CN106574288A - 用于无细胞转录和翻译的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

用于无细胞蛋白质合成的方法，方法包括在反应混合物中合成感兴趣的RNA或蛋白质，所述反应混合物包括：编码感兴趣的RNA或蛋白质的模板DNA；和已经被基因修饰以表达异源性RNA聚合酶的蛋白酶‑缺陷细菌细胞的生物提取物，提取物进一步包括对蛋白质的转录和翻译必需的组分。还提供了用于生成用于无细胞蛋白质合成的反应混合物的方法和用于执行这些方法的试剂盒。

Description

用于无细胞转录和翻译的方法和试剂盒

发明领域和背景

本发明，在其一些实施方式中，涉及用于无细胞转录和翻译的方法和试剂盒。

蛋白质具有重大的工业和治疗重要性。细菌保留用于将遗传密码转录和翻译为功能性蛋白的最高效的系统。更先进的平台基于如下纳米颗粒：其包含无细胞提取物并且可以被远程地触发以在患病的器官内合成治疗性蛋白¹。

对用于研究和治疗应用的无细胞蛋白质生成过程存在不断增长的需要²。应用包括蛋白质-蛋白质相互作用的研究、研发工业酶、或调查新药机制³。此外，由于许多治疗性蛋白是有毒的或不能在细胞内适当地折叠的事实，所以它们需要无细胞系统⁴。

如提及的，至今，大多数蛋白质使用由细菌、植物或哺乳动物细胞制备的细胞提取物产生⁵。最常用的细胞提取物是‘大肠杆菌S30’，其由Nirenberg和Matthaei⁶最初研发并且然后由Zoubay⁷和Pratt⁸标准化。首字母缩略词S30代表从非必要的重的细胞组分分离转录/翻译装置(machinery)的30,000g离心步骤⁵。S30提取物可以以其粗制形式——补充有必需氨基酸、转录因子和盐——使用⁹，或者以纯化装置的形式使用，所述纯化装置以精确的摩尔比与所有必需的蛋白质-生成组分重构^9，10。这些方法分别由Promega和New EnglandBiolabs(NEB)Inc.许可。

现有的方法是冗长的并且需要昂贵的工具(比如30g离心机)和试剂。

额外的背景技术包括：

1 Schroeder,A.等Remotely-activated protein-producingnanoparticles.Nano Lett,doi:10.1021/nl2036047(2012).

2 Carlson,E.D.,Gan,R.,Hodgman,C.E.&Jewett,M.C.Cell-free proteinsynthesis:Applications come of age.Biotechnol.Adv.30,1185-1194,doi:http://dx(dot)doi(dot)org/10.1016/j.biotechadv.2011.09.016(2012).

3 Whittaker,J.Cell-free protein synthesis:The state of theart.Biotechnol.Lett.35,143-152,doi:10.1007/s 10529-012-1075-4(2013).

4 Bernhard,F.&Tozawa,Y.Cell-free expression-making amark.Curr.Opin.Struct.Biol.23,374-380,doi:http://dx(dot)doi(dot)org/10.1016/j.sbi.2013.03.012(2013).

5 Spirin,A.S.&Swartz,J.R.in Cell-Free Protein Synthesis 1-34(Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA,2008).

6 Nirenberg,M.W.in Methods Enzymol.Vol.Volume 6 17-23(Academic Press,1963).

7 Zubay,G.In Vitro Synthesis of Protein in MicrobialSystems.Annu.Rev.Genet.7,267-287,doi:doi:10.1146/annurev.ge.07.120173.001411(1973).

8 Nevin,D.E.&Pratt,J.M.A coupled in vitro transcription-translationsystem for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from theT7promoter.FEBS Lett.291,259-263,doi:http://dx(dot)doi(dot)org/10.1016/0014-5793(91)81297-L(1991).

9 Pratt,J.M.in Transcription and Translation a practical approach(edsB.D.Hames&S.J.Higgins)Ch.7,179-209(IRL Press 1984).

10 Shimizu,Y.等Cell-free translation reconstituted with purifiedcomponents.Nat.Biotechnol.19,751-755,doi:http://www(dot)nature(dot)corn/nbt/journal/v19/n8/suppinfo/nbt0801_751_S 1(dot)html(2001).

11 Sunami,T.等Femtoliter compartment in liposomes for in vitroselection of proteins.Analytical Biochemistry 357,128-136(2006).

12 LB(Luria-Bertani)liquid medium.Cold Spring Harbor Protocols 2006(2006).

13 Terrific Broth.Cold Spring Harbor Protocols 2006,pdb.rec8620(2006).

14 Ivanir 2009"Development of an efficient cell-free translationsystem"Research Thesis.

发明内容

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于无细胞RNA或蛋白质合成的方法，方法包括在反应混合物中合成感兴趣的RNA或蛋白质，所述反应混合物包括：

编码感兴趣的RNA或蛋白质的模板DNA；和

已经被基因修饰以表达异源性RNA聚合酶的蛋白酶-缺陷细菌细胞的生物提取物，提取物进一步包括对蛋白质的转录和翻译必需的组分。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了生成用于无细胞蛋白质合成的反应混合物的方法，方法包括：

(a)使已经被基因修饰以表达异源性RNA聚合酶的蛋白酶-缺陷细菌细胞的培养物在允许RNA聚合酶的表达的条件下生长；

(b)使蛋白酶-缺陷细菌细胞破裂以获得包括基因组DNA和破碎的细胞的细胞制剂；破裂在保持对蛋白质的转录和翻译必需的组分的功能性的条件下；

(c)去除基因组DNA；和

(d)在去除之后冷冻细胞制剂。

根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括在脂囊泡中封装细胞制剂。

根据本发明的一些实施方式，由质粒表达RNA聚合酶。

根据本发明的一些实施方式，使用压力均质器进行破裂。

根据本发明的一些实施方式，方法不包括在破裂之后透析细胞制剂。

根据本发明的一些实施方式，方法不包括在步骤(a)之后和在步骤(b)之前冷冻和解冻细菌细胞。

根据本发明的一些实施方式，方法不包括向细胞制剂添加蛋白酶抑制剂。

根据本发明的一些实施方式，去除包括在低于30,000×g下离心。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了组合物，其包括已经被基因修饰以表达异源性RNA聚合酶的蛋白酶-缺陷细菌细胞的提取物，提取物包括对转录和翻译必需的组分并且不含基因组DNA。

根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于无细胞RNA或蛋白质合成的试剂盒，其包括已经被基因修饰以表达异源性RNA聚合酶的蛋白酶-缺陷细菌细胞的提取物，提取物包括对转录和翻译必需的组分。

根据本发明的一些实施方式，试剂盒进一步包括如下中的至少一个：

(i)预成形为或能够形成脂囊泡的脂质；

(ii)对照DNA模板；

(iii)氨基酸；

(iv)rNTP；

(v)H₂O；

(vi)盐；和

(vii)ATP-再生系统。

根据本发明的一些实施方式，提取物包括编码RNA聚合酶的质粒。

根据本发明的一些实施方式，对照DNA模板与提取物单独地包装。

根据本发明的一些实施方式，(i)-(vii)中的每个单独地包装。

根据本发明的一些实施方式，(i)-(vii)中的至少两个单独地包装。

根据本发明的一些实施方式，对转录和翻译必需的组分选自tRNA、核糖体和转录因子。

根据本发明的一些实施方式，生物提取物以20-40％(v/v)的浓度存在于反应混合物。

根据本发明的一些实施方式，生物提取物以30％(v/v)的浓度存在于反应混合物。

根据本发明的一些实施方式，反应混合物进一步包括氨基酸、rNTP、H₂O、盐和ATP-再生系统。

根据本发明的一些实施方式，反应混合物包括聚乙二醇。

根据本发明的一些实施方式，模板DNA是环状DNA。

根据本发明的一些实施方式，模板DNA包括可操作地连接至编码RNA或蛋白质的核酸序列的RNA聚合酶的启动子。

根据本发明的一些实施方式，RNA聚合酶是依赖于DNA的RNA聚合酶。

根据本发明的一些实施方式，依赖于DNA的RNA聚合酶是噬菌体RNA聚合酶。

根据本发明的一些实施方式，噬菌体RNA聚合酶是T7或SP6RNA聚合酶。

根据本发明的一些实施方式，由pAR1219编码T7。

根据本发明的一些实施方式，盐选自钾、镁和铵。

根据本发明的一些实施方式，反应混合物包括10-20mM镁盐、40-60mM钾盐和100-200nM铵盐。

根据本发明的一些实施方式，反应混合物如表2中列举的。

根据本发明的一些实施方式，合成以分批、连续流动、或半连续流动作用。

根据本发明的一些实施方式，蛋白酶-缺陷细菌细胞选自BL21(DE3)、BL21(DE3)CodonPlus RIL和其变体。

根据本发明的一些实施方式，蛋白质是膜蛋白。

根据本发明的一些实施方式，RNA是沉默剂。

根据本发明的一些实施方式，脂囊泡包括脂质体。

除非另外限定，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员一般理解的相同的含义。虽然类似于或等价于本文描述的方法和材料的那些可以用于本发明的实施方式的实践和测试，但是下面描述了示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，以包括定义的专利说明书为准。此外，材料、方法和实例仅仅是说明性的并且不意欲必然是限制性的。

附图说明

图1是比较根据本发明的一些实施方式的裂解物制剂与由Pratt,J.M.在Transcription and Translation a practical approach(eds B.D.Hames&S.J.Higgins)Ch.7,179-209(TRL Press 1984)教导的现有技术的裂解物制剂的方案。

图2是描述根据本发明的一些实施方式的制造用于无细胞蛋白质生成的有效的(potent)细菌裂解物的过程的方案，在下文在之后的实施例部分中进一步详细描述。其旨在描述本发明的一般实施方式。

图3是比较本发明的一些实施方式的蛋白质生成系统与商购系统(Promega)的条形图。在90min的培育后，通过两种系统生成海肾(Renilla)荧光素酶，与现有技术相比，产量的两倍增加在本方法中是明显的。

图4是显示根据本发明的一些实施方式的本系统在sfGFP合成中在不同温度的热稳定性的条形图。

图5是显示当根据本发明的一些实施方式封装时，提取物在蛋白质sfGFP合成中的活性的条形图。蛋白质生成在多种粒径中是明显的。

图6是显示根据本发明的一些实施方式的无细胞系统中的sfGFP生成动力学的图表。

图7A-C显示了sfGFP在无细胞和在颗粒中的生成。图7A-GFP在本无细胞系统中的生成；图7B-GFP在DMPC:胆固醇颗粒中的生成；图7C-sfGFP在DMPC:胆固醇颗粒中的生成(左图-时间零点；右图-10min之后)。

图8显示了使用根据本发明的一些实施方式的本无细胞系统的来自巨大芽孢杆菌的酪氨酸酶的生成。使用Tecan infinite pro200分光光度计在475nm的吸光度下完成可视化。

图9是通过放射自显影可视的SDS-PAGE。图像显示了p50(NF-Kβ亚基)在根据本发明的一些实施方式的无细胞系统中的生成。

图10A是使用本无细胞系统的假单胞菌外毒素(PE)的无细胞生成的蛋白质印迹分析。抗PE抗体被用作一次抗体。没有DNA的细胞-反应被用作阴性对照。纯化的蛋白质被用作额外的对照(纯化的PE和BL21)。

图10B显示了根据本发明的一些实施方式生成的假单胞菌外毒素A(PE)对4T1细胞(小鼠乳腺癌模型)的毒性作用。当施加如下四种处理时：(1)以1:20反应混合物:生长培养基比率添加无细胞反应混合物；(2)以1:5反应混合物:生长培养基比率添加无细胞反应混合物；(3)以1:20颗粒:生长培养基比率添加包含纯化的蛋白质(PE/BL21)的颗粒；(4)以1:5颗粒:生长培养基比率添加包含纯化的蛋白质(PE/BL21)的颗粒，通过MTT检验测定细胞的成活力。

图11A显示了通过具有NaCl梯度(0-0.5M)的阴离子交换柱纯化来自大肠杆菌BL21(DE3)的假单胞菌外毒素A(PE)持续10min。

图11B显示了假单胞菌外毒素A(PE)对4T1和B16细胞的治疗效力。通过MTT检验测定细胞的成活力。

具体实施方式

本发明，在其一些实施方式中，涉及用于无细胞RNA或蛋白质合成的方法和试剂盒。

在详细地说明本发明的至少一个实施方式前，应当理解本发明不必然地将其应用限制于在下列描述中陈述或通过实施例示例的细节。本发明具有其它实施方式或能够以多种方式实践或实施。

本文描述的发明涉及用于制备比商购的无细胞提取物更有效和稳定的无细胞蛋白质生成混合物的短时间的、简单的和划算的过程。

表1：在Zubay等和Pratt(上文)的文献中描述的经典的方案——两种商购的系统(NEB，Promega)——与新发明的过程之间的成本比较。

因而，根据本发明的一个方面，提供了用于无细胞RNA或蛋白质合成的方法，方法包括在反应混合物中合成感兴趣的RNA或蛋白质，所述反应混合物包括：

编码感兴趣的RNA或蛋白质的模板DNA；和

已经被基因修饰以表达异源性RNA聚合酶的蛋白酶-缺陷细菌细胞的生物提取物，提取物进一步包括对蛋白质的转录和翻译必需的组分。

如本文使用的，“蛋白酶-缺陷细菌细胞”指的是至少一种蛋白酶被下调并且从而允许重组蛋白的积聚的细菌。可以根据本发明的一些实施方式被下调(敲除)的蛋白酶的实例包括但不限于Lon和OmpT、hflA、rpoH、tsp。

当将要表达的基因已经被克隆入包含合适的原核调控序列——比如启动子和核糖体结合位点——的载体时，使用细菌细胞。原核大肠杆菌无细胞系统被认为是“偶联的”，这是因为在向提取物添加DNA后，转录和翻译同时发生。

