CN106573021B - 用于增强乳酸细菌活菌计数的方法及其有用的组合物 - Google Patents

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Abstract

在此公开的本发明描述了(i)基于植物的天然纤维对凝结芽孢杆菌MTCC 5856的生长促进活性；(ii)基于植物的天然纤维和凝结芽孢杆菌MTCC 5856的组合以抑制革兰氏阴性病原性细菌和(iii)使用基于植物的天然纤维通过凝结芽孢杆菌MTCC 5856产生短链脂肪酸(SCFA)。

Description

用于增强乳酸细菌活菌计数的方法及其有用的组合物
对相关申请的交叉引用
本申请是要求分别提交于2014年08月29日和2014年10月14日的美国临时申请号62043599和62063453的优先权的PCT提交。
发明背景
发明领域
一般而言，本发明涉及凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans)(乳酸细菌)。更具体地，本发明涉及(i)基于植物的天然纤维(natural plant based fibers)对凝结芽孢杆菌MTCC 5856的生长促进活性；(ii)使用基于植物的天然纤维通过凝结芽孢杆菌MTCC 5856产生短链脂肪酸(SCFA)；和(iii)基于植物的天然纤维和凝结芽孢杆菌MTCC 5856的组合以抑制革兰氏阴性病原性细菌。
背景技术
将多菌株益生菌(multistrain probiotics)(益生性细菌)和益生元(prebiotics)组合以实现增强的免疫支持效果是本领域熟知的。具体地，将益生菌与基于植物的天然纤维组合以配制合生元(synbiotics)报道为有希望的治疗方法(StigBengmark和Robert Martindale.“Prebiotics and Synbiotics in Clinical Medicine”.Nutr Clin Pract vol 20 244–261,April 2005)。此类方法的成功取决于仔细选择特定的益生菌微生物，其活菌计数通过基于植物的天然纤维有效地增强，所述基于植物的纤维对肠中的酶促水解和酸水解都有抗性。鉴于存在对微生物的纤维消化和利用(对底物的微生物可接近性，纤维(草料)的物理和化学性质以及还有消化过程的动力学而言)的限制的教导，这些研究对适应暴露于共生饮食方案的宿主动物的表现至关重要(GabriellaA.Varga和Eric S.Kolver,“Microbial and Animal Limitations to Fiber Digestionand Utilization”,J.Nutr.May 1,1997vol.127no.5 819S-823S)。
本发明的基本目的是评价所选择的天然纤维(酶和酸水解抗性)的性能以提高凝结芽孢杆菌MTCC 5856的活菌计数。
本发明的另一个目的是评价合生元组合物(天然纤维和凝结芽孢杆菌MTCC 5856)抑制病原性革兰氏阴性菌的能力。
本发明的另一个目的是评价合生元组合物(天然纤维和凝结芽孢杆菌MTCC 5856)产生所需短链脂肪酸的能力，所述性质具有深远的治疗应用。
本发明实现了上述目的并提供了另外的相关优点。
发明概述
公开的是(i)基于植物的天然纤维对凝结芽孢杆菌MTCC 5856的生长促进活性；(ii)基于植物的天然纤维和凝结芽孢杆菌MTCC 5856的组合以抑制革兰氏阴性病原性细菌，和(iii)使用基于植物的天然纤维通过凝结芽孢杆菌MTCC 5856产生短链脂肪酸(SCFA)。
从以下结合附图(其通过示例的方式说明本发明的原理)的更为详细的说明，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)MTCC 5856于2013年9月19日以保藏号MTCC5856保藏于MTCC-微生物典型培养物保藏和基因银行(印度昌迪加尔，Sector 39-A，160036)。
附图简述
图1a,1b和1c的图示显示了在不同天然植物纤维(％,w/v)单独存在下，凝结芽孢杆菌MTCC 5856的活菌菌落计数的增加。
图2a,2b和2c显示了在MRS培养基(不含右旋糖)中不同天然植物纤维(％,w/v)(0.5,1.0,2.0％,w/v)存在下凝结芽孢杆菌MTCC 5856的活菌菌落计数增加的图示。
