CN106574275A - 用于木素纤维素材料的水解方法,其中水解产物用于微生物水解酶的生产 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于木素纤维素材料的自给自足式水解的方法。在另一个方面,本发明涉及用于生产有机产物的方法和根据该方法产生的有机产物。
Description
本发明涉及用于木素纤维素材料的自给自足式水解的方法。在另一个方面,本发明涉及用于生产有机产物的方法和根据该方法产生的有机产物。
由于有限的矿物油来源以及减少CO2排放的需要,化学工业寻求用于制造化学商品如液体燃料和基础化学品的更加可持续的生产途径。该策略的一部分聚焦于将木素纤维素生物质转化成多种化学品或燃料,如乙醇。木素纤维素生物质含有的主要组分有纤维素(~25-40重量/重量%d.s.)、半纤维素(~15-25重量/重量%d.s.)和木质素(~15-30重量/重量%d.s.),并且含有少量的其他碳水化合物、蜡、蛋白质、和无机化合物。在多种形式的植物生物质中,从任何林业与农业废弃物流(如木材残渣和谷物禾秆)获得的木素纤维素生物质由于它们的可得性、低成本和对环境无害的生产而特别适合于转化成化学和燃料商品。此外,对采用木素纤维素原料的生产方法进行的生命周期分析表明与基于其他原料的方法相比,温室气体排放减少。
已存在将木素纤维素生物质转化成乙醇和其他基础化学品的多种可能方法的描述(Pejo等,2008)。为了在工业规模上实现这些方法,特别期望将可再生原料中含有的最大量的能量、碳和质量含量转移到最终产品。目前,所描述的转化方法均未最大程度地实现这一点。
木素纤维素材料(如禾秆)到增值产品(如乙醇)的生物技术转化的示例性单元操作是:机械方式减小尺寸和/或物理化学预处理、酶水解、发酵和产物回收。为了确定最大方法效率,在酶水解单元的过程中必须将最大量的多糖转化成可溶性糖。
对于工业规模的纤维素乙醇生产,关键障碍仍然是用于实现高固体浓度的经预处理的木素纤维素的有效酶水解的成本支出。
因此,已经确定纤维素部分的水解是木素纤维素转化成乙醇的主要障碍。目前,有效的生物质水解所需要的酶成本和性能是主要瓶颈。
经预处理生物质浆料分解成可发酵单体糖可以通过酸或酶催化水解而实现。酶水解与类似的化学(如基于酸的)方法相比更具选择性且能量消耗少,因此提供了更加有利的方法经济性和发酵期间潜在的更高乙醇收率。
将聚合糖如纤维素和半纤维素转化成己糖(即葡萄糖)和戊糖(即木糖)单体的适合的酶系统通常含有纤维素酶、半纤维素酶和β-葡糖苷酶活性。含有纤维素酶和β-葡糖苷酶活性的酶系统通常在真菌(例如,木霉属和/或曲霉属)的浸没液体培养基中产生。真菌生物质的残余物通常被从发酵液分离和丢弃。然后发酵液被浓缩、稳定化和配制以使所得酶产物被运输。
根据Kristensen等(2009),生物质的酶水解通常在10-20重量/重量%的较低固体含量下进行。高于15重量/重量%的固体含量通常导致单体糖收率显著损失。这种作用是由于高固体含量浆料的均匀混合方面的问题而产生的,由导致酶分布不均匀。此外,酶水解期间所释放的最终产物如纤维二糖与葡萄糖的积累也可以导致纤维素酶与β-葡糖苷酶活性的内在抑制(Xiao等,2004a)。
Rao等(1985)说明了使用完整的真菌发酵浆料以有效水解纤维素底物。然而,人工培养基被用于酶生产,其不允许使水解酶的生产适合于特定原料和/或预处理选项,因此酶生产的效力相当低。Tolan(Clean Techn Environ Policy 3(2002)339-345)在“Iogen’sprocess for producing ethanol from cellulosic biomass”中描述了使用来自水解的粗肉汤作为用于酶生产的培养基以节约方法成本。Rao等和Tolan公开的方法的另一个缺陷是对分泌酶活性的限制,因为没有采取任何措施来促进释放非分泌性酶或细胞表面结合酶。
前述用于降解生物质的常规技术要么效率低,要么依赖耗时且耗成本地加入适合于降解特定生物质的商业化的、单独产生的酶或酶混合物。而且,使用粗浆料或肉汤也不可以克服这些缺陷,因为其不光是导致期望地提供真菌发酵所必需的糖,还会不可避免地使多种不期望的抑制性和/或毒性物质进入到发酵过程中。因此,使用廉价发酵培养基的优势将被酶生产的效率的严重缺陷所抵消。
在EP2471940中,描述了有效的木素纤维素水解与酶生产的一体化方法。在该方法中,用于酶发酵的培养基由高量的悬浮固体组成。为了进一步改善经济性,该发明的目的是开发这样一种木素纤维素水解与酶发酵方法,其使用最小化量的悬浮固体与抑制剂,然而可溶性碳水化合物的量进一步提高。
因此,本发明的目的是提供用于降解生物质如木素纤维素生物质的改善的高效方法。
发明内容
本发明的发明人现出人意料地发现本发明的这个目的可以通过一种用于含木素纤维素材料的自给自足式酶水解的方法实现,其包括以下步骤:
(a)使含木素纤维素材料在预处理装置中进行预处理;
(b)使步骤a)的经预处理的含木素纤维素材料与至少一种属于水解酶类的酶在水解容器中接触以形成水解产物;
(c)分离所述水解产物,并随后将所述水解产物分成两部分(i)和(ii),其中部分(i)被引导至培养容器;
(d)用至少一种能够产生至少一种属于水解酶类的酶的微生物和/或真菌对所述水解产物的部分(i)进行发酵;以及
(e)将步骤d)的经发酵的水解产物再引导至步骤b)的所述水解容器;
其中处理所述经预处理的含木素纤维素材料和/或水解产物以除去至少一种对至少一种酶和/或至少一种微生物和/或真菌具有抑制性的物质。