使用本领域熟知的方法或通过筛选其中蛋白酶水平被减小低于预定阈值的细菌细胞完成敲落细菌细胞中的基因表达。基因组编辑是细菌细胞工程的重要技术，其一般通过基于同源重组的程序实施，包括基因敲除(破坏(disruption))和等位交换。此外，不依赖于重组的方法已经出现，其利用催化性RNA、人工核酸酶、核酸类似物、和肽核酸。除直接地修饰基因组结构的这些方法之外，可选的方法是以转录后水平条件性地修饰基因表达概况而不改变基因组。这通过表达反义RNA以在体内特异性地敲落(沉默)靶mRNA进行。利用人工/RNA引导/嵌合核酸酶比如CRISPR/Cas、TALEN和ZFN的基因组编辑技术的使用在本文也被考虑。在Nakashima和Miyazaki 2014Int.J.Mol.Sci.2014 15:2773-2793中综述了敲落细菌细胞中的基因表达的方法。

可以依据本教导使用的细菌细胞的实例包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)和大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

可以连同本教导使用的细菌菌株的实例包括但不限于BL21(DE3)(Novagen)、CodonPlusRIL、BL21-SI(Invitrogen)和其变体。

下列是可以连同本发明的教导使用的细菌菌株的列表。

必要时，细菌菌株可以被转化以表达异源性RNA聚合酶并且被进一步修饰为蛋白酶-缺陷细菌。

如本文使用的，“异源性RNA聚合酶”指的是不在蛋白酶缺陷细菌细胞中天然地表达，或在细菌细胞中以降低的水平表达的RNA聚合酶。

根据本发明的实施方式，RNA聚合酶是依赖于RNA的RNA聚合酶。在这样的情况下，模板不是DNA模板而是RNA模板。

根据本发明的实施方式，RNA聚合酶是依赖于DNA的RNA聚合酶。

根据本发明的实施方式，依赖于DNA的RNA聚合酶是噬菌体RNA聚合酶。

根据本发明的实施方式，噬菌体RNA聚合酶是T7或SP6RNA聚合酶。

根据本发明的实施方式，由pAR1219编码T7。

可以连同本教导使用的RNA聚合酶的实例包括但不限于SP6、T7和T3RNA聚合酶。根据具体的实施方式，RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。根据模板DNA中的转录控制选择聚合酶(或反之亦然)。包含SP6、T7和T3RNA聚合酶启动子的大量载体是商购的并且广泛地用于克隆DNA。

根据本发明的实施方式，蛋白酶-缺陷细菌细胞选自BL21(DE3)、CodonPlus RIL和其变体。通常，在掺入PAR 1219质粒后，这些细胞被修饰以在诱导型启动子——例如，lacUV5启动子(通过添加IPTG可诱导的)——的控制下诱导性地表达T7RNA聚合酶，通过由染色体表达的T7RNA聚合酶，以过量(过表达)生成T7RNA聚合酶。

根据具体的实施方式，蛋白酶缺陷细菌细胞也是RNase缺陷的。

表2-可以连同本教导使用的或可以被用作另外的操纵(例如，如本文描述的，异源性RNA聚合酶的表达或敲落蛋白酶)的基础的细菌细胞的实例

根据本发明的实施方式，如下生成已经被基因修饰以表达异源性RNA聚合酶的蛋白酶-缺陷细菌细胞的生物提取物。

(a)使已经被基因修饰以表达异源性RNA聚合酶的蛋白酶-缺陷细菌细胞的培养物在允许RNA聚合酶的表达的条件下生长；

(b)使蛋白酶-缺陷细菌细胞破裂以获得包括基因组DNA和破碎的细胞的细胞制剂；破裂在保持对蛋白质的转录和翻译必需的组分的功能性的条件下；

(c)去除基因组DNA。在此阶段，还去除其它细胞碎片(例如，膜)；和

(d)在去除之后冷冻细胞制剂。

因而，细菌细胞被转化以表达异源性RNA聚合酶。聚合酶的表达通常以诱导表达方式比如通过使用IPTG(例如，在OD₆₀₀≥1处)实现。其它表达诱导模式也是本领域已知的，例如，盐诱导、四环素、阿拉伯糖和茶碱。

一旦培养物达到预定的光密度(OD)(例如，OD₆₀₀≥5，例如，4-5)，例如通过离心收获细胞并且通常清洗以去除细胞碎片。根据具体的实施方式，采用两个清洗步骤(参见图1)。

细胞诱导的光密度和收获取决于用于培养的培养基，并且其在技术人员确定细胞诱导的光密度和收获的能力内。

根据具体的实施方式，使用均质器实现破裂。根据具体的实施方式，使用弗式压碎器实现破裂。

基因组DNA的去除通常通过离心实现，虽然其它方法也考虑。根据具体的实施方式，离心在13,000-20,000g或更小下作用。根据具体的实施方式，离心作用进行一次。

根据具体的实施方式，方法不包括在破裂之后透析细胞制剂，其显著地最小化生成时间。

根据额外的或可选的实施方式，方法不包括在步骤(a)之后和在步骤(b)之前冷冻和解冻细菌细胞。

根据具体的实施方式，方法不包括向细胞制剂添加蛋白酶抑制剂。因此，根据具体的实施方式，提取物不包括外来添加的蛋白酶抑制剂。

制剂可以新鲜地使用或在冷冻——通常在-20℃或-80℃下——后使用。

图1中提供了本发明的生成细菌提取物的方法的示例性实施方式。

如提及的，本教导涉及RNA和蛋白质的偶联生成。但是，在某些实施方式中，可以表达非编码RNA。术语“蛋白质”或“感兴趣的蛋白质”指的是具有多于大约5个氨基酸的肽或多肽。蛋白质可以同源于，或异源于——即，外源于——细菌无细胞提取物源自其的细菌，比如在细菌无细胞提取物中生成的人蛋白、病毒蛋白、酵母蛋白、昆虫蛋白、细菌蛋白等。

根据具体的实施方式，蛋白质是膜蛋白、分泌蛋白或细胞内蛋白。

蛋白质的异源性生成广泛地用于研究和工业环境，例如，用于治疗试剂、疫苗、诊断试剂、生物燃料的生成，和许多其它感兴趣的应用。

可以根据本教导合成的示例性酶种类包括但不限于：EC1(氧化还原酶)、EC2(转移酶)、EC3(水解酶)、EC4(裂解酶)、EC5(异构酶)和EC6(连接酶)。

额外的感兴趣的蛋白质包括但不限于抗体、溶酶体酶、蛋白水解酶、脂肪酶、毒素。

通过本教导生成的蛋白质或肽包括但不限于细胞因子、趋化因子、淋巴因子、配体、受体、激素、酶、抗体和抗体片段、和生长因子。受体的非限制性实例包括TNF I型受体、IL-1受体II型、IL-1受体拮抗剂、IL-4受体和任何化学或遗传修饰的可溶性受体。酶的实例包括乙酰胆碱酯酶、乳糖酶、活化蛋白C、因子VII、胶原酶(例如，由Advance BiofacturesCorporation以名称Santyl销售)；半乳糖苷酶(agalsidase)-β(例如，由Genzyme以名称Fabrazyme销售)；链道酶-α(例如，由Genentech以名称Pulmozyme销售)；组织纤维蛋白溶原酶激活剂(例如，由Genentech以名称Activase销售)；聚乙二醇化的天冬酰胺酶(例如，由Enzon以名称Oncaspar销售)；天冬酰胺酶(例如，由Merck以名称Elspar销售)；和伊米苷酶(imiglucerase)(例如，由Genzyme以名称Ceredase销售)。具体的多肽或蛋白质的实例包括但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，集落刺激因子(CSF)，干扰素β(IFN-β)，干扰素γ(IFNγ)，干扰素γ诱导因子I(IGIF)，转化生长因子β(IGF-β)，RANTES(活化后调节表达和可能分泌的正常T细胞)，巨噬细胞炎性蛋白(例如，MIP-1-α和MIP-1-β)，Leishmnania延伸起始因子(elongation initiating factor)(LEIF)，血小板源性生长因子(PDGF)，肿瘤坏死因子(TNF)，生长因子——例如，表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子、(FGF)、神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子(neurotrophin)-2(NT-2)，神经营养因子-3(NT-3)，神经营养因子-4(NT-4)，神经营养因子-5(NT-5)，胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)，纤毛神经营养因子(CNTF)，TNFαII型受体，促红细胞生成素(EPO)，胰岛素和可溶性糖蛋白——例如，gp120和gp160糖蛋白。gp120糖蛋白是人免疫缺陷病毒(WIV)包膜蛋白质，并且gp160糖蛋白是gp120糖蛋白的已知的前体。其它实例包括肠促胰液素、奈西立肽(nesiritide)(人B型利尿钠肽(hBNP))和GYP-I。

其它产品可以包括GPCR，其包括但不限于A类视紫红质样受体比如毒蕈碱性(muscatinic)(Muse.)乙酰胆碱脊椎动物1型、毒蕈碱性乙酰胆碱脊椎动物2型、毒蕈碱性乙酰胆碱脊椎动物3型、毒蕈碱性乙酰胆碱脊椎动物4型；肾上腺素受体(Α肾上腺素受体1型、Α肾上腺素受体2型、Β肾上腺素受体1型、Β肾上腺素受体2型、Β肾上腺素受体3型)，多巴胺脊椎动物1型，多巴胺脊椎动物2型，多巴胺脊椎动物3型，多巴胺脊椎动物4型，组胺1型，组胺2型，组胺3型，组胺4型，5-羟色胺1型，5-羟色胺2型，5-羟色胺3型，5-羟色胺4型，5-羟色胺5型，5-羟色胺6型，5-羟色胺7型，5-羟色胺8型，其它5-羟色胺类型，痕量胺(traceamine)，血管紧张肽1型，血管紧张肽2型，铃蟾肽，缓激肽(bradykffin)，C5a过敏毒素，Finet-leu-phe，APJ样，白介素-8A型，白介素-8B型，白介素-8其它类型，C-C趋化因子1型到11型和其它类型，C--X--C趋化因子(2到6型等)，C-X3-C趋化因子，缩胆囊素CCK，CCK A型，CCK B型，其它CCK，内皮素，黑皮质素(促黑素细胞激素、促肾上腺皮质激素、黑皮质素激素)，Duffy抗原，催乳素-释放肽(GPR10)，神经肽Y(1到7型)，神经肽Y，其它神经肽Y，神经降压肽，阿片样物质(D、K、M、X型)，促生长素抑制素(1到5型)，速激肽(P物质(NK1)、K物质(NK2))，神经调节肽K(NK3)，速激肽样1，速激肽样2，血管升压素/加压催产素(1到2型)，加压催产素，催产素/鸟催产素，Conopressin，甘丙肽样，蛋白酶-活化样，食欲肽&神经肽FF，QRFP，趋化因子受体-样，神经调节肽U样(神经调节肽U，PRX酰胺)，激素蛋白(促卵泡激素、促黄体素-绒毛膜促性腺激素(choriogonadotropic hormone)、促甲状腺素、促性腺激素I型、促性腺激素II型)，视紫红质((rhod)opsin)，视紫红质脊椎动物(1-5型)，视紫红质脊椎动物5型，视紫红质节肢动物，视紫红质节肢动物1型，视紫红质节肢动物2型，视紫红质节肢动物3型，视紫红质软体动物，视紫红质，嗅感受器(olfactory)(嗅感受器11，1到13家族)，前列腺素(前列腺素E2 EP 1亚型、前列腺素E2/D2 EP2亚型、前列腺素E2 EP3亚型、前列腺素E2 EP4亚型、前列腺素F2-α、环前列腺素)，血栓烷，腺苷1到3型，嘌呤受体，嘌呤受体P2RY1-4,6,11 GPR91，嘌呤受体P2RY5,8,9,10 GPR35,92,174，嘌呤受体P2RY12-14 GPR87(JDP-葡萄糖)，大麻素，血小板活化因子，促性腺激素-释放激素，促性腺激素-释放激素I型，促性腺激素-释放激素II型，激脂激素样，黑化诱导激素(corazonin)，促甲状腺素-释放激素&促分泌素，促甲状腺素-释放激素，生长激素促分泌素，生长激素促分泌素样，蜕皮引发激素(ETHR)，褪黑素，溶性鞘脂(lysosphingolipid)&LPA(EDG)，1-磷酸鞘氨醇Edg-1，溶血磷脂酸Edg-2，1-磷酸鞘氨醇Edg-3，溶血磷脂酸Edg4，鞘氨醇1-磷酸Edg-5，1-磷酸鞘氨醇Edg-6，溶血磷脂酸Edg-7，1-磷酸鞘氨醇Edg-8，Edg其它白三烯B4受体，白三烯B4受体BLT1，白三烯B4受体BLT2，A类孤独受体(orphan)/其它，推定的神经递质，SREB，Mas原癌基因&Mas相关基因(Mas-related)(MRG)，GPR45样，半胱氨酰白三烯，G-蛋白偶联胆汁酸受体，游离脂肪酸受体(GP40、GP41、GP43)，B类肠促胰液素样，降钙素，促肾上腺皮质激素释放因子，肠抑胃肽，胰高血糖素，生长激素-释放激素，甲状旁腺激素，PACAP，肠促胰液素，血管活性肠肽，蛛毒素受体(latrophilin)，蛛毒素受体1型，蛛毒素受体2型，蛛毒素受体3型，ETL受体，脑特异性血管生成抑制因子(BAI)，Methuselah样蛋白(MTH)，钙黏着蛋白EGF LAG(CELSR)，非常大的G-蛋白偶联受体，C类代谢型谷氨酸受体(glutamate)/信息素，代谢型谷氨酸受体I到III组，钙敏感受体(calcium-sensing)样，细胞外钙敏感受体，信息素，其它钙敏感受体样，推定的信息素受体，GABA-B，GABA-B 1亚型，GABA-B 2亚型，GABA-B样，孤独受体GPRC5，孤独受体GPCR6，无七的新娘(Bride of sevenless)蛋白(BOSS)，味觉感受器(TiR)，D类真菌信息素，真菌信息素A-因子样(STE2、STE3)，真菌信息素B样(BAR、BBR、RCB、PRA)，E类cAMP受体，眼白化蛋白，Frizzled/smoothened家族，frizzled A组(Fz 1&2&4&5&7-9)，frizzledB组(Fz 3&6)，fizzled C组(其它)，犁鼻受体，线虫化学受体，昆虫气味感受器，和Z类古细菌/细菌/真菌视蛋白。

