CN106565697A - 一种溶酶体定位荧光探针、制备方法及在近红外比率检测精氨酸中的应用 - Google Patents

一种溶酶体定位荧光探针、制备方法及在近红外比率检测精氨酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于一种溶酶体定位荧光探针、制备方法及在近红外比率检测精氨酸中的应用，该探针的化学结构式如下：本发明的荧光探针的合成条件温和、成本较低，对精氨酸具有很好的选择性和抗干扰性，并且时间、温度稳定性好，在生物化学领域具有实际的应用价值。

Description

一种溶酶体定位荧光探针、制备方法及在近红外比率检测精 氨酸中的应用
技术领域
本发明属于荧光传感技术领域，具体涉及一种溶酶体定位荧光探针、制备方法及在近红外比率检测精氨酸中的应用。
背景技术
氨基酸作为生物大分子蛋白质的基本单位，是生物的重要组成部分，在生物生化过程中起着至关重要的作用。因此，在诸如疾病和营养分析医学诊断领域的多种氨基酸的检测有很高的要求。在所有氨基酸中，精氨酸是尿素、鸟氨酸和胍丁胺的前体。此外，精氨酸在伤口愈合、免疫功能和激素的释放等过程的细胞分裂中也起着重要的作用。因此，高的选择性和灵敏度的识别精氨酸至关重要(T.Minami，N.A.Esipenko，B.Zhang，L.Isaacs andP.Anzenbacher，Chem.Commun.，2014，50，61-63；E.G.Shcherbakova，T.Minami，V.Brega，T.D.James and P.Anzenbacher，Angew.Chem.，Int.Ed.，2015，54，7130-7133；A.K.Sikalidis，Pathol.Oncol.Res.，2015，21，9-17；D.I.Gabrilovich，S.Ostrand-Rosenberg and V.Bronte，Nat.Rev.Immunol.，2012，12，253-268.)。
与“开-关”模式的荧光探针相比，比率荧光探针可以消除如光学路径长度和光照强度等多个因素的干扰因素。特别是当将比率荧光探针应用于生物体系，通过测定两个不同波长的荧光强度的比值可以实现更有效的检测(X.Zhou，X.J.Jin，D.H.Li and X.Wu，Chem.Commun.，2011，47，3921-3923)。
另外，生物组织和血液样品的光谱吸收范围主要集中在200至650纳米，并且在此波长范围内生物的消光系数是比较大的，这将对在可见光范围内的光学成像造成相当大的干扰。因此，在近红外光谱范围(650至900纳米)的荧光成像将是理想的生物体组织成像的波长范围。近红外荧光不仅可以降低信噪比，而且可以具有更深穿透组织的能力，实现最佳的成像效果。但是目前很少有对精氨酸检测的近红外荧光探针的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种选择性好、灵敏度高溶酶体定位荧光探针、制备方法及在近红外比率检测精氨酸中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种溶酶体定位荧光探针，该探针的化学结构式如下：
所述的探针的制备方法包括以下步骤：将化合物3和化合物2溶解在乙醇中，加热回流，将反应溶液冷却至室温后过滤，滤饼用乙醚洗涤。
所述化合物3的结构为化合物2的结构为
优选的，所述化合物3的合成方法如下：将3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮与SeO2溶解在1，4-二氧六环中，回流7小时，减压蒸馏，过柱分离提纯即得化合物3。
优选的，所述3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮的合成方法如下：氩气保护下，将2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚和水合肼加入到乙醇中，将混合物加热，然后加入Pd-C催化剂，回流直至溶液的红色消失，然后加入丙酮酸乙酯，将反应溶液加热回流，通过真空蒸馏得到的粗产物，将粗产物过柱分离提纯即得3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮，3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮的结构式如下：