本发明的用于酶水解含木素纤维素材料的方法是特别有利的,因为其是自给自足式的,并且也是高度有效的,因为将整个过程的水解产物并入酶生产步骤(d)中使得能够经济地生产,并且能够直接将最大量的合适的水解酶现场并入,由此产生最大量的可溶性碳水化合物。而且,在至少一个方法阶段除去抑制性物质将使得不仅可以自给自足地运行,而且可以高效率连续运行的方法成为可能,因为水解酶生产不会被不期望的物质延缓或抑制,由此产生进一步的经济优势。
在本发明中,术语“含木素纤维素材料”理解为包括全部种类的本领域技术人员已知含有木素纤维素的材料。术语“含木素纤维素材料”、“含木素纤维素的生物质”、“木素纤维素材料”和“木素纤维素生物质”在本发明中应理解为是同义词。根据本发明特别优选的含木质纤维的素材料包括木材、谷物禾秆和/或外壳、甘蔗渣、燕麦外壳、柳枝稷、纤维素、粗纸浆(从纸浆和纸生产获得)及其混合物。替代性来源或额外组分可以包括以下组分中的一种或多种:纯化纤维素、纸浆、乳清、糖蜜或糖,如葡萄糖和乳糖。在一个优选实施方式中,含木素纤维素材料含有至少25重量%、优选至少40重量%、更优选至少70重量%、甚至更优选至少80重量%、最优选至少90重量%的木素纤维素。应理解,含木素纤维素材料也可以包含其他化合物,例如蛋白质材料、淀粉、糖,如可发酵糖和/或不可发酵糖。
在本发明中,术语“酶水解”理解为其中适合的酶将聚合糖如纤维素和半纤维素转化成己糖(即葡萄糖)和/或戊糖(即木糖)单体的过程。
在本发明中,术语“预处理”理解为一种从纤维素至少部分地除去和分离半纤维素并且破坏及除去木质素鞘的过程,从而降低纤维素结晶度,并由此增加纤维素的可接触表面积和/或增加纤维素的孔径。预处理优先使含木素纤维素材料的戊糖部分移动,同时其增强固体含纤维素部分的可消化性。
适合于根据本发明步骤(a)预处理含木素纤维素材料的方法包括本领域技术人员已知的任意种类的机械、生物、化学和/或物理预处理方法。在一个优选实施方式中,预处理方法选自机械粉碎、酸和/或碱处理、湿氧化、pH受控的水热解和/或蒸汽爆破的方法。
根据本发明的“蒸汽爆破”优选包括在不存在或存在酸(如H2SO4、HCl、H3PO4)或碱/碱性(即NH4OH、NaOH、KOH、石灰)催化剂的情况下,在60至350℃、优选80至300℃、特别优选100至250℃、最优选110至220℃的温度下加压水热处理含木素纤维素材料,所述催化剂可以以0.01至15%(重量/重量)、优选0.05至12.5%(重量/重量)、更优选0.1至10%(重量/重量)、最优选0.25至7.5%的浓度加入。在本发明的一个优选实施方式中,压力优选选自1至100巴、优选2至50巴、还优选3至25巴、最优选5至15巴。蒸汽爆破过程中的反应时间需要选自10秒至2小时、优选1分钟至1.5小时、最优选5分钟至1小时,以提供生物质组分的有效转化,为酶水解过程做准备。在一个特别优选的实施方式中,含木素纤维素材料的“机械粉碎”预处理在蒸汽爆破预处理之前或在蒸汽爆破预处理的过程中进行,其中机械粉碎选自机械加工、研磨、切块、破碎、切割、辐照、碾磨及其组合。
根据本发明的“酸处理”优选包括连续的稀酸和/或弱酸处理,如,使用硫酸或者另外的有机酸如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或其混合物的处理。其他酸也可以使用。根据本发明的“弱酸处理”理解为在1至5的pH、优选2至3的pH下进行(相较于含木素纤维素材料的处理)。在一个优选实施方式中,酸以0.01至15重量%(重量/重量)、优选0.05至12.5重量%(重量/重量)、更优选0.1至10重量%(重量/重量)、最优选0.25至7.5重量%的浓度加入。酸优选是硫酸。酸可以在120至280℃、优选135至225℃、最优选150至200℃范围内的温度下与含木素纤维素材料接触1至60分钟、优选2至30分钟、最优选5至15分钟。强酸如硫酸的加入可以在特别优选的实施方式中应用以除去半纤维素。
根据本发明的“化学处理”也涉及使用H2O2、臭氧、路易斯酸、FeCl3、(Al)2SO4的醇水溶液、甘油、二氧六环、酚、乙二醇、NaOH、Na2CO3和/或氨对含木素纤维素材料进行处理。与上文关于酸预处理提到的条件类似地选择优选的浓度、温度和持续时间。
根据本发明的“湿氧化预处理”包括使用氧化剂如基于亚硫酸盐的氧化剂。
术语“机械粉碎”是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木素纤维素材料分离和/或释放的任何机械处理。机械粉碎优选选自机械加工、研磨、切块、破碎、切割、辐照、碾磨如干磨、湿磨和振动性球磨及其组合。
根据本发明的“生物处理”是指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木素纤维素材料分离和/或释放的任何生物处理。生物处理技术可以包括施用溶解木质素的微生物,如放线菌(例如链霉菌属菌株)、白杆真菌(white rod fungi)。
适合于本发明方法的预处理方法在本领域技术人员已知的适合装置中进行。适合进行化学预处理的装置可以是任何种类的容器,如间歇式反应器。适合进行蒸汽爆破的装置可以是任何种类的容器,如间歇式反应器,但也可以在螺杆反应器,优选连续螺杆反应器中进行。
在一个优选实施方式中,经预处理的含木素纤维素材料的固体含量为高达75%(重量/重量)、优选25至65%(重量/重量),特别优选40至50%(重量/重量)。