还可以通过本发明生成生物活性肽。实例包括：BOTOX、肉毒杆菌素(Myobloc)、肉毒毒素制剂(Neurobloc)、丽舒妥(Dysport)(或肉毒杆菌神经毒素的其它血清型)、重组阿葡糖苷酶α(alglucosidase alfa)、达托霉素、YH-16、绒毛膜促性腺激素α、非格司亭、西曲瑞克、白介素-2、阿地白介素、替西白介素(teceleulin)、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)、干扰素α-n3(注射)、干扰素α-nl、DL-8234、干扰素、Suntory(γ-1a)、干扰素γ、胸腺素α1、他索纳明(tasonermin)、DigiFab、ViperaTAb、EchiTAb、CroFab、奈西立肽、阿巴西普(abatacept)、阿法赛特(alefacept)、利比(Rebif)、阿法艾托特明(eptoterminalfa)、特立帕肽(骨质疏松)、可注射的降钙素(骨病)、降钙素(鼻部，骨质疏松)、依那西普(etanercept)、谷他血红蛋白(hemoglobin glutamer)250(牛)、drotrecoginalfa、胶原酶、卡培立肽、重组人表皮生长因子(外用凝胶，伤口愈合)、DWP401、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)、加马依泊汀、倍他艾泊汀、阿法依泊汀、地西卢定、来匹卢定(lepirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、诺那凝血素α(nonacog alpha)、凝血因子Ⅸ粉针剂(Mononine)、依他凝血素α(eptacog alfa)(活化的)、重组因子VIII+VWF、浓缩的重组抗血友病因子(Recombinate)、重组因子VIII、因子VIII(重组)、Alphnmate、辛凝血素α(octocogalfa)、因子VIII、帕利夫明(palifermin)、Indikinase、替奈普酶(tenecteplase)、组织纤维蛋白溶原酶激活剂、帕米普酶(pamiteplase)、瑞替普酶、那替普酶(nateplase)、孟替普酶(monteplase)、促卵泡素α、rFSH、hpFSH、米卡芬净(micafungin)、聚乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim)、来格司亭、那托司亭、舍莫瑞林、胰高血糖素、艾塞那肽(exenatide)、普兰林肽(pramlintide)、iniglucerase、加硫酶(galsulfase)、Leucotropin、molgramostirn、醋酸曲普瑞林、组氨瑞林(皮下植入物，聚甲基丙烯酸酯还原染料)、地洛瑞林、组氨瑞林、那法瑞林、亮丙瑞林缓释长效药物(depot)(ATRIGEL)、亮丙瑞林植入物(DUROS)、戈舍瑞林、生长激素、尤得盼(Eutropin)、KP-102程序、生长激素、生长激素、美卡舍明(生长障碍)、enlfavirtide、Org-33408、甘精胰岛素、赖谷胰岛素、胰岛素(吸入)、赖脯胰岛素、地特胰岛素、胰岛素(含服，RapidMist)、美卡舍明-林菲培(rinfabate)、阿那白滞素(anakinra)、西莫白介素、阿西肽锝[99mTc](99mTc-apcitide)注射剂、myelopid、重组干扰素β-1b(Βetaseron)、醋酸格拉替雷(glatiramer acetate)、Gepon、沙格司亭、奥普瑞白介素(oprelvekin)、人白细胞源性α干扰素、倍尔来福(Bilive)、胰岛素(重组)、重组人胰岛素、天冬胰岛素、mecasenin、罗飞龙(Roferon)-A、干扰素-α2、Αlfaferone、复合α干扰素(interferon alfacon-1)、干扰素α、Avonex的重组人促黄体素、链道酶α、曲弗明(trafermin)、齐考诺肽(ziconotide)、他替瑞林(taltirelin)、地波特明α(diboterminalfa)、阿托西班、贝卡普勒明(becaplermin)、依替巴肽(eptifibatide)、Zemaira、CTC-111、Shanvac-B、HPV疫苗(四价)、奥曲肽、兰瑞肽、ancestirn、半乳糖苷酶β、半乳糖苷酶α、拉罗尼酶(laronidase)、醋肽酮(外用凝胶)、拉布立酶(rasburicase)、雷珠单抗(ranibizumab)、干扰素γ-1b(Actimmune)、佩乐能(PEG-Intron)、采尼(Tricomin)、重组屋尘螨变态反应脱敏注射剂、重组人甲状旁腺激素(PTH)1-84(sc，骨质疏松)、红细胞生成素(epoetin delta)、转基因抗凝血酶III、人重组生长因子(Granditropin)、透明质酸酶(Vitrase)、重组胰岛素、干扰素-α(口服锭剂)、GEM-21S、伐普肽、艾度硫酸酯酶(idursulfase)、奥马曲拉(omnapatrilat)、重组血清白蛋白、赛妥珠单抗(certolizumabpegol)、羧肽酶(glucarpidase)、人重组CI酯酶抑制剂(血管性水肿)、拉诺替普酶(lanoteplase)、重组人生长激素、恩夫韦地(enfuvirtide)(无针注射，Biojector 2000)、VGV-1、干扰素(α)、lucinactant、阿肽地尔(aviptadil)(吸入，肺病)、艾替班特、艾卡拉肽(ecallantide)、奥米加南(omiganan)、Aurograb、醋酸培西加南(pexigananacetate)、ADI-PEG-20、LDI-200、地加瑞克(degarelix)、cintredelinbesudotox、Favld、MDX-1379、ISAtx-247、利拉鲁肽(liraglutide)、特立帕肽(骨质疏松)、替法可近(tifacogin)、AA4500、T4N5脂质体洗剂、卡妥索单抗(catumaxomab)、DWP413、ART-123、Chrysalin、去氨普酶(desmoteplase)、安地普酶(amediplase)、绒促卵泡素α(corifollitropinalpha)、TH-9507、替度鲁肽(teduglutide)、Diamyd、DWP-412、生长激素(缓释注射)、重组G-CSF、胰岛素(吸入，AIR)、胰岛素(吸入，Technosphere)、胰岛素(吸入，AERx)、RGN-303、DiaPep277、干扰素β(丙型肝炎病毒感染(HCV))、干扰素α-n3(口服)、贝拉西普(belatacept)、经皮胰岛素贴片、AMG-531、MBP-8298、Xerecept、奥培巴康(opebacan)、AIDSVAX、GV-1001、LymphoScan、豹蛙酶(ranpirnase)、Lipoxysan、卢舒普肽(lusupultide)、MP52(β-磷酸三钙载体，骨再生)、黑素瘤疫苗、sipuleucel-T、CTP-37、Insegia、vitespen、人凝血酶(冷冻的，手术出血)、凝血酶、TransMID、蛇毒纤溶酶(alfimeprase)、普瑞凯希(Puricase)、特利加压素(静脉内，肝肾综合征)、EUR-1008M、重组FGF-I(可注射的，血管疾病)、BDM-E、缝隙连接调节剂(rotigaptide)、ETC-216、P-113、MBI-594AN、耐久霉素(吸入，囊性纤维化)、SCV-07、OPI-45、内皮生长抑素、血管生长抑素、ABT-510、鲍曼-伯克抑制剂浓缩剂(Bowman BirkInhibitor Concentrate)、XMP-629、99mTc-Hynic-膜联蛋白V、kahalalide F、CTCE-9908、替维瑞克(teverelix)(延长释放)、ozarelix、罗咪酯肽(rornidepsin)、BAY-504798、白介素4、PRX-321、Pepscan、iboctadekin、rhlactoferrin、TRU-015、IL-21、ATN-161、西仑吉肽(cilengitide)、白蛋白干扰素(Albuferon)、Biphasix、IRX-2、Ω干扰素、PCK-3145、CAP-232、帕瑞肽(pasireotide)、huN901-DMI、卵巢癌免疫法疗疫苗、SB-249553、Oncovax-CL、OncoVax-P、BLP-25、CerVax-16、多表位肽黑素瘤疫苗(MART-1、gp100、酪氨酸酶)、奈米非肽(nemifitide)、rAAT(吸入)、rAAT(皮肤病学的(dermatological))、CGRP(吸入，哮喘)、pegsunercept、胸腺素β4、plitidepsin、GTP-200、雷莫拉宁、GRASPA、OBI-1、AC-100、鲑鱼降钙素(口服，eligen)、降钙素(口服，骨质疏松)、艾沙瑞林(examorelin)、卡莫瑞林(capromorelin)、Cardeva、velafermin、1311-TM-601、KK-220、T-10、乌拉立肽、地来司他(depelestat)、hematide、Chrysalin(外用)、rNAPc2、重组因子VI 11(聚乙二醇化的脂质体)、bFGF、聚乙二醇化的重组葡萄球菌激酶变体、V-10153、SonoLysis Prolyse、NeuroVax、CZEN-002、胰岛细胞新生疗法、rGLP-1、BIM-51077、LY-548806、艾塞那肽(控释，Medisorb)、AVE-0010、GA-GCB、阿伏瑞林(avorelin)、AOD-9604、醋酸利那洛肽(linaclotideacetate)、CETi-1、Hemospan、VAL(可注射的)、速效胰岛素(可注射的，Viadel)、鼻内胰岛素、胰岛素(吸入)、胰岛素(口服，eligen)、重组甲硫氨酰基人瘦素、pitrakinra(皮下注射，湿疹)、pitrakinra(吸入干粉，哮喘)、白细胞介素注射剂(Multikine)、RG-1068、MM-093、NBI-6024、AT-001、PI-0824、Org-39141、Cpn10(自身免疫性疾病/炎症)、talactoferrin(外用)、rEV-131(眼药)、rEV-131(呼吸疾病)、口服重组人胰岛素(糖尿病)、RPI-78M、奥普瑞白介素(口服)、CYT-99007CTLA4-Ig、DTY-001、伐拉司特(valategrast)、干扰素α-n3(外用)、IRX-3、RDP-58、Tauferon、胆汁盐刺激脂肪酶、Merispase、碱性磷酸酶(alalinephosphatase)、EP-2104R、美拉诺坦(Melanotan)-II、布雷默浪丹(bremelanotide)、ATL-104、重组人微纤溶酶(microplasmin)、AX-200、SEMAX、ACV-1、Xen-2174、CJC-1008、强啡肽(dynorphin)A、SI-6603、LAB GHRH、AER-002、BGC-728、疟疾疫苗(病毒颗粒，PeviPRO)、ALTU-135、细小病毒B19疫苗、流感疫苗(重组神经氨酸苷酶)、疟疾/HBV疫苗、炭疽疫苗、Vacc-5q、Vacc-4x、HIV疫苗(口服)、HPV疫苗、Tat类毒素、YSPSL、CHS-13340、PTH(1-34)脂质体霜剂(Novasome)、Ostabolin-C、PTH类似物(外用，银屑病)、MBRI-93.02、MTB72F疫苗(结核)、MVA-Ag85A疫苗(结核)、FARA04、BA-210、重组鼠疫F1V疫苗、AG-702、OxSODrol、rBetV1、Der-p1/Der-p2/Der-p7变应原-靶向疫苗(尘螨变态反应)、PR1肽抗原(白血病)、突变体ras疫苗、HPV-16 E7脂肽疫苗、labyrinthin疫苗(腺癌)、CML疫苗、WT1-肽疫苗(癌症)、IDD-5、CDX-110、Pentrys、Norelin、CytoFab、P-9808、VT-111、icrocaptide、替柏明(telbermin)(皮肤病学的，糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer))、芦平曲韦(rupintrivir)、reticulose、rGRF、P1A、α-半乳糖苷酶A、ACE-011、ALTU-140、CGX-1160、血管紧张肽治疗疫苗、D-4F、ETC-642、APP-018、rhMBL、SCV-07(口服，结核)、DRF-7295、ABT-828、ErbB2-特异性免疫毒素(抗癌剂)、DT3SSIL-3、TST-10088、PRO-1762、Combotox、缩胆囊素-B/胃泌素-受体结合肽、111In-hEGF、AE-37、曲妥珠单抗(trasnizumab)-DM1、拮抗剂G、IL-12(重组)、PM-02734、EVIP-321、rhIGF-BP3、BLX-883、CUV-1647(外用)、基于L-19的放射免疫疗法(癌症)、Re-188-P-2045、AMG-386、DC/1540/KLH疫苗(癌症)、VX-001、AVE-9633、AC-9301、NY-ESO-1疫苗(肽)、NA17.A2肽、黑素瘤疫苗(脉冲抗原疗法)、前列腺癌疫苗、CBP-501、重组人乳铁蛋白(干眼症)、FX-06、AP-214、WAP-8294A(可注射的)、ACP-HIP、SUN-11031、肽YY[3-36](肥胖，鼻内)、FGLL、阿塞西普(atacicept)、BR3-Fc、BN-003、BA-058、人甲状旁腺激素1-34(鼻部，骨质疏松)、F-18-CCR1、AT-1100(乳糜泻/糖尿病)、JPD-003、PTH(7-34)脂质体霜剂(Novasome)、耐久霉素(眼药，干眼症)、CAB-2、CTCE-0214、糖聚乙二醇化的促红细胞生成素、EPO-Fc、CNTO-528、AMG-114、JR-013、因子XIII、aminocandin、PN-951、716155、SUN-E7001、TH-0318、BAY-73-7977、替维瑞克(立即释放)、EP-51216、hGH(控释，Biosphere)、OGP-I、西夫韦肽(sifuvirtide)、TV4710、ALG-889、Org-41259、rhCCIO、F-991、胸腺五肽(thymopentin)(肺病)、r(m)CRP、肝选择性(hepatoselective)胰岛素、subalin、L19-IL-2融合蛋白、弹性蛋白酶抑制剂(elafin)、NMK-150、ALTU-139、EN-122004、rhTPO、血栓形成素受体激动剂(血小板减少性障碍)、AL-108、AL-208、神经生长因子拮抗剂(疼痛)、SLV-317、CGX-1007、INNO-105、口服特立帕肽(eligen)、GEM-OS 1、AC-162352、PRX-302、LFn-p24融合疫苗(Therapore)、EP-1043、肺炎链球菌儿童疫苗、疟疾疫苗、脑膜炎双球菌B组疫苗、新生儿B组链球菌疫苗、炭疽疫苗、HCV疫苗(gpE1+gpE2+MF-59)、中耳炎治疗、HCV疫苗(核心抗原+ISCOMATRIX)、hPTH(1-34)(经皮，ViaDerm)、768974、SYN-101、PGN-0052、aviscumnine、BIM-23190、结核疫苗、多表位酪氨酸酶肽、癌症疫苗、enkastim、APC-8024、GI-5005、ACC-001、TTS-CD3、血管靶向TNF(实体瘤)、去氨加压素(desmopressin)(含服控释)、奥那西普(onercept)、和TP-9201。