图3图示了当在作为培养基的基于植物的天然纤维中共培养时，凝结芽孢杆菌MTCC 5856对大肠杆菌(E.coli)ATCC 25922生长的抑制的图示。活菌计数的平均均值以log10 cfu/ml表示。
图4显示了短链脂肪酸的层析读数。
发明详述
在最优选的实施方案中，本发明涉及增加凝结芽孢杆菌MTCC 5856的活菌落计数的方法，所述方法包含在天然植物纤维存在下培养凝固芽孢杆菌MTCC 5856的步骤，所述天然植物纤维选自由以下组成的组：胡芦巴(Trigonella foenum-graecum)(胡芦巴(fenugreek))种子纤维，中宁枸杞(Lycium barbarum)种子纤维，亚麻(Linumusitatissimum)(亚麻(Flax))种子纤维，椰子(Cocos nucifera)(椰子(Coconut))纤维，姜(Zingiber officinale)(姜(Ginger))根茎纤维，余甘子(Emblica officinalis)(余甘子(Amla))果实纤维，卵叶车前草(Plantago ovata)(蚤草(Psyllium))纤维和红莓苔子(Vaccinium oxycoccos)(酸果蔓(Cranberry))种子纤维。
在另一个最优选实施方案中，本发明涉及抑制病原性革兰氏阴性细菌的方法，所述方法包含使所述革兰氏阴性细菌与凝结芽孢杆菌MTCC 5856接触的步骤，所述凝结芽孢杆菌MTCC 5856与选自下组的天然植物纤维共培养：胡芦巴(胡芦巴)种子纤维，中宁枸杞种子纤维，亚麻(亚麻)种子纤维，椰子(椰子)纤维，姜(姜)根茎纤维，余甘子(余甘子)果实纤维，卵叶车前草(蚤草)纤维和红莓苔子(酸果蔓)种子纤维。
在另一个最优选的实施方案中，本发明涉及产生短链脂肪酸的方法，其通过将凝结芽孢杆菌MTCC 5856与天然植物纤维共培养进行，所述天然植物纤维选自由以下组成的组：胡芦巴(胡芦巴)种子纤维，中宁枸杞种子纤维，亚麻(亚麻)种子纤维，椰子(椰子)纤维，姜(姜)根茎纤维，余甘子(余甘子)果实纤维，卵叶车前草(蚤草)纤维和红莓苔子(酸果蔓)种子纤维。在替代实施方案中，本发明还涉及针对哺乳动物肠中的饮食诱导的肥胖和胰岛素抗性提供保护的方法，其通过施用包含凝结芽孢杆菌MTCC 5856与天然植物纤维的组合物以引起针对饮食诱导的肥胖和胰岛素抗性的保护作用进行，所述天然植物纤维选自由以下组成的组：胡芦巴(胡芦巴)种子纤维，中宁枸杞种子纤维，亚麻(亚麻)种子纤维，椰子(椰子)纤维，姜(姜)根茎纤维，余甘子(余甘子)果实纤维，卵叶车前草(蚤草)纤维和红莓苔子(酸果蔓)种子纤维。
下面包括的具体实施例说明了本发明的上述最优选的实施方案。
实施例
实施例1：制备纤维的方法
胡芦巴(胡芦巴)种子纤维
从当地市场收集胡芦巴(也称为胡芦巴)种子，并研磨成粗粉末(10目通过)。此外，将4倍体积的正己烷加入到100gm的胡芦巴种子粗粉末中，并在回流温度下萃取。通过Whatman过滤器1号(Whatman filter no 1)过滤正己烷级份，并再进行三次相同的提取。提取后，将渗余物在80℃下干燥5小时，然后将其研磨以得到40目通过粉末。在替代方法中，通过使用液体CO2作为溶剂的超临界流体提取方法除去来自葫芦巴种子的脂肪或油。为了增加膳食纤维(半乳甘露聚糖)含量，进行使用纤维素酶的酶水解。根据制造商的说明书(Megazyme International Ireland,Bray Business Park,Bray,Co.威克洛,爱尔兰)，通过Megazyme试剂盒(K-GALM 03/11)确定半乳甘露聚糖含量。
枸杞子种子纤维
枸杞(Goji)，枸杞果(Goji berry)或薄叶西方雪果(Wolfberry)是中宁枸杞(Lycium barbarum)的果实。将中宁枸杞的果实干燥，分离种子并研磨成粗粉末。此外，将4倍体积的正己烷加入到100gm的中宁枸杞粗粉末中，并在回流温度下萃取。通过Whatman过滤器1号过滤正己烷级份，并再进行三次相同的提取。提取后，将渗余物在80℃下干燥5小时，然后将其研磨以得到60目通过粉末。总膳食纤维通过酶解重力法(Enzymatic-Gravimetric Method)(AOAC 985.29)测定。
亚麻(亚麻种子)纤维