在本发明方法中,经预处理的含木素纤维素材料然后与至少一种属于水解酶类的酶接触以使经预处理的含木素纤维素材料分解成可发酵糖,如单体己糖(即葡萄糖)和戊糖(即木糖)的糖类。接触可以如适合本发明目的地通过本领域技术人员已知的任何方法进行。
通过酶水解所述经预处理的含木素纤维素材料形成的水解产物优选具有高可发酵糖含量,优先地是约5至20%(重量/体积)。该上下文中的糖含量理解为所有的戊糖类和己糖类的含量。在本发明的一个优选实施方式中,水解产物具有8至12.5%(重量/体积)的糖含量。在本发明的一个更优选的实施方式中,水解产物还含有额外的营养物(即,蛋白质类、盐类和更高级的糖类,如寡糖)。
根据本发明的步骤(b)的接触优选在以下条件下进行:总的酶加料量占原料的0.05至10%(重量/重量)、优选占原料的0.1至5%(重量/重量)、进一步优选占原料的0.15至4%(重量/重量)、特别优选占原料的0.2至3.5%(重量/重量)。按照加料方案和所应用的酶系统的比活组成,生物质在40至60℃下水解1至7天、优选在45至55℃下水解18至96天。根据本发明的步骤(b)的接触优选在3至8范围内的pH下、优选在4至6的pH下、特别是在4.5至5.5的pH下进行。在本发明的一个特别优选的实施方式中,经预处理谷物禾秆的间歇式或分批补料式水解在酶加料量为0.25-0.8%(重量/重量%)原料、补充或不补充额外的β-葡糖苷酶的情况下、在47至53℃温度下、在72小时内进行。出人意料地,即使使用低的酶加料量方案,仍可以获得相对于所述原料中含有的总糖高于70%(重量/重量)的水解收率。
根据本发明的步骤(b)的接触在水解容器内进行。适合的容器是本领域技术人员已知的,并且优选地选自间歇式和分批补料式反应器。
在本发明中,术语“属于水解酶类的酶”应理解为包括能够水解化学键的任何酶。属于水解酶类的酶在EC酶分类号中归类为EC3。在一个优选实施方式中,根据本发明的至少一种属于水解酶类的酶的酶活性包括一种或多种选自以下的酶的活性:外切和内切纤维素酶(即,纤维二糖水解酶(CBH)I、II;内切葡聚糖酶(EG)I-IV;β-葡糖苷酶(BGL)),外切和内切半纤维素酶(即,木聚糖酶、木糖苷酶、木二糖酶(xylobiase)、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖岩藻糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、半乳糖酶和半乳糖苷酶)和酯酶。在一个优选实施方式中,根据本发明的至少一种属于水解酶类的酶具有选自以下的一种或多种活性:纤维二糖水解酶I型或II型(CBH I或CBH II)、内切葡聚糖酶I、II、III或IV型(EGI、EGII、EGIII、EGIV)、β-葡糖苷酶(BGL)、酯酶、外切半纤维素酶和内切半纤维素酶。甚至更优选的是,外切半纤维素酶和内切半纤维素酶优先选自木聚糖酶、木糖苷酶、木二糖酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯糖岩藻糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、半乳糖酶和半乳糖苷酶。
根据本发明方法的步骤(c),水解产物然后被从水解容器分离并且随后被分成两个部分(i)和(ii)。所述的分离优选当原始原料中存在的总糖的至少70%、优选至少75%、最优选至少80%被释放时进行。在一个优选实施方式中,水解产物的部分(i)与部分(ii)的比率选自0.01至1、优选0.02至0.5、还优选0.04至0.25、最优选0.5至0.1的范围。
根据本发明方法的步骤(c)的分离可以如适合本发明目的地通过本领域技术人员已知的任何方法进行。在一个优选实施方式中,分离通过固液分离进行,如过滤、压榨、膜分离、浮选、沉淀、倾析和离心或其组合。优选基于过滤器的固液分离。进一步特别优选使用压滤机。过滤之后的残余物应当具有20%(重量/重量)、优选30%(重量/重量)、特别优选40%(重量/重量)、最优选50%(重量/重量)固体含量的最小固体含量。用于根据步骤(c)的分离的另一种方法是通过例如使用倾析器进行的离心。
根据本发明方法的步骤(c),水解产物的部分(i)然后被引导至培养容器。适合的容器是本领域技术人员已知的,并且优选选自间歇式和分批补料式反应器。培养容器优选配有搅拌器和充气装置。在本发明的另一个优选实施方式中,一部分经预处理的含木素纤维素材料可以直接加入到培养容器中。所加入的经预处理的含木素纤维素材料的优选量为1至35%(重量/重量,相对于培养材料的总重量)、优选5至30%(重量/重量,相对于培养材料的总重量)、最优选10至20%(重量/重量,相对于培养材料的总重量)。
根据本发明方法的步骤(d),水解产物的部分(i)然后用至少一种能够产生至少一种属于水解酶类的酶的微生物进行发酵。
“至少一种能够产生至少一种属于水解酶类的酶的微生物”优选选自以下种:不动杆菌属、土壤杆菌属、杆菌属、霍尔德氏菌属、梭菌属、Caldicellulosiruptor属、Cellvibrio属、盐杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、黄单胞菌属、Thermobifida属、Pyrochoccus属、Sulphobolus属、Staphylothermus属和Thermococcus属。