在某些实施方式中，蛋白质是酶或其生物活性片段。合适的酶包括但不限于：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。在某些实施方式中，异源生成的蛋白质是酶学委员会(EC)1类的酶，例如来自EC 1.1到1.21、或1.97中任一个的酶。酶也可以是来自EC 2、3、4、5或6类的酶。例如，酶可以选自EC 2.1到2.9、EC 3.1至3.13、EC 4.1至4.6、EC4.99、EC 5.1至5.11、EC 5.99、或EC 6.1-6.6中任一个。

如本文使用的，术语“抗体”指的是基本上完整的抗体分子。

如本文使用的，短语“抗体片段”指的是能够结合至抗原的表位的抗体的功能性片段(比如Fab、F(ab')2、Fv或单结构域分子比如VH和VL)。

根据一个实施方式，多肽源自哺乳动物物种例如人多肽。

根据具体的实施方式，蛋白质选自sfGFP、P50、酪氨酸酶和假单胞菌外毒素。

如提及的，本教导还可以仅针对RNA的生成应用。非编码RNA在研究以及在临床、农业、工业应用(例如，乳品生产)中的用途在近十年来已经获得许多关注。

根据具体的实施方式，RNA是RNA沉默剂。

如本文使用的，短语“RNA沉默”指的是由RNA分子导致的一组调控机制[例如RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压抑、共抑制、和翻译阻遏作用]，其导致抑制或“沉默”对应的蛋白编码基因的表达。已经在许多类型的生物体包括植物、动物和真菌中观察到RNA沉默。

如本文使用的，术语“RNA沉默剂”指的是能够特异性地抑制或“沉默”靶基因的表达的RNA。在某些实施方式中，RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制阻止mRNA分子的完全加工(例如，完整翻译和/或表达)。RNA沉默剂包括非编码RNA分子，例如包括成对链的RNA双链体，以及由其可以产生这样的小非编码RNA的前体RNA。示例性RNA沉默剂包括dsRNA比如siRNA、miRNA(或miR模拟物)和shRNA。

在一个实施方式中，RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。

在另一个实施方式中，RNA沉默剂能够介导翻译遏制作用。

RNA可以具有10-1000个碱基的长度。

术语“siRNA”指的是小抑制RNA双链体(通常在18-30个碱基对之间)，其诱导RNA干扰(RNAi)途径。通常，siRNA被化学合成为21mer——其具有中间的19bp双链体区和在末端上的对称的2个碱基的3'-突出端，但是最近已经描述了25-30个碱基长度的化学合成的RNA双链体在相同位置处与21mer相比可以具有多达100倍效力增加。使用较长的RNA在引发RNAi中获得的观察到的增加的效力被认为由如下造成：给Dicer提供底物(27mer)而不是产物(21mer)并且这提高了siRNA双链体进入RISC的速率和效率。

双链干扰RNA(例如，siRNA)的链可以被连接以形成发夹或茎-环结构(例如，shRNA)。因而，如提及的，本发明的一些实施方式RNA沉默剂还可以是短发夹RNA(shRNA)。

如本文使用的，术语“shRNA”指的是具有茎-环结构的RNA试剂，其包括互补序列的第一和第二区，互补性的程度和该区的取向是足够的，使得在该区之间发生碱基配对，第一和第二区通过环区接合，环由在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对造成。环中的核苷酸的数目是在3至23、或5至15、或7至13、或4至9、或9至11之间并且包括3至23、或5至15、或7至13、或4至9、或9至11的数目。环中的一些核苷酸可以参与与环中的其它核苷酸的碱基对相互作用。可以用于形成环的寡核苷酸序列的实例包括5'-CAAGAGA-3'和5'-UUACAA-3'(国际专利申请号WO2013126963和WO2014107763)。本领域技术人员将认识到得到的单链寡核苷酸形成茎-环或发夹结构，其包括能够干扰RNAi装置的双链区。

miRNA和miRNA模拟物-根据另一个实施方式，RNA沉默剂可以是miRNA。

术语“microRNA”、“miRNA”和“miR”是同义的并且指的是长度是大约19-28个核苷酸的非编码单链RNA分子的集，其调控基因表达。miRNA发现于大范围的生物体(病毒.fwdarw.人)中并且已经显示在发育、稳态、和疾病病因学中发挥作用。

下面是miRNA活性的机制的简要描述。

编码miRNA的基因被转录导致已知为pri-miRNA的miRNA前体的生成。pri-miRNA通常是包括多个pri-miRNA的多顺反子RNA的一部分。pri-miRNA可以形成具有茎和环的发夹。茎可以包括错配的碱基。

pri-miRNA的发夹结构被Drosha识别，其是RNase III核酸内切酶。Drosha通常识别pri-miRNA中的末端环并且将大约两个螺旋转角(helical turn)切割为茎以生成已知为pre-miRNA的60-70个核苷酸的前体。Drosha以RNase III核酸内切酶特有的交错切口切割pri-miRNA，产生具有5'磷酸和～2个核苷酸的3'突出端的pre-miRNA茎环。估计超过Drosha切割位点延伸的茎的大约一个螺旋转角(～10个核苷酸)对高效加工是必不可少的。pre-miRNA然后通过Ran-GTP和输出受体Ex-portin-5从细胞核主动运输至细胞质。

pre-miRNA的双链茎然后被Dicer识别，其也是RNase III核酸内切酶。Dicer还可以识别在茎环的基部处的5'磷酸和3'突出端。Dicer然后从茎环的基部切除末端环两个螺旋转角，留下额外的5'磷酸和～2个核苷酸的3'突出端。得到的siRNA样双链体——其可以包括错配——包括成熟miRNA和已知为miRNA*的类似尺寸的片段。miRNA和miRNA*可以源自pri-miRNA和pre-miRNA的相对臂(opposing arm)。miRNA*序列可以发现于克隆的miRNA的文库，但是通常以比miRNA更低的频率。

虽然最初与miRNA*呈现为双链种类，但是miRNA最终变为单链RNA，其掺入已知为RNA诱导沉默复合体(RISC)的核糖核蛋白复合体。多种蛋白质可以形成RISC，其可以导致miRNA/miRNA*双链体的特异性、靶基因的结合位点、miRNA的活性(遏制或激活)、和miRNA/miRNA*双链体中的哪个链被装载入RISC的变化性。

当miRNA:miRNA*双链体的miRNA链被装载入RISC时，miRNA*被去除和降解。被装载入RISC的miRNA:miRNA*双链体的链是其5'端较少紧密配对的链。在其中miRNA:miRNA*的两端具有粗略相等的5'配对的情况下，miRNA和miRNA*二者可以具有基因沉默活性。

RISC基于miRNA和mRNA之间高水平的互补性，尤其是通过miRNA的第2-7个核苷酸鉴别靶核酸。

提取物还可以包括编码异源性RNA聚合酶的mRNA和包括表达异源性RNA聚合酶的核酸序列的质粒。

根据具体的实施方式，反应混合物中异源性蛋白质表达的全部RNA聚合酶活性基本上归因于异源性RNA聚合酶的表达、存在或水平。

根据可选的实施方式，反应混合物进一步包括异源性RNA聚合酶，其作为纯化的蛋白质(不含宿主细胞污染物)外源地添加至混合物。

细菌宿主细胞不含蛋白酶以便提高重组蛋白的表达，并且还可以不含RNAse。

根据具体的实施方式，蛋白酶缺陷细菌细胞还是RNase缺陷的。

一旦获得细胞提取物，其可以被封装在脂质颗粒中。这可以用于临床应用以确保以定位/靶向方式在体内生成蛋白质/mRNA。为此(例如，在全身应用中)，颗粒可以被修饰以呈现靶向部分。这些靶向部分包括配体，比如寡糖、肽、蛋白质和维生素。由于已经建立了针对感兴趣的组织靶标生成单克隆抗体的程序，大多数靶向部分通常集中于抗体缀合。

如本文使用的，“囊泡”指的是纳米至微米结构(例如，100nm-5μm)，其不是生物细胞。

颗粒可以是具有内腔的合成载体，其能够可装载有(例如，封装)提取物。颗粒可以是聚合物或非聚合物制剂。

可以根据本发明的此方面使用的示例性颗粒包括但不限于聚合物颗粒、微囊、脂质体、微球体、微乳、纳米颗粒、纳米囊(nanocapsule)、纳米球体、纳米脂质体、纳米乳液(nano-emulsion)和纳米管。

根据具体的实施方式，颗粒是纳米颗粒。

如本文使用的，术语“纳米颗粒”指的是具有在单个原子和宏观大固体(bulksolid)之间的中等尺寸的颗粒(一个或多个)。通常，纳米颗粒具有在亚微米范围中的特征尺寸(例如，大体上球形的纳米颗粒的直径，或大体上细长的纳米颗粒的长度)，例如，大约100nm至大约5000nm、大约100nm至大约500nm、或大约100nm至大约300nm、或300nm-1000nm。纳米颗粒可以具有任何形状，其非限制性地包括细长的颗粒形状，比如纳米线，或不规则的形状，还有较规则的形状，比如大体上球形的、六边形的和立方体的纳米颗粒。根据一个实施方式，纳米颗粒是大体上球形的。将通常根据预期用途选择尺寸。因而，对于局部治疗比如对于治疗纤维化(例如，使用表达蛋白水解酶例如胶原酶的颗粒)，颗粒可以具有500nm-5000nm的平均直径，另一方面，对于治疗癌症，例如，使用抗增殖剂，使用的颗粒可以更小，例如，100-300nm，这样的颗粒还用于治疗肝适应症。

本发明的此方面的颗粒可以具有荷电表面(即，带正电或带负电)或中性表面。

可以根据颗粒的外表面上需要的期望的电荷选择用于制造颗粒的试剂。

因而，例如，如果带负电的表面是期望的，颗粒可以由带负电的脂质(即阴离子磷脂)制造，比如本文下面描述的。

当带正电荷的表面是期望的时，颗粒可以由带正电的脂质(即阳离子磷脂)制造，比如本文下面描述的。

如提及的，本发明也考虑不带电荷的颗粒。这样的颗粒可以由中性脂质比如磷脂酰乙醇胺或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)制造。

将理解不同脂质的组合可以用于制造本发明的颗粒，包括多于一种阳离子脂质的混合物、多于一种阴离子脂质的混合物、多于一种中性脂质的混合物、至少一种阳离子脂质和至少一种阴离子脂质的混合物、至少一种阳离子脂质和至少一种中性脂质的混合物、至少一种阴离子脂质和至少一种中性脂质的混合物、和上面的另外的组合。此外，可以使用基于聚合物-脂质的制剂。

存在可以附加至脂质的众多聚合物。通常被用作脂质改性剂的聚合物包括而不限于：聚乙二醇(PEG)、多聚唾液酸、聚乳酸(也称为聚丙交酯)、聚乙醇酸(也称为聚乙交酯)、聚乳酸(apolylactie)-聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基唑啉(polymethoxazoline)、聚乙基唑啉(polyethyloxazoline)、聚羟乙基唑啉(polyllydroxyetlyloxazolille)、聚羟丙基唑啉(solyhydroxypryloxazoline)、polyaspartarllide、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙烯基甲醚、聚羟乙基丙烯酸酯、衍生的(derivatized)纤维素比如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。

聚合物可以被采用为均聚物或嵌段或无规共聚物。

颗粒还可以包括其它组分。这样的其它组分的实例包括而不限于脂肪醇、脂肪酸、和/或胆固醇酯或任何其它药学上可接受的赋形剂，其可以影响表面电荷、膜流动性并且辅助将生物活性脂质掺入脂质装配体(assembly)。固醇的实例包括胆固醇、胆固醇半琥珠酸酯(hemisuccinate)、胆固醇硫酸盐、或胆固醇的任何其它衍生物。根据本发明的优选的脂质装配体包括形成微团(通常当装配体不存在脂质基体时)的那些或形成脂质体(通常，当存在脂质基体时)的那些。

在具体的实施方式中，颗粒是脂质体。如本文使用的并且如本领域认识到的，脂质体包括由脂质组成的任何合成的(即，非天然存在的)结构，其包围一个体积。脂质体包括乳液、泡沫、微团、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、片状层等。可以通过本领域已知的方法制备脂质体[Monkkonen,J.等,1994,J.Drug Target,2:299-308；Monkkonen,J.等,1993,Calcif.Tissue Int.,53:139-145；Lasic D D.,Liposomes Technology Inc.,Elsevier,1993,63-105.(第3章)；Winterhalter M,Lasic D D,Chem Phys Lipids,1993年9月；64(1-3):35-43]。

脂质体可以是单层的或可以是多层的。由于它们表现出较大的表面积/脂质质量，单层的脂质体在一些情况中可以是优选的。依据本发明的合适的脂质体优选地是无毒的。脂质体可以由单一磷脂或磷脂的混合物制造。脂质体还可以包括其它脂质材料比如胆固醇。对于制造具有负电表面电势的脂质体，可以使用酸性磷脂或鞘脂或其它合成脂质。优选地，脂质具有进入脂质双层的高的分配系数和离开脂质装配体的低的解吸速率。可以用于制造具有负电表面电势的脂质体的示例性磷脂包括但不限于磷酯酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油。

可以使用的不是脂质体形成脂质的其它带负电的脂质是鞘脂比如脑苷脂硫酸盐、和多种神经节苷脂。

根据具体的实施方式，脂质体由胆固醇和DMPC组成，如在其后的实施例部分中描述的。

脂质体的脂质相可以包括生理学上可接受的脂质体形成脂质或生理学上可接受的脂质体形成脂质的组合。脂质体-形成脂质通常是具有甘油主链——其中羟基(hydrofoil)中的至少一个被酰基链、磷酸基团、其组合或衍生物取代——并且在头部基团(headgroup)处可以包含化学反应性基团(比如胺、亚胺、酸、酯、醛或醇)的那些。通常，酰基链的长度是12至大约24个碳原子之间，并且具有被完全氢化、部分氢化或未氢化的脂质的不同的饱和度。进一步，脂质基体可以是天然来源、半合成脂质或全合成脂质，并且是中性的、带负电的或带正电的。

