时间为12小时，温度为26℃，湿度为65％，开始进行施肥管理和病虫害防控。对实施例1～3的从生芽和生根的诱导率等进行相关的测试，如下表：
表 绿萝组织的诱导率
由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现，但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本发明，当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。此处，出于篇幅的考虑，省略了给出某一项或多项数值范围内具体值的实施例，此不应当视为本发明的技术方案的公开不充分。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式选择等，落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种采用顶芽培养绿萝的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供一茎段顶芽；
(2)将所述顶芽进行诱导培养，形成愈伤组织；
(3)将所述愈伤组织进行继代培养；
(4)将经所述继代培养的愈伤组织进行诱导培养，形成丛生芽；
(5)将所述丛生芽进行生根培养，形成绿萝根苗；
(6)将所述绿萝根苗栽培。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提供所述茎段顶芽具体为，取5～8cm顶芽由先之后依次进行消毒和清洗，再修剪至长度为2～3cm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，形成愈伤组织的诱导培养包括第一阶段培养以形成膨大体，以及第二阶段培养以形成愈伤组织；所述第一阶段和第二阶段培养的温度均为25～28℃，湿度均为50～65％；所述第一阶段培养的天数为28～32d；所述第二阶段培养的天数为38～42d；
优选地，第一阶段的培养基包含412.5mg/L硝酸铵、475mg/L硝酸钾、110mg/L氯化钙、92.5mg/L硫酸镁、42.5mg/L二氢磷酸钾、0.415mg/L碘化钾、3.1mg/L硼酸、11.15mg/L硫酸锰、4.3mg/L硫酸锌、0.125mg/L钼酸钠、0.0125mg/L硫酸铜、0.0125mg/L氯化钴、13.9mg/L硫酸亚铁、18.65mg/L EDTA二钠、1～5mg/L肌醇、0.5～3mg/L烟酸、0.5～2盐酸吡哆醇、3～6mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、50mg/L精氨酸、100mg/L天冬氨酸、150mg/L谷氨酸、1.0～3.0mg/L 6-BA、0.08～0.12mg/L植物生长调节剂TDZ、0.1～0.3mg/Lα-萘乙酸、0.03～0.07mg/L 2,4-D、25～35g/L蔗糖和5～10g/L琼脂粉；
第二阶段的培养基包含825mg/L硝酸铵、950mg/L硝酸钾、220mg/L氯化钙、185mg/L硫酸镁、85mg/L二氢磷酸钾、0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L硫酸铜、0.025mg/L氯化钴、27.8mg/L硫酸亚铁、37.3mg/L EDTA二钠、1～5mg/L肌醇、0.5～3mg/L烟酸、0.5～2盐酸吡哆醇、3～6mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L精氨酸、50mg/L天冬氨酸、200mg/L谷氨酸、2.0～4.0mg/L 6-BA、0.4～0.6mg/L IBA、25～35g/L蔗糖、200～500g/l的水解酪蛋白和5～10g/L琼脂粉。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述继代培养的培养基包含1650mg/L硝酸铵、1900mg/L硝酸钾、440mg/L氯化钙、370mg/L硫酸镁、170mg/L二氢磷酸钾、0.83mg/L碘化钾、6.2mg/L硼酸、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L硫酸铜、0.025mg/L氯化钴、27.8mg/L硫酸亚铁、37.3mg/L EDTA二钠、1～5mg/L肌醇、0.5～3mg/L烟酸、0.5～2盐酸吡哆醇、3～6mg/L盐酸硫胺素、2.0mg/L甘氨酸、1.0～3.0mg/L 6-BA、0.9～1.1mg/L玉米素、0.2～0.4mg/L吲哚乙酸、40～60mg维生素C、20～30g/L蔗糖和5～10g/L琼脂粉；
优选地，所述继代培养在1500～2000Lx的强度光照下进行，所述光照的时间为10～15h/d，温度为25～28℃，湿度为50～65％，培养的天数为38～42d。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，形成从生芽的诱导培养所采用的诱导培养基包含MS培养基、0.05～0.1mg/L 6-BA、1～2mg/L吲哚丁酸、0.5～1mg/Lα-萘乙酸、25～35g/L蔗糖、25～35g/L香蕉和5～10g/L琼脂粉；
优选地，形成从生芽的诱导培养在1500～2000Lx的强度光照下进行，所述光照的时间为10～15h/d，温度为25～28℃，湿度均为50～65％，培养的天数为30～60d。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养的培养基包含MS培养基、0.05～0.1mg/Lα-萘乙酸、0.01～0.05mg/L吲哚乙酸、25～35g/L蔗糖、30～50g/L土豆泥和5～10g/L琼脂粉；
优选地，所述生根培养在1500～2000Lx的强度光照下进行，所述光照的时间为12～16h/d，温度为25～28℃，湿度为50～65％；所述生根培养的天数为55～65d。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述栽培包括以下步骤：
(61)将所述绿萝根苗进行炼苗；
(62)将经所述炼苗的绿萝根苗进行移栽；
(63)对所述移栽的绿萝根苗进行田间管理以使其生长。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述炼苗在1500～2000Lx的强度光照下进行，所述光照的时间为10～15h/d，温度为25～28℃，湿度均为50～65％，所述炼苗的天数为12～16d。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述移栽所采用的基质包含质量比为1：2～4的珍珠岩和椰糠。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述炼苗之后且在移栽之前还包括使用多菌灵可湿性粉剂的稀释液进行消毒。
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Denomination of invention: A Method of Using Top Bud Culture for Green Pineapple

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Pledgee: Dongfang Rural Credit Cooperative Association

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