“至少一种能够产生至少一种属于水解酶类的酶的真菌”优选选自以下种:木霉属、肉座菌属、曲霉属、毛壳属、金孢霉属、镰孢属、腐质霉属、Orpinomyces属、青霉属、Phanerochaete属、Piromyces属、篮状菌属、栓菌属和木霉属,或其各自的全形。特别优选选自木霉属和篮状菌属的真菌,但是一种或多种真菌的组合,以及一种或多种真菌和/或微生物的组合也是可以的。
在本发明的一个优选实施方式中,酶生产用丝状真菌里氏木霉(无性型:Hypocreajecornia)的酶高产菌株实现。
根据本发明方法的步骤(d)的发酵优选在能量输入为150至1900W/m3、更优选500至1500W/m3的恒定搅拌下,优选在2.5至8、优选3.0至7、特别优选3.5至6.0的pH下,优选在15至70℃、优选20至55℃、特别优选25至35℃的温度下,在氧受控条件下,进行1小时至14天、优选10小时至7天、进一步优选24小时至5天。平均溶解氧水平优选选自0.01%至80%、优选0.1%至50%、特别优选1%至30%、最优选3%至15%。在一个特别优选的实施方式中,溶解氧水平受到搅拌器或压缩空气流或内部反应器压力或者这些措施中的两种或三种的组合控制。
在一个优选实施方式中,根据本发明方法的步骤(d)的发酵过程中可溶性糖的浓度低于10%(重量/体积)、进一步优选低于8%(重量/体积)、特别优选低于5%(重量/体积)。水解产物的部分(i)优选通过进料被引导至培养容器。根据本发明的“进料”表示水解产物的部分(i)随后被加入到培养容器中。如本发明中所用,“进料速率”定义为以m3/小时计量的转移到培养容器的水解产物的体积。本领域技术人员能够选择适合于特定方法的进料速率。水解产物的进料优选在本发明方法的步骤(d)过程中以恒定进料速率或可变进料速率或二者的组合进行。水解产物的进料优选在本发明方法的步骤(d)过程中连续进行或者以时间间隔进行。优选的间隔是——例如,相对于总共100小时发酵时间——例如,60小时的恒定进料,然后使恒定进料停止直到100小时发酵时间的终点。另一个可能的实例是以20小时的恒定进料开始,其在20小时后中断,并且一旦水解产物中的可发酵糖已经完全发酵就立即恢复。
在发酵之后,根据本发明方法的步骤(e),经发酵水解产物被再引导至水解容器。根据本发明方法的步骤(e)的再引导可以如适合本发明目的地通过本领域技术人员已知的任何方法进行。在根据本发明方法的步骤(e)的再引导过程中,水解产物优选被物理地、机械地和/或化学地加工。优选的再引导方法包括泵送或者需要动力运输悬浮体的其他方法,如联机(inline)高剪切力搅拌。在一个特别优选的实施方式中,再引导通过将水解产物泵送到水解容器而进行。在根据本发明方法的步骤(d)的发酵之前加工水解产物将导致甚至更快速的水解动力学和更优异的单体糖收率,因为细胞结合酶更容易从真菌和/或微生物释放。
根据所应用的预处理方法,对至少一种酶和/或至少一种微生物和/或真菌具有抑制性的物质在本发明方法的步骤(a)过程中产生。这些化合物严重降低水解和发酵速率二者。
根据如上限定的步骤(a)至(e)的本发明方法当然已经由于一体化的自给自足式酶生产而提供了关于成本和效率的多方面优势,然而,以连续方式运行该方法数天可能导致这些抑制性物质积累,这将抵消这些优势中的一些,导致酶生产和/或水解减缓。为了保证用于自给自足式酶水解的方法,其也对在工业规模的生产方法(如后续的发酵产物(如生物乙醇)生产)中实施具有吸引力,本发明的发明人已经出人意料地发现这些风险可以通过除去在某些方法阶段并入的这些物质中的一种或多种而预防。
这些抑制性物质是木素纤维素降解产物,包括木质素降解产物、纤维素降解产物和半纤维素降解产物。木质素降解产物可以是酚性质的。半纤维素降解产物包括来源于糖(如己糖类和/或戊糖类)的呋喃,所述糖包括木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖。半纤维素的实例包括木聚糖、半乳葡萄甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯葡糖醛酸木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、及其衍生物与组合。木素纤维素降解产物的实例包括4-OH苄醇、4-OH苯甲醛、4-OH苯甲酸、三甲基苯甲醛、2-糠酸、香豆酸、阿魏酸、酚、愈创木酚、藜芦醚、连苯三酚、连苯三酚单甲基醚、香草醇、香草醛、异香草醛、香草酸、异香草酸、高香草酸、藜芦醇、藜芦醛、藜芦酸、2-O-甲基没食子酸、丁香醇、丁香醛、丁香酸、三甲基没食子酸、高儿茶酚、乙基香草醛、甲氧甲酚、对甲基茴香醚、茴香醛、茴香酸、糠醛、羟甲基糠醛、5-羟甲基糠醛、甲酸、乙酸、乙酰丙酸、肉桂酸、松柏醛、异丁香油酚、氢醌、丁香油酚或其组合。
在本发明方法的一个优选实施方式中,为了保证最有效的方法,要被除去的至少一种对至少一种酶具有抑制性和/或对至少一种微生物具有抑制性的物质是对至少一种属于水解酶类的酶具有抑制性和/或对能够产生至少一种属于水解酶类的酶的微生物和/或真菌具有抑制性的物质。
在一个进一步特别优选的实施方式中,所述物质对至少一种选自木霉属和篮状菌属的真菌(如里氏木霉)具有抑制性,和/或对至少一种选自酵母属、梭菌属、乳杆菌属和毕赤酵母属的微生物具有抑制性。
在本发明方法的一个优选实施方式中,这些至少一种物质被从步骤(a)的经预处理的含木素纤维素材料和/或从根据步骤(c)的水解产物的部分(i)和/或(ii)中除去。