根据一个实施方式，脂质相包括磷脂。

磷脂可以是甘油磷脂。甘油磷脂的实例包括而不限于磷脂酰甘油(PG)——包括二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)；磷脂酰胆碱(PC)——包括卵黄磷脂酰胆碱和二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)、磷酯酰丝氨酸(PS)和鞘磷脂(SM)和其衍生物。

根据本发明采用的另一组脂质基体包括阳离子脂质(单阳离子或多阳离子脂质)。阳离子脂质通常由亲脂性部分——比如固醇或其中两个酰基或两个烷基，或一个酰基和一个烷基链有助于两亲性分子的疏水区的相同的甘油主链——构成以形成具有整体净正电荷的脂质。

优选地，脂质的头部基团携带正电荷。单阳离子脂质可以包括，例如，1,2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)1,2-二油烯氧基-3-(三甲基氨基(anino))丙烷(DOTAP)、N-[-1-(2,3,-双四癸氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N-[1-(2,3,-二油烯氧基)丙基]-N,N-二甲基-N-羟乙基-溴化铵(DORIE)、N-[1-(2,3-二油烯氧基)丙基]；-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；3；N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰(carbamoly)]；胆固醇(DC-Choi)、和二甲基-双十八烷基铵(DDAB)。

多阳离子脂质的实例包括与单阳离子脂质类似的精胺或亚精胺附加至其的亲脂性(lipoplilic)部分。这些包括而不限于N-[2-[[2,5-双[3-氨基丙基)氨基]-1-氧代戊基]氨基]乙基]N,N二甲基(dimethul)-2,3双(1-氧-9-亚十八烷基(octadecenyl))氧]；-l丙烷铵(aminium)(DOSPA)，和神经酰胺氨基甲酰精胺(CCS)。

阳离子脂质可以单独使用，或结合胆固醇、结合中性磷脂或其它已知的脂质装配体组分使用。此外，阳离子脂质可以形成衍生的磷脂比如使用聚赖氨酸衍生的中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的一部分以形成阳离子脂聚合物(lipopolymer)。

对于定型脂质体，可以使用挤出、均质化或暴露于超声辐射，可以便利地使用的均质器包括由Boston,MA的Microfluidics生产的微流化器。在典型的均质化程序中，脂质体通过标准的乳化均质器再循环直到观察到选择的脂质体尺寸。可以通过常规的激光束粒径辨别监测粒径分布。通过小孔聚碳酸酯膜或非对称的陶瓷膜挤出脂质体是将脂质体尺寸减小至相对良好限定的尺寸分布的有效方法。通常，悬浮剂通过膜循环一次或多次直到取得期望的脂质体尺寸分布。可以通过依次地更小孔的膜挤出脂质体以取得脂质体尺寸的逐渐减小。

脱水的脂质或预装配的(preassembled)脂囊泡(例如，20-100nM，例如，50nM)可以在存在提取物和DNA模板的情况下再水化以形成包含(封装了提取物)的脂囊泡。重要地，封装在冰上进行以阻止不在囊泡内的转录/翻译。

当使用颗粒状提取物(即，以颗粒进行封装)时，转录/翻译需要的组分(例如，氨基酸、核苷酸、ATP)可以被添加至混合物，其中它们被颗粒摄取。

如本文使用的，“蛋白质转录和翻译需要的组分”指的是包括tRNA、核糖体和转录因子的用于这些活动中的每一种的细胞装置。

体外合成或“无细胞蛋白质合成”指的是在包括生物提取物和/或限定的试剂的反应混合物中多肽的无细胞合成。反应包括用于生成大分子的模板，例如DNA、mRNA、蛋白质；待合成的大分子的单体，例如氨基酸、核苷酸等；和合成需要的这样的辅因子、酶和其它试剂，例如核糖体、tRNA、聚合酶、转录因子等。无细胞合成反应可以作为如本领域已知的分批、连续流动、或半连续流动进行。

根据具体的实施方式，生物提取物以30％(20-40％)(v/v)的浓度存在于反应混合物。

根据本发明的实施方式，反应混合物进一步包括氨基酸、rNTP、H₂O、盐和ATP-再生系统。

根据本发明的实施方式，反应混合物包括聚乙二醇。

根据本发明的实施方式，模板DNA是环状DNA。

根据本发明的实施方式，模板DNA包括可操作地连接至编码蛋白质的核酸序列的RNA聚合酶的启动子。

根据具体的实施方式，DNA以1-100μg/μl例如10μg/μl的浓度存在于反应混合物。

根据本发明的实施方式，盐选自钾、镁和铵。

对于偶联转录和翻译，细菌细胞裂解物的镁浓度必须通过额外的镁化合物——优选地，盐——调节。优选的盐包括氯化镁和醋酸镁。可以采取在溶液添加缓冲液以使pH稳定，但是这不是必需的。对于偶联转录和翻译，足够量的氯化镁或醋酸镁被添加至裂解物以将最终镁浓度升高至其中由DNA转录RNA和将RNA翻译为蛋白质的水平。此水平将取决于使用的裂解物而变化。

由于镁增强装配的核糖体的稳定性并且在翻译期间在它们结合在一起中起作用，也已知镁对优化翻译是重要的。镁还似乎在促进聚合酶结合中发挥作用。钾对优化翻译同样是重要的，但是与镁的情况不同，对于偶联转录和翻译，钾离子的浓度不需要改变到超出标准的翻译制备水平。

该水平部分地来自内源性裂解物水平，并且部分地来自在裂解物的制备中制造的添加物。

根据具体的实施方式，镁浓度被调节至相当窄的最佳范围内，因此在添加额外的镁之前，直接通过使用镁检验，测量裂解物镁水平，使得镁在反应中的量可以从一批裂解物至下一批标准化。Lancer“Magnesium Rapid Star诊断试剂盒”(Oxford Lab WareDivision,Sherwood Medical Co.,St.Louis,Mo.)是一个这样的检验，其可以准确地测量生物流体中的镁水平。一旦给定批的裂解物的镁离子浓度是已知的，则额外的镁，例如以浓缩的镁盐溶液的形式，可以以已知的方式添加以使裂解物的镁浓度处于最佳范围内，或者在被用作反应混合物的一半的改性的裂解物制剂的情况下，使裂解物的镁浓度处于两倍的最佳范围内。根据本发明的实施方式，反应混合物包括10-20mM镁盐、40-60mM钾盐和100-200mM铵盐。

偶联的转录和翻译的反应条件包括添加三磷酸核糖核苷酸(ATP、GTP、CTP、UTP)和氨基酸——对于细菌裂解物，终浓度分别为每种0.8-1.2mM和每种2.5mM。如果放射性标记的氨基酸被用于偶联反应，比如³⁵S甲硫氨酸或³H亮氨酸，则对应的氨基酸不计入氨基酸混合物。由于裂解物(lystae)已经包括RNA聚合酶，则不向混合物添加额外的聚合酶，以10μg/ml的浓度添加具有待转录/翻译的基因的DNA模板，并且通过添加水(无DNase无RNase)反应体积被调节至50μl。反应然后在37℃下培育1-2小时，这取决于产物。

如上面提及的，虽然钾被添加至反应混合物，但是与镁相比，额外的钾不极大地增加蛋白质生成，而是当已经存在适当的镁水平时仅提供轻微的提高。钾盐(例如，醋酸盐)被添加至大约50mM的最佳终浓度。

氯化钾或醋酸钾的终浓度也是基于此组分在标准的裂解物中的量的估算值，但是必须认识到此浓度以及镁浓度可以由于内源性组分轻微地改变。

额外的组分可以根据需要被添加至裂解物，以便提高偶联的转录和翻译反应的效率或稳定性。向偶联的转录和翻译反应的一种一般添加是足以刺激链延长的效率的量的聚胺。

虽然非必需，但是根据具体的实施方式，对于偶联的转录和翻译，亚精胺可以被添加至混合物。聚胺同样影响最佳镁水平，并且已知稍微降低翻译反应的有效的镁浓度。似乎聚胺可以替换相同水平下的镁，并且因而将在镁需要的优化中发挥作用，可能甚至允许偶联的转录和翻译的最佳镁水平的一些降低。

体外环境中的最佳镁浓度也受其它条件和考量影响。随着三磷酸核糖核苷酸浓度上升，例如，存在最佳镁浓度的相伴的增加，这是由于三磷酸核糖核苷酸倾向于在溶液中与镁缔合或螯合。

PEG或其它合成聚合物可以被添加以增加反应混合物的粘性。

根据本发明的实施方式，反应混合物列列举在下面的表3中。

根据本发明的实施方式，合成以分批、连续流动、或半连续流动进行。

根据本发明的实施方式，感兴趣的蛋白质的产量是至少大约600μg蛋白质/ml的反应混合物，至少大约800μg蛋白质/ml的反应混合物、1000μg蛋白质/ml的反应混合物、或更多。

根据示例性实施方式，感兴趣的蛋白质的产量是100-1500μg蛋白质/ml的反应混合物、500-1500μg蛋白质/ml的反应混合物、600-1500μg蛋白质/ml的反应混合物、700-1500μg蛋白质/ml的反应混合物、800-1500μg蛋白质/ml的反应混合物或1000-1500μg蛋白质/ml的反应混合物。

可以以多种方式测量在偶联的体外转录和翻译中生成的蛋白质的量。一种方法依赖于测量被翻译的具体蛋白质的活性的检验的可用性。用于测量蛋白活性的检验的实例是在Technical Bulletin 101,Promega Corp.,Madison,Wis中描述的荧光素酶检验系统。这些检验测量由偶联的体外转录和翻译反应生成的功能活性蛋白的量。

测量在偶联的体外转录和翻译反应中生成的蛋白质的量的另一种方法是进行如下反应：其使用已知数量的放射性标记的氨基酸比如³⁵S甲硫氨酸或³H亮氨酸，并且随后测量掺入新翻译的蛋白质的放射性标记的氨基酸的量。对于此方法的描述，参见体外翻译技术手册，Promega Corp.,Madison,Wis。掺入检验将测量包括截断的蛋白产物的在体外翻译反应中生成的所有蛋白质中的放射性标记的氨基酸的量。重要的是，在蛋白凝胶上分离放射性标记的蛋白质，并且通过放射自显影确认产物是适当尺寸的并且没有生成次要蛋白产物。蛋白质生成的最准确的测量是将活性的测量与掺入的测量关联。

根据具体的实施方式，以粗制形式使用提取物，其然后补充有必需组分，比如下文描述的，其包括但不限于：

(i)预成形为或能够形成脂囊泡的脂质；

(ii)对照DNA模板；

(iii)氨基酸；

(iv)rNTP；

(v)H₂O；

(vi)盐；和

(vii)ATP-再生系统。

本文描述的提取物可以被包括作为试剂盒的一部分，以便促进无细胞翻译反应的建立。这样的试剂盒改进对研究者的便利性，这是由于准备好细菌裂解物并且可供使用。除提取物(在本文还称为“裂解物”)之外，这样的试剂盒还可以包括在引入DNA模板之后进行偶联的转录和翻译需要的组分，试剂包括核苷酸，盐，和缓冲液。裂解物可以是标准的，或可以具有如下类型：其中已经在制造期间对其盐浓度进行调节，或额外地，其中已经包括偶联的转录和翻译需要的组分、试剂或缓冲液中的一种或多种。

因而，提取物可以包装在包括使用说明书的试剂盒中，或进一步包括如下的至少一个：

(i)预成形为或能够形成脂囊泡的脂质；

(ii)对照DNA模板；

(iii)氨基酸；

(iv)rNTP；

(v)H₂O；

(vi)盐；和

(vii)ATP-再生系统。根据具体的实施方式，对照DNA模板与提取物单独地包装。

根据具体的实施方式，(i)-(vi)中的每个单独地包装。

根据具体的实施方式，(i)-(vi)中的至少两个单独地包装。

对于治疗性适应症，包括提取物和模板DNA的颗粒可以被施用至需要其的对象本身，或在它与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物中。

如本文使用的，“药物组合物”指的是本文描述的活性成分中的一种或多种与其它化学组分比如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进施用化合物至生物体。

药物配制和施用技术可以发现于"Remington's Pharmaceutical Sciences",Mack Publishing Co.,Easton,PA,最新版，其通过引用并入本文。

合适的施用途径可以，例如，包括口服，直肠，经粘膜——尤其是经鼻，肠或肠胃外递送——包括肌肉内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内，例如，进入右或左心室、进入常见冠状动脉、静脉内、腹膜内(inrtaperitoneal)、鼻内、或眼内注射。

可选地，可以以局部而不是全身方式施用药物组合物，例如，经由将药物组合物直接注射入患者的组织区域。

如本文使用的，术语“大约”指的是±10％。

术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”和它们的同源词意思是“包括但不限于”。

术语“由…构成”意思是“包括并且限于”。

术语“基本上由…构成”意思是组合物、方法或结构可以包括额外的成分、步骤和/或部分，但前提是额外的成分、步骤和/或部分不实质性地改变要求保护的组合物、方法或结构的基本特性和新特性。

如本文使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外明确地规定。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括包括其混合物的多种化合物。

遍及本申请，可以以范围形式呈现本发明的多种实施方式。应当理解范围形式的描述仅仅出于便利和简洁，并且不应当解释为对本发明的范围的顽固限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的个体数值。例如，范围比如1至6的描述应当被认为已经具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的个体数字，例如，1、2、3、4、5和6。不论范围的宽度此均适用。

每当在本文指示数值范围时，其意思是包括指示的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字和第二指示数字的范围内/在第一指示数字和第二指示数字之间的范围”和“在第一指示数字‘至’第二指示数字的范围内/在第一指示数字‘至’第二指示数字之间的范围”在本文可交换地使用，并且意思是包括第一和第二指示数字和其之间的所有分数和整数。