收集亚麻(亦称普通亚麻(common flax)或亚麻子(linseed)或者亚麻(Flax))种子并研磨成粗粉末(10目通过)。此外，将4倍体积的正己烷加入到100gm的亚麻粗粉末中，并在回流温度下萃取。通过Whatman过滤器1号过滤正己烷部分，并再进行三次相同的提取。提取后，将渗余物在80℃下干燥5小时，然后将其研磨以得到40目通过粉末。总膳食纤维通过酶解重力法(Enzymatic-Gravimetric Method)(AOAC 985.29)测定。
椰子纤维
从当地市场购买成熟的椰子并干燥。此外，将胚乳(椰子肉)切成粗粒和均匀尺寸的材料。此外，将4倍体积的正己烷加入到100gm的椰子粗材料中，并在回流温度下萃取。通过Whatman过滤器1号过滤正己烷部分，并再进行三次相同的提取。提取后，将渗余物在80℃下干燥5小时，然后将其研磨以得到60目通过粉末。总膳食纤维通过酶解重力法(Enzymatic-Gravimetric Method)(AOAC 985.29)测定。
姜(姜)根茎纤维
使姜(Zingiber officinale)根茎，姜根(ginger root)或仅仅姜(ginger)干燥并研磨成粗粉末(10目通过)。此外，将4倍体积的正己烷加入到100gm的亚麻粗粉末中，并在回流温度下萃取。通过Whatman过滤器1号过滤正己烷部分，并再进行三次相同的提取。在替代方法中，通过使用液体CO2作为溶剂的超临界流体提取方法除去来自姜种子的脂肪或油。提取后，将渗余物在80℃下干燥5小时，然后将其研磨以得到40目通过粉末。总膳食纤维通过酶解重力法(Enzymatic-Gravimetric Method)(AOAC 985.29)测定。
余甘子(余甘子)果实纤维
余甘子(Emblica officinalis)(余甘子(Phyllanthus emblica))果实纤维，也称为余甘子(Emblic),余甘子诃子(Emblic myrobalan),诃子(Myrobalan),印度鹅莓(Indiangooseberry),马六甲树(Malacca tree)，或来自梵语阿马利卡的余甘子。从当地市场购买余甘子的果实，干燥，粉碎并通过60目。将该粉末用于纤维的提取。总膳食纤维通过酶解重力法(Enzymatic-Gravimetric Method)(AOAC 985.29)测定。
实施例2：酸水解
将表1中所列的2克基于植物的天然纤维溶解在100ml HCl(0.10M)中，并在37℃在100rpm的情况下温育180分钟。在0、30、60、90、120和180分钟取样。本发明中也采用低聚果糖(FOS；Tata Chemicals,印度)作为参考与天然纤维作比较，并且淀粉(马铃薯可溶淀粉；HiMedia,Mumbai,印度)也用作对照。通过二硝基水杨酸盐试剂测量还原碳水化合物的增加(Nilsson和Bjorck 1988.Journal of Nutrition 118,1482–1486)。
表1
基于植物的天然纤维的总膳食纤维含量
Figure GDA0002587284790000051
Figure GDA0002587284790000061
ND,未检测到；总膳食纤维通过酶解重力法(Enzymatic-Gravimetric Method)(AOAC 985.29)测定。
表2显示酸水解对(0.1M HCl；37℃，100rpm)对基于植物的天然纤维的影响。总还原糖通过二硝基水杨酸(DNSA)法测定。
表2
Figure GDA0002587284790000062
Figure GDA0002587284790000071
实施例3：酶水解
将来自猪胰腺的4×USP(Sigma-Aldrich Corporation，St.Louis MO，美国)的100mg胰酶溶解在100ml磷酸盐缓冲液(50mM；pH 7.0)中。此外，将基于植物的天然纤维(2gm)溶解在上述胰酶溶液中，并在37℃100rpm温育180分钟。在0、30、60、90、120和180分钟取样。在研究中也采用FOS作为参考与基于植物的天然纤维作比较，并且淀粉也用作对照。通过二硝基水杨酸盐试剂测量还原碳水化合物的增加(Oku等,1984.Journal ofNutrition 114,1574–1581)。酶水解(在20mM PBS pH7.0中的0.1％胰酶；37℃，100rpm)对基于植物的天然纤维的效果示于表3。总还原糖通过二硝基水杨酸(DNSA)法测定。