优选的，所述2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚的合成方法如下：将3-吡咯烷基-1-苯酚溶解在浓盐酸和水混合溶剂中，将亚硝酸钠的水溶液加入到低于5℃的上述溶液中，反应并过滤，固体用饱和醋酸钠溶液洗涤三次即得2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚，2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚的结构式如下：
优选的，所述3-吡咯烷基-1-苯酚的合成方法如下：将3-氨基苯酚、碳酸钾和1，4-二溴丁烷溶解于DMF中，加热至80℃，反应2小时，冷却至室温，过柱分离提纯即得3-吡咯烷基-1-苯酚，3-吡咯烷基-1-苯酚的结构式如下：
所述化合物2的合成方法如下：取4-羧基苯肼盐酸盐和氢氧化钠，加入乙醇超声，室温条件下搅拌，溶解30min，随后将乙醇旋转蒸出，将剩余的固体转移至三口瓶中，加入冰乙酸溶解，再加入醋酸钠，超声溶解，最后加入3-甲基-2-丁酮，加热至100℃，回流反应16h，冷却至室温，减压蒸馏，旋转蒸出冰乙酸，用冰水冷却至0℃，慢慢加入饱和的碳酸钠溶液，直至没气泡产生为止，用盐酸调节pH＝4，用二氯甲烷萃取三次，收集油相，用无水硫酸钠干燥，抽滤，再旋转蒸出二氯甲烷，得红色油状物2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸；将2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸和碘甲烷溶解于乙腈中，混合物加热回流反应12小时，冷却至室温，过滤旋蒸除去溶剂得到化合物2。
本发明产生的有益效果是：本发明的荧光探针的合成条件温和、成本较低，对精氨酸具有很好的选择性和抗干扰性，并且时间、温度稳定性好，在生物化学领域具有实际的应用价值。
附图说明
图1为实施例1制备的荧光探针(Vwater/VDMSO＝6/4，浓度1.0×10-5M)滴定精氨酸水溶液(0-50.0当量)的紫外可见光谱变化图(反应时间为20分钟)；
图2为实施例1制备的荧光探针滴定精氨酸水溶液时650nm处精氨酸浓度与紫外可见光谱吸收强度关系图；
图3为实施例制备的荧光探针(浓度1.0×10-5M)滴定精氨酸水溶液(从左到右浓度分别为0M，2×10-5M，4×10-5M，6×10-5M，8×10-5M，10×10-5M，15×10-5M，20×10-5M，25×10- 5M，30×10-5M，35×10-5M，40×10-5M，45×10-5M，50×10-5M)的日光下照片；
图4为实施例1制备的荧光探针(浓度1.0×10-5M)滴定精氨酸水溶液(0-50.0当量)的荧光光谱图(反应时间20分钟)，(a)激发波长为470nm，(b)激发波长为630nm；
图5为实施例1制备的荧光探针(浓度1.0×10-5M)滴定精氨酸水溶液(0-50.0当量)的I570/I720发射强度比值的线性关系图，I570和I720分别表示570nm和720nm处的荧光强度；
图6为采用实施例1制备的荧光探针(浓度1.0×10-5M)滴定精氨酸水溶液时，720nm处的荧光发射强度随着精氨酸浓度增加(0-50.0当量)的变化图；
图7为实施例制备的荧光探针(浓度为1.0×10-5M)在570nm和720nm处加入不同浓度的精氨酸(浓度分别为1.0×10-5M，5.0×10-5M，1.0×10-4M，1.5×10-4M，2.0×10-4M，3.0×10- 4M，4.0×10-4M和5.0×10-4M)的动力学曲线；(a)激发波长为470nm，(b)激发波长为630nm，I570和I720分别表示570nm和720nm处的荧光强度；
图8为18种氨基酸的选择性实验(18种氨基酸分别为GSH，IIe，Pro，Thr，Ser，Met，Glc，His，Ala，Gly，Val，Leu，Phe，Cys，Asp，Glu，Tyr和Trp，浓度为荧光探针浓度的50倍当量，荧光探针的浓度为1.0×10-5M)，(c)激发波长为470nm，(d)激发波长为630nm；