如本文使用的，术语“方法”指的是用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，但是不限于化学、生理学、生物、生物化学和医学领域的从业者已知的，或其容易由已知的方式、手段、技术和程序研发出的那些方式、手段、技术和程序。

当引用具体的序列表时，这样的引用被理解为还包含基本上对应于其互补序列的序列，包括例如由序列错误、克隆错误造成的次要序列变化，或导致碱基置换、碱基缺失或碱基添加的其它改变，条件是这样的变化的频率小于1/50个核苷酸，可选地，小于1/100个核苷酸，可选地，小于1/200个核苷酸，可选地，小于1/500个核苷酸，可选地，小于1/1000个核苷酸，可选地，小于1/5,000个核苷酸，可选地，小于1/10,000个核苷酸。

可以理解本发明的某些特征——其出于清楚在单独的实施方式的背景下描述——还可以在单个实施方式组合提供。相反地，本发明的多个特征——其出于简洁在单个实施方式的背景下描述——还可以单独地提供或在任何合适的子组合中提供或合适地提供在本发明的任何其它描述的实施方式。在多种实施方式的背景下描述的某些特征不被认为是那些实施方式的基本特征，除非实施方式在没有那些要素的情况下是无效的。

上文描述的和在所附的权利要求部分中要求保护的本发明的多种实施方式和方面在下列实施例中发现实验支持。

实施例

现在参考下列实施例，其连同上面的描述以非限制性方式说明了本发明的一些实施方式。

通常，本文使用的术语和本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中完整地解释。参见，例如，"Molecular Cloning:Alaboratory Manual"Sambrook等,(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel等,"Current Protocols inMolecular Biology",John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APractical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren等(eds)"GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York(1998)；在美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中陈述的方法；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-IIICellis,J.E.,ed.(1994)；"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique"byFreshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites等(eds),"Basic and ClinicalImmunology"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman和Co.,New York(1980)；可用的免疫检验广泛地描述在专利和科学文献中，参见，例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；"Nucleic Hybridization"Hames,B.D.,和Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,和Higgins S.J.,eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide toMolecular Cloning"Perbal,B.,(1984)和"Methods in Enzymology"Vol.1-317,AcademicPress；"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",Academic Press,SanDiego,CA(1990)；Marshak等,"Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；其所有通过引用并入，如同在本文充分地陈述一样。其它一般参考文件遍及本文件提供。其中的程序被认为是本领域熟知的并且为了方便阅读者提供。其中包含的所有信息通过引用并入本文。

实施例1

制备用于蛋白质的体外转录和翻译的S30裂解物的简单程序

材料和方法

细菌菌株和质粒：Targe载体pAR1219购自Sigma-Aldrich(Rehovot,Israel)，并且使用MicroPulser电穿孔仪(Biorad,Hercules,CA,USA)经由电穿孔被转化入大肠杆菌BL21(DE3)F^-ompT gal dcm lon hsdS_B(r_B ^-m_Β ^-)λ(DΕ3[lacI lacUV5-T7 gene 1ind1 sam7 nin5)(Merck KgaA,Darmstadt,Germany)感受态细胞。质粒pAR1219在异丙基β-D-l-硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导型lacUV5启动子的控制下表达T7RNA聚合酶。

T7-S30裂解物的制备

大肠杆菌BL21(DE3)/pAR1219甘油原液(-80℃)被划线接种在Luria Bertani(LB)¹⁴平板——其使用1.5％细菌培养用琼脂(Acumedia,Neogen Corporation,MI,USA)固化，补充有50μg ml^-1下的氨苄青霉素(LB-amp50)——上以维持质粒。单个菌落被用于接种新鲜的LB-amp50培养基，培养物在TU-400振荡培养箱(Orbital shaker incubator,MRC,Holon,Israel)上以250rpm下的振荡在37℃下生长过夜(o/n)，并且被用作起子以在次日以1:50的起子:培养基比率接种新鲜的Terrific Broth培养基¹⁵(补充有50μg ml^-1氨苄青霉素)。培养物在37℃下生长至OD₆₀₀≈1，在其之后添加0.4mM的IPTG(InalcoS.P.A.,Milano,Italy)。培养物在37℃下进一步生长直到它达到OD₆₀₀＝4，并且然后使用F-14碳纤维转子Multifuge3XR Plus Heraeus离心机(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)在4℃下以7,000×g离心10min。沉淀物重悬在相同体积(1:1v/v)的S30裂解物缓冲液中，其包含：Tris-醋酸盐10mM，pH＝7.4(Sigma-Aldrich)、醋酸镁14mM(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)、醋酸钾60mM(Alfa-Aeser,Ward Hill,MA USA)、二硫苏糖醇(DTT)1mM(Sigma-Aldrich)和2-巯基乙醇0.5ml/1升(Sigma-Aldrich)。然后，悬浮液以相同的条件再次离心并且根据如下等式重悬在S30裂解物缓冲液中：在OD₆₀₀＝5下源自1升培养物的沉淀物应当使用15ml S30裂解物缓冲液重悬。然后，细胞通过在15,000psi的工作压力和4bar的空气压力下穿过冰冷的emulsiFlex-C3高压均质器(Avestin,Mannheim,Germany)被破碎。然后，100μl的0.1M DTT被添加至每个10ml的均质的悬浮液。最后，悬浮液使用F-14碳纤维转子Multifuge 3XRPlus Heraeus离心机(Thermo Fisher Scientific)在4℃下以25,000×g离心30min，分成200μ1的整分试样，通过液氮冷冻并且在-80℃下储存供进一步使用。

图1是比较根据本发明的一些实施方式的裂解物制剂与由Pratt,J.M.在Trancription and Translation a practical approach(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑)Ch.7,179-209(IRL Press 1984)中教导的现有技术的裂解物制剂的方案。

实施例2

使用基于根据本发明的一些实施方式生成的S30裂解物的无细胞系统的蛋白质合 成

T7-S30裂解物的制备–如上面描述的。

根据本发明的一些实施方式的反应混合物：

表2：示例性方案的成分。

反应使用温和振荡(300rpm)在30℃或37℃下在(Eppendorf,Gemany)中实施并且持续90min至180min，这取决于生成的蛋白质。图2是显示根据本发明的一些实施方式的蛋白质/RNA生成的方法的主要要素的方案。

海肾荧光素酶生成

使用本系统生成蛋白质，其中包括在S30 T7高产量蛋白表达系统试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)中的编码海肾荧光素酶的S30 T7对照DNA作为DNA模板(SEQ IDNO:1)。根据Promega(Madison,WI,USA)的荧光素酶检验系统方案在180min培育后测量生成的蛋白质的量。简而言之，使用蒸馏水1:5稀释荧光素酶细胞培养物裂解试剂(裂解缓冲液)。使用裂解缓冲液1:40稀释生成的蛋白质。荧光素酶检验缓冲液以1:100的比率被添加至荧光素酶检验底物。然后，50μl的裂解缓冲液和蛋白混合物与50μl的检验缓冲剂和底物混合。使用Tecan Infinite200pro酶标仪(plate reader)(Tecan,Mannedorf,Switzerland)以10sec的延时测定荧光。

由本系统以比商购系统(Promega)更高的效率生成海肾荧光素酶(图3)。

来自巨大芽孢杆菌(TyrBm)生成的酪氨酸酶

使用本系统——其具有编码作为DNA模板的TyrBm质粒的PET9d质粒——生成蛋白质。使用SEQ ID NO:2的TyrBm。在180min的培育后测量生成的蛋白质的量。1mM酪氨酸和1mMCu⁺²被添加至混合物并且在37℃下培育持续另一个30min。使用Tecan Infinite200pro酶标仪(Tecan,Mannedorf,Switzerland)测定475nm下的吸光度。

如由图8可观察到的，使用根据本发明的一些实施方式的本无细胞系统生成来自巨大芽孢杆菌的酪氨酸酶。当反应不包括DNA模板时，不生成蛋白质。

超折叠(super folder)GFP(sfGFP)

使用本系统——其具有编码作为DNA模板的sfGFP(SEQ ID NO:3)的PET9a质粒——生成蛋白质。模板购自Sandia BioTech(Albuquerque,New Mexico,USA)并且并入pet9a和pet28a。使用限制性位点Ndel和BamHI将超折叠GFP序列插入pet9a和pet28a载体。使用Tecan Infinite200pro酶标仪(Tecan,Mannedorf,Switzerland)在488nm的激发波长和530nm的发射波长(emission)下监测蛋白质生成。

通过在25-45℃的范围中的不同温度中进行反应180min来评价本系统的热稳定性。最高的蛋白质生成活性在37℃下，这指示了本系统的最佳热稳定性(图4)。

通过在37℃下在96孔平底黑色聚苯乙烯平板(Greiner)中实施无细胞反应来分析蛋白质生成的动力学。使用Tecan Infinite200pro酶标仪(Tecan,Mannedorf,Switzerland)每5min监测蛋白质生成，持续166min。作为对照，平行地或以相同的设定点监测水和不具有DNA模板的无细胞反应混合物。sfGFP的生成的合适的反应时间被发现是120-150min(图6)。

p50(NF-Kβ亚基)生成和评价

使用本系统——其具有编码p50(NF-Kβ亚基，SEQ ID NO:4)的模板——生成蛋白质。使用[³⁵S]甲硫氨酸并且使用或不使用未标记的甲硫氨酸在30℃和37℃中进行蛋白质生成。在90min后，无细胞混合物与0.25体积的×4浓缩的SDS-PAGE样品缓冲液混合并且在95℃下煮沸10min。然后，1μL样品被加样至12％SDS-PAGE凝胶上。在电泳之后，凝胶通过放射自显影可视。图9呈现了使用根据本发明的一些实施方式的本无细胞系统生成的p50(NF-Kβ亚基)。当在37℃中进行时，蛋白质合成比在30℃中时更高效。

实施例3

包含无细胞系统的颗粒的制备和其中蛋白质的生成

根据Sunami等,2006¹¹制备封装无细胞系统的颗粒。最初地，60:40的摩尔比的l,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)(德国Lipoid)和胆固醇(Sigma-Aldrich)被溶解于氯仿。然后，使用旋转式蒸发器(Buchi)蒸发溶剂，使得能够产生薄脂质膜。膜在旋转的同时与双蒸水水合。分散液变得浑浊，指示脂囊泡的自发形成。在40℃下在10mL挤出系统(Northern Lipids,Vancouver,Canada)中使用400nm孔径的膜，以逐步挤出通过聚碳酸酯膜( Nuclepore^TMTrack-Etched Membranes)产生纳米级囊泡。此步骤之后进行冻干(Labonco)。为了在颗粒中封装无细胞系统，冻干的脂质体在50mM的最终脂质浓度下与无细胞反应混合物——其具有作为DNA模板的sfGFP编码质粒——再水化。在4℃下使用(Eppendorf,Germany)，使用温和振荡(300rpm)持续20min实施脂质体再水化以允许形成脂质体。未封装的无细胞反应混合物通过离心(7,000×g，1min，4℃)去除并且使用5％(w/v)葡萄糖反复清洗。最终的沉淀物被重悬在不包括DNA模板和S30裂解物的无细胞反应混合物中。

颗粒中的无细胞蛋白质生成

颗粒在(德国Eppendorf)中使用温和振荡(300rpm)在37℃下培育2hr以使得其内的蛋白质合成成为可能。使用荧光显微镜(Nikon,Melville,NY,USA)在GFP的滤光片下观察生成的sfGFP。使用Zeiss Axiovert200倒置荧光显微镜，监测在颗粒内的蛋白质生成的动力学。显微镜装备有设定为37℃的环境舱并且以30sec的时间间隔观察反应。

图7A显示了使用本无细胞系统生成sfGFP的阳性对照。图7B呈现了DMPC-胆固醇颗粒中sfGFP的生成。图7A呈现了DMPC-胆固醇颗粒中sfGFP的在线生成的明视野与荧光视野的叠加。绿色斑点指示10min后颗粒内sfGFP的生成。

通过在培育期之前添加50mM l,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)(Lipoid)和使用注射器微型挤出机(syringe mini extruder)(Avanti)挤出和施加具有不同的孔径的聚碳酸酯膜( Nuclepore^TMTrack-Etched Membranes)来评价挤出步骤对本无细胞系统的作用。通过使用Tecan Infinite200pro酶标仪(Tecan,Mannedorf,Switzerland)评价生成的蛋白质的量(在培育期后)。如由图5可观察到的，在小的膜孔径——即较小的粒径——处存在活性的降低。

实施例4

使用基于根据本发明的一些实施方式生成的S30裂解物的无细胞系统的治疗性蛋 白合成

假单胞菌外毒素A(PE)

使用本系统——其具有编码作为基因模板的PE(SEQ ID NO:5)的pet3质粒——生成蛋白质。此质粒被进一步编辑以将6个组氨酸残基的序列并入蛋白质(PE-his，SEQ IDNO:6)。纯化的蛋白质被用于与使用本发明的一些实施方式的无细胞系统生成的蛋白质比较。