在进一步优选的实施方式中,所述除去是通过将至少一种吸附剂加入到经预处理的含木素纤维素材料和/或根据步骤(c)的水解产物的部分(i)和/或(ii)中而进行。吸附剂优选选自活性碳、二氧化硅、硅酸盐矿物、沸石、炭、粘土、离子交换树脂及其混合物,而活性碳和/或炭是特别优选的。
进一步优选通过在经预处理的含木素纤维素材料被转移至水解容器之前加入吸附剂,将至少一种吸附剂加入到经预处理含木素纤维素材料。然而,将吸附剂直接加入到水解容器或者恰好在根据步骤(c)的分离之前加入吸附剂同样在本发明的范围内。
通过加入吸附剂而除去至少一种抑制性化合物提供了充分的优势。一方面,可滤性被显著地增强。而且,在使用活性碳或炭作为吸附剂的情况下,滤饼的可燃性被增强,而且不需要花费能量或者只需要花费最少量的能量进行干燥。因此,非能量依赖性方法可以通过燃烧滤饼而获得。
在本发明的另一个优选实施方式中,从水解产物的部分(i)和/或(ii)除去至少一种抑制性物质通过蒸发进行。由于大多数抑制性物质的易挥发特性,蒸发是另一种有效的去除方法。根据本发明的“蒸发”优选在减压下,优选在低于大气压力、优选低于750毫巴绝对压力、更优选低于500毫巴绝对压力、甚至更优选低于250毫巴绝对压力、最优选低于125毫巴绝对压力的压力下进行。优选范围是75至750毫巴绝对压力以及75至250毫巴绝对压力。在蒸发过程中,温度优选保持低于120℃、更优选低于100℃、甚至更优选低于90℃、最优选低于80℃。优选范围是45至120℃以及45至100℃。保留时间优选选自0.1秒至10小时、优选1秒至1小时、更优选10秒至30分钟、最优选30秒至10分钟。pH优选保持低于pH 6、更优选低于pH 5.5、甚至更优选低于5.0、最优选低于4.8。优选范围是3.5至6以及4.0至5.0。优选的蒸发器是循环蒸发器、薄膜蒸发器、刮膜蒸发器和降膜蒸发器。
通过蒸发除去至少一种抑制性物质进一步提供了优势,因为蒸发还提供了使水解产物灭菌的益处。因此,可以防止发酵过程中的交叉污染。进一步地,与大部分抑制性物质一起,大量的水也将被蒸发,产生浓缩的水解产物(即,减少的体积和更高的糖浓度),这也使得成本由于通量增加和反应器体积的最小化而进一步下降。蒸发是如此有效的去除方式,以致于仅仅通过将该方法应用于水解产物的部分(i)就已经获得本发明方法的实质性优势。
在另一个优选实施方式中,还可以组合多种去除方法,其中特别优选将在水解产物转移至水解容器之前加入吸附剂与应用于水解产物的部分(i)和/或(ii)的蒸发组合。在这个特别的实施方式中,还优选在根据步骤c)的分离之前,特别优选在根据步骤b)的水解之前加入吸附剂。特别优选根据本发明的方法不包括通过洗涤经预处理的材料和/或水解产物进行的去除。
在本发明方法的另一个优选实施方式中,额外量的0.01至30%(重量/体积)、优选0.1至25%(重量/体积)、进一步优选0.5至22%(重量/体积)、特别优选1至20%(重量/体积)的含木素纤维素材料被加入到培养容器中。在一个特别优选的实施方式中,通过将其与预处理容器分离而获得含木素纤维素材料。加入经预处理的含木素纤维素材料将导致碳的缓慢释放并且用作纤维素酶表达的诱导剂。
在另一个方面,本发明进一步涉及用于从如上限定的水解产物的部分(ii)生产有机化合物的方法,其包括以下步骤:
(f1)使所述水解产物的部分(ii)与至少一种能够产生选自以下的有机化合物的微生物和/或真菌接触:有机酸、氨基酸、己内酰胺、抗体、维生素、酶、核苷酸/核苷、生物气、蛋白质、多糖、氨基葡聚糖、有机溶剂、生物燃料、生物表面活性剂、氨基葡聚糖、糖衍生物及其混合物;或
(f2)使所述水解产物的部分(ii)进行化学转化、催化转化、色谱分离、膜分离和/或结晶过程。
根据用于生产根据如上限定的步骤(f1)的有机化合物的方法,在使水解产物的部分(ii)与至少一种微生物接触期间的温度选自10至65℃、优选15至55℃、特别优选20至50℃、最优选25至45℃。
特别优选所述至少一种微生物选自嗜常温酵母,例如酵母属的全部种,特别是贝酵母,Saccharomyces boulardii,Saccharomyces bulderi,Saccharomyces cariocanus,Saccharomyces cariocus,酿酒酵母,Saccharomyces chevalieri,Saccharomycesdairenensis,Saccharomyces ellipsoideus,Saccharomyces eubayanus,少孢酵母,Saccharomyces florentinus,克鲁弗酵母,Saccharomyces martiniae,Saccharomycesmonacensis,Saccharomyces norbensis,Saccharomyces paradoxus,Saccharomycespastorianus,Saccharomyces spencerorum,Saccharomyces turicensis,单孢酵母,Saccharomyces uvarum,Saccharomyces zonatus,以及Arxula adeninovorans,棉阿舒囊霉,Hansenula polymorpha,Debaramyces hansenii,Hortea werneckii,Kluyeveromyceslactis,Schwanniomyces occidentalis,Thrichosporon domesticum,Thrichosporonmontevideense,Xanthophyllomyces dendrohous,Yarowia lypolytica,拜耳接合酵母,鲁氏接合酵母,栗酒裂殖酵母,树干毕赤酵母,Pichia segobiensis,休哈塔假丝酵母,热带假丝酵母,博伊丁假丝酵母,Candida tenuis,嗜鞣管囊酵母,Hansenula polymorpha,Candida famata,近平滑假丝酵母,皱褶假丝酵母,Candida sonorensis,麦芽糖假丝酵母,Issatchenkia terricola,Kloeckera apis,巴氏毕赤酵母,Pichia cactophila,Pichiadeserticola,Pichia norvegensis,膜醭毕赤酵母,墨西哥毕赤酵母和Torulasporadelbrueckii,及其任意组合。