表3
Figure GDA0002587284790000072
实施例4：在凝结芽孢杆菌MTCC 5856的情况下基于植物的天然纤维的生长促进活性
将凝结芽孢杆菌MTCC 5856的单个分离菌落接种到MRS肉汤(pH 7.0±20；Himedia,Mumbai,印度)中，并在37℃120rpm下温育过夜。制备仅基于植物的天然纤维(0.5,1.0,2.0％,w/v)，和在MRS培养基(不含右旋糖)中的基于植物的天然纤维(0.5,1.0,2.0％,w/v)。还分别制备了MRS肉汤和MRS(不含右旋糖)。类似地，也在本研究中采用低聚果糖(FOS)作为参考对照与基于植物的天然纤维作比较。将所有培养基的最终pH调节至7.0。将5％过夜培养的凝结芽孢杆菌MTCC 5856培养物接种到所有烧瓶中，并在37℃100rpm温育24小时。还记录了温育0小时和发酵后(24小时)的pH值。将样品在无菌盐水中连续稀释，通过在0小时和发酵后(24小时)在葡萄糖酵母提取物琼脂(HiMedia，Mumbai，印度)上铺板计数活菌计数。将板在37℃下温育48至72小时。每个分析在两个不同的场合一式三份进行。活菌计数的平均均值以log10 cfu/ml表示(图1a,1b和1c)。
实施例5：对大肠杆菌生长的抑制
设计体外实验以评价基于植物的天然纤维与益生细菌凝结芽孢杆菌MTCC 5856在抑制革兰氏阴性病原性细菌大肠杆菌中的作用。简言之，将2.0g基于植物的天然纤维加入到100ml软化水中。由于高胶凝特性，将0.5gm的蚤草壳纤维和亚麻籽纤维加入到100mL软化水中。将pH调节至7.0±0.2，并在121℃下高压灭菌20分钟。灭菌后，将氧还原酶Oxyrase(
Figure GDA0002587284790000081
for Broth,Oxyrase,Inc,Mansfield,OH,USA)添加至每个烧瓶。凝固芽孢杆菌MTCC 5856在葡萄糖酵母提取物琼脂(Himedia,Mumbai,印度)上培养，且大肠杆菌ATCC25922在胰蛋白酶大豆琼脂(Himedia,Mumbai,印度)上培养。使用两种培养物的单个分离的菌落，并将细菌悬浮液的浊度调节至0.5Mc Farland标准(相当于1.5×108菌落形成单位(CFU)/ml)。将1毫升大肠杆菌ATCC 25922加入含有基于植物的天然纤维的烧瓶中。类似地，在其它组中，将1ml大肠杆菌ATCC 25922和1ml凝结芽孢杆菌MTCC 5856加入到含有基于植物的天然纤维的烧瓶中。将烧瓶在37℃100rpm温育24小时。将样品在无菌盐水中连续稀释，通过在0小时和发酵后(24小时)在伊红亚甲基蓝琼脂(EMB琼脂；HiMedia，Mumbai，印度)上铺板来计数大肠杆菌ATCC 25922的活菌计数。将板在37℃下温育48小时。每个分析在两个不同的场合一式三份进行。活菌计数的平均均值以log10 cfu/ml表示(图3)。
实施例6：使用基于植物的天然纤维通过凝结芽孢杆菌MTCC 5856产生SCFA
用凝固芽孢杆菌MTCC 5856进行的体外发酵通过略有修改的McBurney和Thompson所述的下述方法(McBurney MI和Thompson LU.(1987)Effect of human faecal inoculumon in vitro fermentation variables.Brit J Nutr 58:233-243)进行。简言之，将2.0g葡萄糖或基于植物的天然纤维加入到100mL软化水中。由于高胶凝性，将0.5gm的蚤草壳纤维和亚麻籽纤维加入到100mL软化水中。将pH调节至7.0±0.2，并在121℃下高压灭菌20分钟。灭菌后，将氧还原酶Oxyrase(
Figure GDA0002587284790000091
for Broth,Oxyrase,Inc,Mansfield,OH,USA)添加至每个烧瓶，以诱导无氧条件。将5％过夜培养的凝结芽孢杆菌MTCC 5856培养物接种到所有烧瓶中，并在37℃下温和摇动rpm温育24小时。将瓶子紧密封闭并用石蜡膜密封以保持酶补充物产生的厌氧条件。还记录了温育0小时和发酵后(24小时)的pH值。向每个样品中加入1ml硫酸铜(10g/L)以抑制进一步的微生物生长(Sigma,St.Louis,MO,USA)。采用以下参数进行上述发酵样品中短链脂肪酸的分析。