纯化的PE周质(periplasmatic)生成和纯化

转化有PE(SEQ ID NO:6)质粒的大肠杆菌BL21甘油原液(-80℃)被划线接种在Luria Bertani(LB)¹²平板——其使用1.5％细菌培养用琼脂(Acumedia,NeogenCorporation,MI,USA)固化，补充有100μg ml^-1下的氨苄青霉素(LB-amp100)——上以维持质粒。单个菌落被用于接种新鲜的LB-amp100培养基。培养物在TU-400振荡培养箱(Orbitalshaker incubator,MRC,Holon,Israel)上以250rpm下的振荡在37℃下生长过夜，并且被用作起子以在次日以1:100的起子:培养基比率接种新鲜的Super Broth或Terrific Broth培养基¹³(补充有100μg ml^-1氨苄青霉素)。培养物在37℃下生长至OD₆₀₀≈2.5，在其之后添加1mM的IPTG(Inalco S.P.A.,Milano,Italy)。培养物在30℃下进一步生长过夜，并且然后使用Multifuge离心机(Thermo Scientific)在4℃下以5,000×g离心15min。使用冰冷的20％蔗糖、30mM Tris-HCl(pH 7.4)、1mM EDTA(1:5的缓冲液对原始生长培养基体积)中的无菌玻璃珠轻柔地重悬沉淀物，并且留在冰上15min。细胞然后在6000rpm(FIBRLITE F15-6×l00y转子,Thermo Scientific)和4℃下离心15min。沉淀物被轻柔地重悬在冰冷的无菌双蒸水(1:5的缓冲液对原始生长培养基体积)中，并且留在冰上15min。在冰上培育之后，通过在7000rpm和4℃(FIBRLITE F15-6×l00y转子,Thermo Scientific)下离心细胞持续15min来收集周质(periplasmic)级分。得到的周质级分被调节至20mM Tris-HCl(pH 7.4)。样品然后被施加至Q-琼脂糖阴离子交换柱(HiTrap-1ml,GE Healthcare)并且使用快速蛋白质液相层析(FPLC,AKTA,GE)纯化。用于纯化的缓冲液是20mM Tris HC1pH 7.4(缓冲液A)，其用于平衡和清洗，并且缓冲液A中的1M NaCl(缓冲液B)被用作洗脱缓冲液。在10min内使用0-100％的缓冲液B的梯度，以便纯化PE。收集洗脱的蛋白质并且相对于PBS进行透析。如上面描述的，生成和纯化未转化质粒的大肠杆菌BL21，并且平行的洗脱级分被用作阴性对照。如图11A中显示的，使用SDS-PAGE 12％凝胶和考马斯蓝染色分析所有洗脱级分。由阴离子交换柱在6min后洗脱的蛋白质被用作进一步调查的对照。

PE细胞毒性(cytotoxicitiy)：

通过MTT检验(Sigma-Aldrich)如下测定蛋白质的细胞毒性：1×10⁴个细胞/孔(200μL)4T1细胞在96孔板中接种在RPMI完全培养基(RPMI complete)中持续24h。然后，在37℃下添加多种浓度的纯化的蛋白质(最大10μg/ml)持续24小时。在24小时后，生长培养基被替换为新鲜培养基。检验以如下结束：真空排出生长培养基和在37℃下添加100μL/孔的1mg/mL MTT试剂持续1小时。通过添加100μL/孔的MTT提取缓冲液并且在37℃下过夜培育来溶解MTT-甲晶体。由Tecan Infinite200pro酶标仪(Tecan,Mannedorf,Switzerland)中的570nm和690nm下的吸光度值读数计算细胞成活力。690nm下的吸光度值读数被用作空白。使用下列等式将结果表达为存活细胞关于同时进行的未处理的对照的百分比：

PE对4T1和B16细胞的治疗效力呈现在图11B中。

由本无细胞系统生成的PE的细胞毒性：

如先前描述的，由本无细胞系统生成PE和生成PE的颗粒。如先前描述的，通过添加5-20％无细胞反应物至生长培养基，在37℃下的120min培育后通过MTT检验评价生成的蛋白质的治疗效果。此外，包含纯化的PE的颗粒以与无细胞颗粒生成方法类似的方式生成，另外添加纯化的蛋白质至冻干的脂质体而不是反应混合物。

如下通过蛋白质印迹测定PE的生成。在结束120min培育后，30μL的无细胞反应混合物与SDS-PAGE样品缓冲液(浓缩×4)混合并且在95℃下煮沸10min。然后样品被加样至12％SDS-PAGE凝胶上。在电泳之后，凝胶被印迹至硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上，使用5％脱脂奶粉封闭并且使用稀释至1:5000的抗PE多克隆抗体(Sigma Aldrich,Rehovot,Israel)在室温下探针标记(probed)1小时。在大量清洗后，使用HRP-缀合的匹配的二次抗体(山羊抗兔)(Genscript)培育印迹并且使用Clarity^TMWestern ECL Blotting Substrate(BioRad)显影。使用ImageQuant Las4000,GE将结果可视化。

如在图10A上观察到的，由本无细胞系统生成的PE和在脂质体中封装的PE对4T1细胞呈现出毒性。图10B呈现了使用本无细胞系统的无细胞生成的PE的蛋白质印迹分析。不具有DNA模板的无细胞反应和不具有PE质粒的纯化的BL21被用作阴性对照。

虽然已经连同其具体的实施方式描述了本发明，但很明显许多替代方案、修改和变化将对本领域技术人员显而易见。因此，意欲涵盖落入所附权利要求的精神和宽阔范围的所有这样的替代方案、修改和变化。

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在本文通过引用以其全部并入本说明书，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示通过引用并入本文的相同程度。此外，本申请中任何参考文献的引用或确认不应当解释为承认这样的参考文献是可用作本发明的现有技术。就使用栏目标题而言，它们不应当解释为必然地是限制性的。

序列表

<110> 泰克年研究发展基金会公司

J·沙恩斯基-罗伊特曼

M·格德费得

N·克莱斯基

A·施罗德

Y·肖汉姆

<120> 用于无细胞转录和翻译的方法和试剂盒

<130> 62979

<150> US 62/021,748

<151> 2014-07-08

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 945

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码克隆载体pBS 35S attR-hRluc的核苷酸序列，全序列

<400> 1

atggcttcga aggtgtacga ccccgagcag aggaagagga tgatcaccgg cccccagtgg 60

tgggccaggt gcaagcagat gaacgtgctg gacagcttca tcaactacta cgacagcgag 120

aagcacgccg agaacgccgt gatcttcctg cacggcaacg ccgctagcag ctacctgtgg 180

aggcacgtgg tgccccacat cgagcccgtg gccaggtgca tcatccccga tctgatcggc 240

atgggcaaga gcggcaagag cggcaacggc agctacaggc tgctggacca ctacaagtac 300

ctgaccgcct ggttcgagct cctgaacctg cccaagaaga tcatcttcgt gggccacgac 360

tggggcgcct gcctggcctt ccactacagc tacgagcacc aggacaagat caaggccatc 420

gtgcacgccg agagcgtggt ggacgtgatc gagagctggg acgagtggcc agacatcgag 480

gaggacatcg ccctgatcaa gagcgaggag ggcgagaaga tggtgctgga gaacaacttc 540

ttcgtggaga ccatgctgcc cagcaagatc atgagaaagc tggagcccga ggagttcgcc 600

gcctacctgg agcccttcaa ggagaagggc gaggtgagaa gacccaccct gagctggccc 660

agagagatcc ccctggtgaa gggcggcaag cccgacgtgg tgcagatcgt gagaaactac 720

aacgcctacc tgagagccag cgacgacctg cccaagatgt tcatcgagag cgaccccggc 780

ttcttcagca acgccatcgt ggagggcgcc aagaagttcc ccaacaccga gttcgtgaag 840

gtgaagggcc tgcacttcag ccaggaggac gcccccgacg agatgggcaa gtacatcaag 900

agcttcgtgg agagagtgct gaagaacgag cagagatcta tctag 945

<210> 2

<211> 894

<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌

<400> 2

atgagtaaca agtatagagt tagaaaaaac gtattacatc ttaccgacac ggaaaaaaga 60

gattttgttc gtaccgtgct aatactaaag gaaaaaggga tatatgaccg ctatatagcc 120

tggcatggtg cagcaggtaa atttcatact cctccgggca gcgatcgaaa tgcagcacat 180

atgagttctg cttttttacc gtggcatcgt gaataccttt tacgattcga acgtgacctt 240

cagtcaatca atccagaagt aacccttcct tattgggaat gggaaacgga cgcacagatg 300

caggatccct cacaatcaca aatttggagt gcagatttta tgggaggaaa cggaaatccc 360

ataaaagatt ttatcgtcga taccgggcca tttgcagctg ggcgctggac gacgatcgat 420

gaacaaggaa atccttccgg agggctaaaa cgtaattttg gagcaacgaa agaggcacct 480

acactcccta ctcgagatga tgtcctcaat gctttaaaaa taactcagta tgatacgccg 540

ccttgggata tgaccagcca aaacagcttt cgtaatcagc ttgaaggatt tattaacggg 600

ccacagcttc acaatcgcgt acaccgttgg gttggcggac agatgggcgt tgtgcctact 660

gctccgaatg atcctgtctt ctttttacac cacgcaaatg tggatcgtat ttgggctgta 720

tggcaaatta ttcatcgtaa tcaaaactat cagccgatga aaaacgggcc atttggtcaa 780

aactttagag atccgatgta cccttggaat acaacccctg aagacgttat gaaccatcga 840

aagcttgggt acgtatacga tatagaatta agaaaatcaa aacgttcctc ataa 894

<210> 3

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码超折叠GFP的核苷酸序列

<400> 3

catatgagca aaggagaaga acttttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60

ggtgatgtta atgggcacaa attttctgtc cgtggagagg gtgaaggtga tgctacaaac 120

ggaaaactca cccttaaatt tatttgcact actggaaaac tacctgttcc atggccaaca 180

cttgtcacta ctctgaccta tggtgttcaa tgcttttccc gttatccgga tcacatgaaa 240

cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaacg cactatatct 300

ttcaaagatg acgggaccta caagacgcgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360