在用于从水解产物的部分(ii)生产有机化合物的方法的替代性优选实施方案中,所述至少一种微生物选自嗜热微生物,所述嗜热微生物优选选自牛假丝酵母(Candidabovina)、皮卡乔假丝酵母(Candida picachoensis)、Candida emberorum、Candidapintolopesii、嗜热假丝酵母、马克斯克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、Kazachstaniatelluris、东方伊萨酵母、Lachancea thermotolerans及其任意组合。优选的嗜热细菌包括热纤梭菌、热氢硫梭菌(Clostridium thermohydrosulphuricum)、热解糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum)、布氏热厌氧菌(Thermoanaerobium brockii)、乙酰乙酸热厌氧类菌(Thermobacteroides acetoethylicus)、乙醇热厌氧菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、热乙酸梭菌、热自养性梭菌、凯伍产醋菌、Desulfotomaculum nigrificans、嗜热脱硫弧菌、腾冲热厌氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)、嗜热脂肪杆菌、Thermoanaerobacter mathranii及其任意组合。
以下嗜常温酵母的使用是特别优选的:酿酒酵母、树干毕赤酵母、嗜鞣管囊酵母和/或休哈塔假丝酵母。
在用于从水解产物的部分(ii)生产有机化合物的方法的一个替代性实施方式中,使用至少一种真菌。所述至少一种真菌选自曲霉属、木霉属、肉座菌属、青霉属、枝顶孢属、根霉属、篮状菌属及其任意组合。
在从水解产物的部分(ii)产生产有机化合物的方法的替代性实施方式中,微生物选自细菌种、如丙酮丁醇梭菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸乳杆菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌、乳杆菌属、运动发酵单胞菌、大肠杆菌及其任意组合。
进一步地,应理解上文列出的微生物和/或真菌的任意组合在本发明的范围内。
发酵优选以间歇模式(非连续的)、以分批补料模式或以连续模式进行。最优选地,发酵以间歇模式进行。
在进一步优选的实施方式中,矿物质如铜、锌、镁、钙、铁和含氮化合物(如硝酸盐、氨基酸、氨)在用于生产有机化合物的方法步骤f1)之前被加入到水解产物的部分(ii)中。
从水解产物的部分(ii)的细菌发酵产生的有价值的有机化合物包括但不限于有机酸(例如乙酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、富马酸、丙酸和葡糖醛酸),氨基酸(例如谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸),己内酰胺(例如α-氨基-己内酰胺),抗生素(例如博来霉素、维及霉素、林可霉素、莫能菌素、杀稻瘟素、四环素),维生素(例如维生素B2、B12和C),酶,核苷酸/核苷(例如NADH、ATP、cAMP、FAD、辅酶A),生物气,生物聚合物(例如聚羟基丁酸酯、聚酰胺/丝心蛋白),蛋白质,多糖(例如黄原胶、葡聚糖),氨基葡聚糖(例如透明质酸)以及有机溶剂和生物燃料(例如丙酮、乙醇、丁醇、丙二醇)。
从水解产物的部分(ii)的酵母发酵产生的有价值的有机化合物包括但不限于有机溶剂(例如乙醇,丙醇),核苷酸(例如RNA),生物表面活性剂(例如槐糖脂),酶和生物聚合物(例如蜘蛛丝蛋白(spidroin)。
从水解产物的部分(ii)的真菌发酵产生的有价值的有机化合物包括有机酸(例如柠檬酸、富马酸、衣康酸),抗生素(例如青霉素、头孢菌素),酶和多糖(例如几丁质)。
在该方法的进一步优选实施方式中,有机化合物选自醇、有机酸、生物聚合物、抗生素、氨基酸、己内酰胺、多糖、有机溶剂、生物燃料、氨基葡聚糖、核苷酸/核苷、维生素、生物表面活性剂、酶及其混合物。
根据用于根据步骤(f2)生产有机化合物的方法,对水解产物的部分(ii)进行的化学转化、催化转化、色谱分离、膜分离和/或结晶过程是通过色谱法和/或过滤步骤进行,以在发酵(例如基于乳酸的聚合物)和/或化学转化(FDCA的生产)中使用纯化糖。
在另一个方面,本发明还涉及根据如上定义的方法产生的有机化合物。
本发明的特别优选的实施方式在下文中描述,并且不被理解为在任何方面限制本发明。