试剂
1.二乙醚(AR级)
2.H2SO4
3.RO水
4.氯化钠(AR级)
色谱条件
烤箱：
速率 温度 保持时间
初始 80℃ 1.00分钟
8℃/分钟 200℃ 2.00分钟
1.后运行温度 220℃
2.后时间(Post Time) 5.0分钟
3.运行时间 18分钟
入口
Figure GDA0002587284790000092
Figure GDA0002587284790000101
柱
1.DB-FFAP(对苯二甲酸改性聚乙二醇)
2.尺寸：30.00m×250.00mm×0.25μm。
3.载气：氮气
4.流速：1.0ml/min
检测器
Figure GDA0002587284790000102
标准溶液制备
在100ml容量瓶中精确称量100.0mg的每种脂肪酸标准品(乙酸，丙酸和丁酸)，并溶解在50.0mL水中，并用水补充至刻度并充分混合(储液)。此外，将10.0mL储液用水稀释至100.0mL，充分混合，得到标准溶液。如下文所述对5mL标准溶液进行萃取。
1.取5ml标准溶液/样品。
2.向标准溶液中加入5ml水，涡旋振荡0.5分钟。
3. 3M H2SO4调节pH至1-1.5，涡旋振荡0.5分钟。
4.在加入样品/工作标准前，将二乙醚保持在-20℃下多至1小时。
5.加入10ml乙醚，涡旋振荡1分钟。
6.加入4g氯化钠，涡旋振荡1分钟。
7.离心以分离水层和Diethyl层
8.在GC小瓶中转移1.0mL的二乙醚层并注射。
流程：
将各提取的标准溶液1μl一式三份注入色谱仪并记录由于乙酸，丙酸和丁酸而引起的主峰的响应。由于一式三份注射的乙酸，丙酸和丁酸的峰面积的％相对标准偏差不应大于2.0％。将提取的样品溶液各1.0μl注入色谱仪。乙酸，丙酸和丁酸的含量计算如下。
Figure GDA0002587284790000111
虽然已经参考优选实施例描述了本发明，但是本领域技术人员应当清楚地理解，本发明不限于此。相反，本发明的范围仅结合所附权利要求来解释。

Claims (4)

1.增加凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)MTCC 5856的活菌菌落计数的方法，所述方法包括在天然植物纤维的存在下培养凝结芽孢杆菌MTCC5856的步骤，所述天然植物纤维选自由以下组成的组：胡芦巴(Trigonella foenum-graecum)种子纤维，中宁枸杞(Lyciumbarbarum)种子纤维，亚麻(Linum usitatissimum)种子纤维，椰子(Cocos nucifera)纤维，姜(Zingiber officinale)根茎纤维，余甘子(Emblica officinalis)果实纤维，卵叶车前草(Plantago ovata)纤维和红莓苔子(Vaccinium oxycoccos)种子纤维。
2.抑制病原性革兰氏阴性细菌的方法，所述方法包括使所述革兰氏阴性细菌与凝结芽孢杆菌MTCC 5856接触的步骤，所述凝结芽孢杆菌MTCC 5856与选自下组的天然植物纤维共培养：胡芦巴种子纤维，中宁枸杞种子纤维，亚麻种子纤维，椰子纤维，姜根茎纤维，余甘子果实纤维，卵叶车前草纤维和红莓苔子种子纤维，其中所述病原性革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。
3.产生短链脂肪酸的方法，其通过将凝结芽孢杆菌MTCC 5856与天然植物纤维共培养进行，所述天然植物纤维选自由以下组成的组：胡芦巴种子纤维，中宁枸杞种子纤维，亚麻种子纤维，椰子纤维，姜根茎纤维，余甘子果实纤维，卵叶车前草纤维和红莓苔子种子纤维。
4.凝结芽孢杆菌MTCC 5856和天然植物纤维在制备组合物中的用途，所述组合物用于针对哺乳动物肠中的饮食诱导的肥胖和胰岛素抗性提供保护的方法，其中所述天然植物纤维选自由以下组成的组：胡芦巴种子纤维，中宁枸杞种子纤维，亚麻种子纤维，椰子纤维，姜根茎纤维，余甘子果实纤维，卵叶车前草纤维和红莓苔子种子纤维，且所述方法通过施用包含凝结芽孢杆菌MTCC 5856与所述天然植物纤维的组合物以引起针对饮食诱导的肥胖和胰岛素抗性的保护作用进行。
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