gttaatcgta tcgagttaaa aggtattgat tttaaagaag atggaaacat tctcggacac 420

aaactcgagt acaactttaa ctcacacaat gtatacatca cggcagacaa acaaaagaat 480

ggaatcaaag ctaacttcaa aattcgccac aacgttgaag atggttccgt tcaactagca 540

gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600

tacctgtcga cacaatctgt cctttcgaaa gatcccaacg aaaagcgtga ccacatggtc 660

cttcttgagt ttgtaactgc tgctgggatt acacatggca tggatgagct ctacaaagga 720

tcc 723

<210> 4

<211> 2910

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码p50 (NF-kB亚基)的核苷酸序列

<400> 4

atggcagaag atgatccata tttgggaagg cctgaacaaa tgtttcattt ggatccttct 60

ttgactcata caatatttaa tccagaagta tttcaaccac agatggcact gccaacagat 120

ggcccatacc ttcaaatctt agagcaacct aaacagagag gatttcgttt ccgttatgta 180

tgtgaaggcc catcccatgg tggactacct ggtgcctcta gtgaaaagaa caagaagtct 240

taccctcagg tcaaaatctg caactatgtg ggaccagcaa aggttattgt tcagttggtc 300

acaaatggaa aaaatatcca cctgcatgcc cacagcctgg tgggaaaaca ctgtgaggat 360

gggatctgca ctgtaactgc tggacccaag gacatggtgg tcggcttcgc aaacctgggt 420

atacttcatg tgacaaagaa aaaagtattt gaaacactgg aagcacgaat gacagaggcg 480

tgtataaggg gctataatcc tggactcttg gtgcaccctg accttgccta tttgcaagca 540

gaaggtggag gggaccggca gctgggagat cgggaaaaag agctaatccg ccaagcagct 600

ctgcagcaga ccaaggagat ggacctcagc gtggtgcggc tcatgtttac agcttttctt 660

ccggatagca ctggcagctt cacaaggcgc ctggaacccg tggtatcaga cgccatctat 720

gacagtagtg aagcccccaa tgcatccaac ttgaaaattg taagaatgga caggacagct 780

ggatgtgtga ctggagggga ggaaatttat cttctttgtg acaaagttca gaaagatgac 840

atccagattc gattttatga agaggaagaa aatggtggag tctgggaagg atttggagat 900

ttttccccca cagatgttca tagacaattt gccattgtct tcaaaactcc aaagtataaa 960

gatattaata ttacaaaacc agcctctgtg tttgtccagc ttcggaggaa atctgacttg 1020

gaaactagtg aaccaaaacc tttcctctac tatcctgaaa tcaaagataa agaagaagtg 1080

cagaggaaac gtcagaagct catgcccaat ttttcggata gtttcggcgg tggtagtggt 1140

gccggagctg gaggcggagg catgtttggt agtggcggtg gaggaggggg cactggaagt 1200

acaggtccag ggtatagctt cccacactat ggatttccta cttatggtgg gattactttc 1260

catcctggaa ctactaaatc taatgctggg atgaagcatg gaaccatgga cactgaatct 1320

aaaaaggacc ctgaaggttg tgacaaaagt gatgacaaaa acactgtaaa cctctttggg 1380

aaagttattg aaaccacaga gcaagatcag gagcccagcg aggccaccgt tgggaatggt 1440

gaggtcactc taacgtatgc aacaggaaca aaagaagaga gtgctggagt tcaggataac 1500

ctctttctag agaaggctat gcagcttgca aagaggcatg ccaatgccct tttcgactac 1560

gcggtgacag gagacgtgaa gatgctgctg gccgtccagc gccatctcac tgctgtgcag 1620

gatgagaatg gggacagtgt cttacactta gcaagcagcc accttcattc tcaacttgtg 1680

agggatctac tagaagtcac atctggtttg atttctgatg acattatcaa catgagaaat 1740

gatctgtacc agacgccctt gcacttggca gtgatcacta agcaggaaga tgtggtggag 1800

gatttgctga gggctggggc cgacctgagc cttctggacc gcttgggtaa ctctgttttg 1860

cacctagctg ccaaagaagg acatgataaa gttctcagta tcttactcaa gcacaaaaag 1920

gcagcactac ttcttgacca ccccaacggg gacggtctga atgccattca tctagccatg 1980

atgagcaata gcctgccatg tttgctgctg ctggtggccg ctggggctga cgtcaatgct 2040

caggagcaga agtccgggcg cacagcactg cacctggctg tggagcacga caacatctca 2100

ttggcaggct gcctgctcct ggagggtgat gcccatgtgg acagtactac ctacgatgga 2160

accacacccc tgcatatagt agctgggaga gggtccacca ggctggcagc tcttctcaaa 2220

gcagcaggag cagatcccct ggtggagaac tttgagcctc tctatgacct ggatgactct 2280

tgggaaaatg caggagagga tgaaggagtt gtgcctggaa ccacgcctct agatatggcc 2340

accagctggc aggtatttga catattaaat gggaaaccat atgagccaga gtttacatct 2400

gatgatttac tagcacaagg agacatgaaa cagctggctg aagatgtgaa gctgcagctg 2460

tataagttac tagaaattcc tgatccagac aaaaactggg ctactctggc gcagaaatta 2520

ggtctgggga tacttaataa tgccttccgg ctgagtcctg ctccttccaa aacacttatg 2580

gacaactatg aggtctctgg gggtacgatc agagagctgg tggaggccct gagacaaatg 2640

ggctacaccg aagcaattga agtgatccag gcagcctcca gcccagtgaa gaccacctct 2700

caggcccact cgctgcctct ctcgcctgcc tccacaaggc agcaaataga cgagctccga 2760

gacagtgaca gtgtctgcga cacgggcgtg gagacatcct tccgcaaact cagctttacc 2820

gagtctctga ccagtggtgc ctcactgcta actctcaaca aaatgcccca tgattatggg 2880

caggaaggac ctctagaagg caaaatttag 2910

<210> 5

<211> 2910

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码假单胞菌外毒素A (PE)的Pet3质粒的核苷酸序列

<400> 5

atggcagaag atgatccata tttgggaagg cctgaacaaa tgtttcattt ggatccttct 60

ttgactcata caatatttaa tccagaagta tttcaaccac agatggcact gccaacagat 120

ggcccatacc ttcaaatctt agagcaacct aaacagagag gatttcgttt ccgttatgta 180

tgtgaaggcc catcccatgg tggactacct ggtgcctcta gtgaaaagaa caagaagtct 240

taccctcagg tcaaaatctg caactatgtg ggaccagcaa aggttattgt tcagttggtc 300

acaaatggaa aaaatatcca cctgcatgcc cacagcctgg tgggaaaaca ctgtgaggat 360

gggatctgca ctgtaactgc tggacccaag gacatggtgg tcggcttcgc aaacctgggt 420

atacttcatg tgacaaagaa aaaagtattt gaaacactgg aagcacgaat gacagaggcg 480

tgtataaggg gctataatcc tggactcttg gtgcaccctg accttgccta tttgcaagca 540

gaaggtggag gggaccggca gctgggagat cgggaaaaag agctaatccg ccaagcagct 600

ctgcagcaga ccaaggagat ggacctcagc gtggtgcggc tcatgtttac agcttttctt 660

ccggatagca ctggcagctt cacaaggcgc ctggaacccg tggtatcaga cgccatctat 720

gacagtagtg aagcccccaa tgcatccaac ttgaaaattg taagaatgga caggacagct 780

ggatgtgtga ctggagggga ggaaatttat cttctttgtg acaaagttca gaaagatgac 840

atccagattc gattttatga agaggaagaa aatggtggag tctgggaagg atttggagat 900

ttttccccca cagatgttca tagacaattt gccattgtct tcaaaactcc aaagtataaa 960

gatattaata ttacaaaacc agcctctgtg tttgtccagc ttcggaggaa atctgacttg 1020

gaaactagtg aaccaaaacc tttcctctac tatcctgaaa tcaaagataa agaagaagtg 1080

cagaggaaac gtcagaagct catgcccaat ttttcggata gtttcggcgg tggtagtggt 1140

gccggagctg gaggcggagg catgtttggt agtggcggtg gaggaggggg cactggaagt 1200

acaggtccag ggtatagctt cccacactat ggatttccta cttatggtgg gattactttc 1260

catcctggaa ctactaaatc taatgctggg atgaagcatg gaaccatgga cactgaatct 1320

aaaaaggacc ctgaaggttg tgacaaaagt gatgacaaaa acactgtaaa cctctttggg 1380

aaagttattg aaaccacaga gcaagatcag gagcccagcg aggccaccgt tgggaatggt 1440

gaggtcactc taacgtatgc aacaggaaca aaagaagaga gtgctggagt tcaggataac 1500

ctctttctag agaaggctat gcagcttgca aagaggcatg ccaatgccct tttcgactac 1560

gcggtgacag gagacgtgaa gatgctgctg gccgtccagc gccatctcac tgctgtgcag 1620

gatgagaatg gggacagtgt cttacactta gcaagcagcc accttcattc tcaacttgtg 1680

agggatctac tagaagtcac atctggtttg atttctgatg acattatcaa catgagaaat 1740

gatctgtacc agacgccctt gcacttggca gtgatcacta agcaggaaga tgtggtggag 1800

gatttgctga gggctggggc cgacctgagc cttctggacc gcttgggtaa ctctgttttg 1860

cacctagctg ccaaagaagg acatgataaa gttctcagta tcttactcaa gcacaaaaag 1920

gcagcactac ttcttgacca ccccaacggg gacggtctga atgccattca tctagccatg 1980

atgagcaata gcctgccatg tttgctgctg ctggtggccg ctggggctga cgtcaatgct 2040

caggagcaga agtccgggcg cacagcactg cacctggctg tggagcacga caacatctca 2100

ttggcaggct gcctgctcct ggagggtgat gcccatgtgg acagtactac ctacgatgga 2160

accacacccc tgcatatagt agctgggaga gggtccacca ggctggcagc tcttctcaaa 2220

gcagcaggag cagatcccct ggtggagaac tttgagcctc tctatgacct ggatgactct 2280

tgggaaaatg caggagagga tgaaggagtt gtgcctggaa ccacgcctct agatatggcc 2340

accagctggc aggtatttga catattaaat gggaaaccat atgagccaga gtttacatct 2400

gatgatttac tagcacaagg agacatgaaa cagctggctg aagatgtgaa gctgcagctg 2460

tataagttac tagaaattcc tgatccagac aaaaactggg ctactctggc gcagaaatta 2520

ggtctgggga tacttaataa tgccttccgg ctgagtcctg ctccttccaa aacacttatg 2580

gacaactatg aggtctctgg gggtacgatc agagagctgg tggaggccct gagacaaatg 2640

ggctacaccg aagcaattga agtgatccag gcagcctcca gcccagtgaa gaccacctct 2700

caggcccact cgctgcctct ctcgcctgcc tccacaaggc agcaaataga cgagctccga 2760

gacagtgaca gtgtctgcga cacgggcgtg gagacatcct tccgcaaact cagctttacc 2820

gagtctctga ccagtggtgc ctcactgcta actctcaaca aaatgcccca tgattatggg 2880

caggaaggac ctctagaagg caaaatttag 2910

<210> 6

<211> 1900

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码具有组氨酸标签的假单胞菌外毒素A的核苷酸序列

<400> 6

ctagaaataa agaaggagat ataccatggg cagcagccat catcatcatc atcacagcag 60

cgccgaagaa gctttcgacc tctggaacga atgcgccaaa gcctgcgtgc tcgacctcaa 120

ggacggcgtg cgttccagcc gcatgagcgt cgacccggcc atcgccgaca ccaacggcca 180

gggcgtgctg cactactcca tggtcctgga gggcggcaac gacgcgctca agctggccat 240

cgacaacgcc ctcagcatca ccagcgacgg cctgaccatc cgcctcgaag gcggcgtcga 300

gccgaacaag ccggtgcgct acagctacac gcgccaggcg cgcggcagtt ggtcgctgaa 360

ctggctggta ccgatcggcc acgagaagcc ctcgaacatc aaggtgttca tccacgaact 420

gaacgccggc aaccagctca gccacatgtc gccgatctac accatcgaga tgggcgacga 480

gttgctggcg aagctggcgc gcgatgccac cttcttcgtc agggcgcacg agagcaacga 540

gatgcagccg acgctcgcca tcagccatgc cggggtcagc gtggtcatgg cccagaccca 600

gccgcgccgg gaaaagcgct ggagcgaatg ggccagcggc aaggtgttgt gcctgctcga 660

cccgctggac ggggtctaca actacctcgc ccagcaacgc tgcaacctcg acgatacctg 720

ggaaggcaag atctaccggg tgctcgccgg caacccggcg aagcatgacc tggacatcaa 780

acccacggtc atcagtcatc gcctgcactt tcccgagggc ggcagcctgg ccgcgctgac 840

cgcgcaccag gcttgccacc tgccgctgga gactttcacc cgtcatcgcc agccgcgcgg 900

ctgggaacaa ctggagcagt gcggctatcc ggtgcagcgg ctggtcgccc tctacctggc 960

ggcgcggctg tcgtggaacc aggtcgacca ggtgatccgc aacgccctgg ccagccccgg 1020

cagcggcggc gacctgggcg aagcgatccg cgagcagccg gagcaggccc gtctggccct 1080

gaccctggcc gccgccgaga gcgagcgctt cgtccggcag ggcaccggca acgacgaggc 1140

cggcgcggcc aacgccgacg tggtgagcct gacctgcccg gtcgccgccg gtgaatgcgc 1200

gggcccggcg gacagcggcg acgccctgct ggagcgcaac tatcccactg gcgcggagtt 1260

cctcggcgac ggcggcgacg tcagcttcag cacccgcggc acgcagaact ggacggtgga 1320

gcggctgctc caggcgcacc gccaactgga ggagcgcggc tatgtgttcg tcggctacca 1380

cggcaccttc ctcgaagcgg cgcaaagcat cgtcttcggc ggggtgcgcg cgcgcagcca 1440

ggacctcgac gcgatctggc gcggtttcta tatcgccggc gatccggcgc tggcctacgg 1500

ctacgcccag gaccaggaac ccgacgcacg cggccggatc cgcaacggtg ccctgctgcg 1560

ggtctatgtg ccgcgctcga gcctgccggg cttctaccgc accagcctga ccctggccgc 1620

gccggaggcg gcgggcgagg tcgaacggct gatcggccat ccgctgccgc tgcgcctgga 1680

cgccatcacc ggccccgagg aggaaggcgg gcgcctggag accattctcg gctggccgct 1740

ggccgagcgc accgtggtga ttccctcggc gatccccacc gacccgcgca acgtcggcgg 1800

cgacctcgac ccgtccagca tcccggacca agaacaggcg atcagcgccc tgccggacta 1860

cgccagccag cccgggcaac cgccgcgcga ggacctgtag 1900

Claims (35)

1.用于无细胞RNA或蛋白质合成的方法，所述方法包括在反应混合物中合成感兴趣的RNA或蛋白质，所述反应混合物包括：

编码所述感兴趣的RNA或蛋白质的模板DNA；和

已经被基因修饰以表达异源性RNA聚合酶的蛋白酶-缺陷细菌细胞的生物提取物，所述提取物进一步包括对所述蛋白质的转录和翻译必需的组分。

2.生成用于无细胞蛋白质合成的反应混合物的方法，所述方法包括：

(a)使已经被基因修饰以表达异源性RNA聚合酶的蛋白酶-缺陷细菌细胞的培养物在允许所述RNA聚合酶的表达的条件下生长；

(b)使所述蛋白酶-缺陷细菌细胞破裂以获得包括基因组DNA和破碎的细胞的细胞制剂；所述破裂在保持对所述蛋白质的转录和翻译必需的组分的功能性的条件下；

(c)去除所述基因组DNA；和

(d)在所述去除之后冷冻所述细胞制剂。

3.权利要求2所述的方法，进一步包括在脂囊泡中封装所述细胞制剂。

4.权利要求1或2所述的方法，其中由质粒表达所述RNA聚合酶。

5.权利要求2所述的方法，其中使用压力均质器进行所述破裂。

6.权利要求2所述的方法，不包括在所述破裂之后透析所述细胞制剂。

7.权利要求2-6中任一项所述的方法，不包括在步骤(a)之后和在步骤(b)之前冷冻和解冻所述细菌细胞。

8.权利要求2-7中任一项所述的方法，不包括向所述细胞制剂添加蛋白酶抑制剂。

9.权利要求2-8中任一项所述的方法，其中所述去除包括在低于30,000×g下离心。

10.组合物，其包括已经被基因修饰以表达异源性RNA聚合酶的蛋白酶-缺陷细菌细胞的提取物，所述提取物包括对转录和翻译必需的组分并且不含基因组DNA。

11.用于无细胞RNA或蛋白质合成的试剂盒，其包括已经被基因修饰以表达异源性RNA聚合酶的蛋白酶-缺陷细菌细胞的提取物，所述提取物包括对转录和翻译必需的组分。

12.权利要求11所述的试剂盒，进一步包括如下中的至少一个：

(i)预成形为或能够形成脂囊泡的脂质；

(ii)对照DNA模板；

(iii)氨基酸；

(iv)rNTP；

(v)H₂O；

(vi)盐；和

(vii)ATP-再生系统。

13.权利要求10所述的组合物或权利要求11-12所述的试剂盒，其中所述提取物包括编码所述RNA聚合酶的质粒。

14.权利要求12所述的试剂盒，其中所述对照DNA模板与所述提取物单独地包装。

15.权利要求12所述的试剂盒，其中所述(i)-(vii)中的每个单独地包装。

16.权利要求12所述的试剂盒，其中所述(i)-(vii)中的至少两个单独地包装。

17.权利要求1-9中任一项所述的方法或权利要求11-16中任一项所述的试剂盒，其中所述对转录和翻译必需的组分选自tRNA、核糖体和转录因子。

18.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述生物提取物以20-40％(v/v)的浓度存在于所述反应混合物。

19.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述生物提取物以30％(v/v)的浓度存在于所述反应混合物。

20.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述反应混合物进一步包括氨基酸、rNTP、H₂O、盐和ATP-再生系统。

21.权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包括聚乙二醇。

22.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述模板DNA是环状DNA。

23.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述模板DNA包括可操作地连接至编码所述RNA或蛋白质的核酸序列的所述RNA聚合酶的启动子。

24.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶是依赖于DNA的RNA聚合酶。

25.权利要求24所述的方法，其中所述依赖于DNA的RNA聚合酶是噬菌体RNA聚合酶。

26.权利要求25所述的方法，其中所述噬菌体RNA聚合酶是T7或SP6RNA聚合酶。

27.权利要求26所述的方法，其中由pAR1219编码所述T7。

28.权利要求20所述的方法，其中所述盐选自钾、镁和铵。

29.权利要求1、20和28中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包括10-20mM镁盐、40-60mM钾盐和100-200nM铵盐。

30.权利要求1-29中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述反应混合物如表2中列举的。

31.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述合成以分批、连续流动、或半连续流动进行。

32.权利要求1-9中任一项所述的方法或权利要求11-16中任一项所述的试剂盒，其中所述蛋白酶-缺陷细菌细胞选自BL21(DE3)、BL21(DE3)CodonPlusRIL和其变体。

33.权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质是膜蛋白。

34.权利要求1-33中任一项所述的方法或试剂盒，其中所述RNA是沉默剂。

35.权利要求3或12所述的方法或试剂盒，其中所述脂囊泡包括脂质体。