特别优选的实施方式1
用于含木素纤维素材料的自给自足式酶水解的方法,其包括以下步骤:
(a)使含木素纤维素材料在预处理装置中进行预处理;
(b)使步骤a)的经预处理的含木素纤维素材料与至少一种属于水解酶类的酶在水解容器中接触以形成水解产物;
(c)分离所述水解产物,并随后将所述水解产物分成两部分(i)和(ii),其中部分(i)被引导至培养容器;
(d)用至少一种能够产生至少一种属于水解酶类的酶的微生物和/或真菌对所述水解产物的部分(i)进行发酵;以及
(e)将步骤d)的经发酵的水解产物再引导至步骤b)的水解容器;
其中所述经预处理的含木素纤维素材料通过加入至少一种优选选自活性碳、炭及其混合物的吸附剂而被处理以除去至少一种对至少一种酶和/或至少一种微生物和/或真菌具有抑制性的物质。
特别优选的实施方式2
用于含木素纤维素材料的自给自足式酶水解的方法,其包括以下步骤:
(a)使含木素纤维素材料在预处理装置中进行预处理;
(b)使步骤a)的经预处理的含木素纤维素材料与至少一种属于水解酶类的酶在水解容器中接触以形成水解产物;
(c)分离所述水解产物,并随后将所述水解产物分成两部分(i)和(ii),其中部分(i)被引导至培养容器;
(d)用至少一种能够产生至少一种属于水解酶类的酶的微生物和/或真菌对所述水解产物的部分(i)进行发酵;以及
(e)将步骤d)的经发酵水解产物再引导至步骤b)的所述水解容器;
其中所述水解产物的部分(i)和/或部分(ii)通过蒸发而被处理以除去至少一种对至少一种酶和/或至少一种微生物和/或真菌具有抑制性的物质。
特别优选的实施方式3
用于含木素纤维素材料的自给自足式酶水解的方法,其包括以下步骤:
(a)使含木素纤维素材料在预处理装置中进行预处理;
(b)使步骤a)的经预处理的含木素纤维素材料与至少一种属于水解酶类的酶在水解容器中接触以形成水解产物;
(c)分离所述水解产物,并随后将所述水解产物分成两部分(i)和(ii),其中部分(i)被引导至培养容器;
(d)用至少一种能够产生至少一种属于水解酶类的酶的微生物和/或真菌对所述水解产物的部分(i)进行发酵;以及
(e)将步骤d)的经发酵的水解产物再引导至步骤b)的所述水解容器;
其中所述经预处理含木素纤维素材料通过加入至少一种优选选自活性碳、炭及其混合物的吸附剂而被处理以除去至少一种对至少一种酶和/或至少一种微生物和/或真菌具有抑制性的物质,并且所述水解产物的部分(i)和/或部分(ii)通过蒸发而被处理以除去至少一种对至少一种酶和/或至少一种微生物和/或真菌具有抑制性的物质。
特别优选的实施方式4
根据特别优选的实施方式1、2或3的方法,其中所述水解产物的部分(i)与部分(ii)的比率为0.01至1、优选0.02至0.5、最优选0.05至0.1。
特别优选的实施方式5
根据特别优选的实施方式1、2、3或4的方法,其中额外量的0.01至30%(重量/体积)、优选0.15至25%(重量/体积)、进一步优选0.51至22%(重量/体积)、特别优选15至20%(重量/体积)的含木素纤维素材料被加入到所述培养容器中。最优选在这个实施方式中含木素纤维素材料是经预处理的含木素纤维素材料,优选获得自所述预处理装置。
特别优选的实施方式6
根据特别优选的实施方式1至5中任一项的方法,其中所述至少一种能够产生至少一种属于水解酶类的酶的微生物选自外切和内切纤维素酶、β-葡糖苷酶(BGL)、外切和内切半纤维素酶和酯酶,和/或所述至少一种能够产生至少一种属于水解酶类的酶的真菌选自木霉属和篮状菌属及其混合物,并且最优选里氏木霉。
特别优选的实施方式7
根据特别优选的实施方式1至6中任一项的方法,其还包括以下步骤:
(f1)使所述水解产物的部分(ii)与至少一种能够产生选自以下的有机化合物的微生物和/或真菌接触:有机酸、氨基酸、己内酰胺、抗生素、维生素、酶、核苷酸/核苷、生物气、蛋白质、多糖、氨基葡聚糖、有机溶剂、生物燃料、生物表面活性剂、氨基葡聚糖、糖衍生物及其混合物;
实施例和附图
本发明由以下实施例和附图作进一步描述。实施例和附图仅仅是出于说明目的,不应理解为限制本发明。
图1显示了根据本发明方法的工艺流。虚线描述了将经过预处理的木素纤维素材料的一部分直接加入到培养容器中的方案。
图2显示了在通过蒸发使水解产物去毒素时,葡萄糖、木糖和NaDL-乳酸盐的收率以及乙酸和甲酸的量。
实施例1
麦秸,通过加入炭以及蒸发除去抑制性物质
发酵在具有温度、pH和溶解氧控制装置的搅拌罐式生物反应器系统(=培养容器)中进行。用5%(重量/重量)种子培养物启动培养。此外,培养基含有盐和矿物质和作为主要碳源的浓缩水解产物。发酵在pH 5、30℃和25%溶解氧水平下进行。在15小时后开始进料水解产物的部分(i),连续地再进行85小时。总进料体积基于总最终发酵体积为50%。
将从发酵获得的经发酵水解产物泵送到经预处理麦秸以使后者水解。
选择水解步骤中存在的经预处理麦秸的量使得1m3的经发酵水解产物被加入到2400kg干物质的经预处理麦秸中。
水解在50℃、pH 5下进行96小时,伴随50rpm搅拌。在水解之后,将1%(重量/体积)的活性炭(颗粒)加入到水解容器的内容物中。使内容物与活性碳在室温下培养,伴随250rpm搅拌。在1小时之后,进行固液分离以回收已去除毒素的水解产物,所述固液分离通过将已去除毒素的水解产物通过离心或过滤(过滤器孔径<1mm)与剩余固体分离而进行。然后使15%的已去除毒素的水解产物进行蒸发步骤以进一步除去挥发性抑制剂并使该部分的水解产物的体积减小到初始体积的三分之一。然后将这种双重去毒素并浓缩的水解产物引入到如上所述的发酵中。水解产物的剩余部分(未进行蒸发)可以用于有机化合物的生产。
实施例2
麦秸,通过三倍蒸发除去抑制性物质
发酵在具有温度、pH和溶解氧控制装置的搅拌罐式生物反应器系统(=培养容器)中进行。用5%(重量/重量)种子培养物启动培养。此外,培养基含有盐和矿物质和作为主要碳源的浓缩水解产物。发酵在pH 5、30℃和25%溶解氧水平下进行。在15小时后开始进料水解产物的部分(i),连续地再进行85小时。总进料体积基于总最终发酵体积为45%。
将从发酵获得的经发酵的水解产物泵送到经预处理的麦秸以使后者水解。
选择水解步骤中存在的经预处理的麦秸的量使得1m3的经发酵水解产物被加入到2400kg干物质的经预处理麦秸中。
水解在50℃、pH 5下进行96小时,伴随50rpm搅拌。在水解之后,然后使水解产物进行蒸发步骤以除去挥发性抑制剂并使水解产物体积减小6.4倍。然后将这种已去除毒素并被浓缩的水解产物引入到如上所述的发酵中。
为进行蒸发,使用硫酸将pH调节到4,然后在75℃和100毫巴下进行蒸发。在达到500g/L糖浓度时,停止蒸发。葡萄糖、木糖和NaDI各自的收率以及甲酸和乙酸各自的量在表1和图2中示出。这种去毒素导致乙酸减少超过80%,甲酸减少大致30%。结果在表1和图2中示出。
收率 | |
系数 | 6.42 |
pH | - |
收率 | |
葡萄糖 | 103% |
木糖 | 106% |
甲酸 | 72% |
乙酸 | 16% |
表1:蒸发后葡萄糖、木糖的收率以及甲酸和乙酸的量。
Claims (13)
1.一种用于含木素纤维素材料的自给自足式酶水解的方法,其包括以下步骤:
(a)使含木素纤维素材料在预处理装置中进行预处理;
(b)使步骤a)的经预处理的含木素纤维素材料与至少一种属于水解酶类的酶在水解容器中接触以形成水解产物;
(c)分离所述水解产物,并随后将所述水解产物分成两部分(i)和(ii),其中部分(i)被引导至培养容器;
(d)用至少一种能够产生至少一种属于水解酶类的酶的微生物和/或真菌对所述水解产物的部分(i)进行发酵;以及
(e)将步骤d)的经发酵的水解产物再引导至步骤b)的所述水解容器;
其中处理所述经预处理的含木素纤维素材料和/或水解产物以除去至少一种对至少一种酶和/或至少一种微生物和/或真菌具有抑制性的物质。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述至少一种对至少一种酶具有抑制性和/或对至少一种微生物具有抑制性的物质是对至少一种属于水解酶类的酶具有抑制性和/或对至少一种能够产生至少一种属于水解酶类的酶的微生物和/或真菌具有抑制性的物质。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述物质对至少一种选自木霉属(无性型:肉座菌属)、酵母属、梭菌属、乳杆菌属、毕赤酵母属和篮状菌属的真菌和/或微生物具有抑制性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述物质被从根据步骤(a)的所述经预处理的含木素纤维素材料和/或从根据步骤(c)的所述水解产物的部分(i)和/或(ii)中除去。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述物质通过将至少一种吸附剂加入到所述经预处理的含木素纤维素材料和/或根据步骤(c)的所述水解产物的部分(i)和/或(ii)中而除去。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述吸附剂选自活性碳、二氧化硅、硅酸盐矿物、沸石、炭、粘土、离子交换树脂及其混合物。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述物质通过蒸发而从根据步骤(c)的所述水解产物的部分(i)和/或(ii)中除去。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中额外量的0.1至30%(重量/体积)的含木素纤维素材料被加入到所述培养容器中。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述含木素纤维素材料通过将其从所述预处理容器分离而获得。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述水解产物的部分(i)与部分(ii)的比率为0.01至1。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤d)的发酵期间,可溶性糖的浓度低于10%(重量/体积)。
12.用于产生有机化合物的方法,其包括如权利要求1至11中任一项所限定的步骤,并且其还包括以下步骤:
(f1)使所述水解产物的部分(ii)与至少一种能够产生选自以下的有机化合物的微生物和/或真菌接触:有机酸、氨基酸、己内酰胺、抗体、维生素、酶、核苷酸/核苷、生物气、蛋白质、多糖、氨基葡聚糖、有机溶剂、生物燃料、生物表面活性剂、氨基葡聚糖、糖衍生物及其混合物;或
(f2)使所述水解产物的部分(ii)进行化学转化、催化转化、色谱分离、膜分离和/或结晶过程。
13.有机化合物,其根据如权利要求12中所定义的方法产生。
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