图9为实施例1制备的探针的溶液(浓度为1.0×10-5M)加入不同的生物分子(浓度为荧光探针浓度的50倍当量，分别为GSH，IIe，Pro，Thr，Ser，Met，Glc，His，Ala，Gly，Val，Leu，Phe，Cys，Asp，Glu，Tyr和Trp)的柱状图(深色柱状图)和探针溶液(浓度为1.0×10-5M)加入精氨酸后再加入不同的生物分子(浓度为荧光探针浓度的50倍当量，分别为GSH，IIe，Pro，Thr，Ser，Met，Glc，His，Ala，Gly，Val，Leu，Phe，Cys，Asp，Glu，Tyr和Trp)抗干扰柱状图(浅色柱状图)，反应时间20分钟，(a)激发波长为470nm，(b)的激发波长为630nm；
图10为实施例1制备的探针溶液(浓度为1.0×10-5M)加入不同的金属离子(图(a))和阴离子(图(b))的荧光响应图(深色柱状图)，以及探针溶液(浓度为1.0×10-5M)加入精氨酸(浓度为5.0×10-4M)再加入不同的金属离子(分别为K+，Ca2+，Na+，Mg2+，Al3+，Zn2+，Ni2+，Hg2+，Mn2+和Cd2+，浓度为荧光探针浓度的50倍当量)(图(a))和阴离子(分别为ClO4 -，SO4 2-，NO3 -，C2O4 2-，HSO3 -，HSO4 -，S2O3 2-，SH-，I-，N3 -，SO3 2-，ClO3 -，F-，Br-和Cl-，浓度为荧光探针浓度的50倍当量)(图(b))抗干扰图(浅色柱状图)，反应时间20分钟；
图11为Hela细胞的荧光成像结果，(a)探针共聚焦荧光成像照片，通道1：λex＝560nm，λem＝570-620nm；(b)细胞定位荧光染料共聚焦荧光成像照片(通道2：λex＝640nm，λem＝663-738nm；(c)为(a)和(b)的合并照片；(d)明场照片；(e)Hela细胞区域强度分布图；(f)探针分子与细胞定位荧光染料强度相关性图(Rr＝0.89)；
图12为Hela细胞在加入探针前(a，d，g，j)和加入探针后(1.0×10-5M)(b，e，h，k)，以及加入探针分子(1.0×10-5M)和精氨酸后(5.0×10-4M)(c，f，i，1)的共聚焦显微镜照片，激发波长分别为488nm和560nm，图像采集的通道分别为525±25nm(第一行)和595±25nm(第二行)，比率图像由第一通道与第二通道的比值(I1/I2，第三行)；
图13为470nm光激发下实施例1制备的探针分子(1.0×10-5M)的荧光强度与精氨酸浓度的关系图，I570和I720分别表示570nm和720nm处的荧光强度；
图14为630nm光激发下实施例1制备的探针分子(1.0×10-5M)的720nm处荧光强度与精氨酸浓度的关系图，I720表示720nm处的荧光强度；
图15为在630nm光激发下实施例1制备的探针分子(1.0×10-5M)的720nm处荧光强度随温度变化情况图；
图16为在630nm光激发下实施例1制备的探针分子(1.0×10-5M)的720nm处荧光强度随时间变化情况图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。本发明中除非特别指出，精氨酸水溶液0-50.0当量为：0M，2×10-5M，4×10-5M，6×10-5M，8×10-5M，10×10-5M，15×10-5M，20×10-5M，25×10-5M，30×10-5M，35×10-5M，40×10-5M，45×10-5M，50×10-5M。
实施例1
本实施例中的荧光探针采用如下合成路线：
1)合成3-吡咯烷基-1-苯酚：
将3-氨基苯酚(1.0913g，10.0mmol)、碳酸钾(1.5203g，11.0mmol)和1，4-二溴丁烷(1340μL，11.0mmol)溶解于10mL DMF中。加热至80℃，反应2小时，冷却至室温。过柱提纯(展开剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10)，得到3-吡咯烷基苯酚，产率：58.8％。
表征如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6，TMS)：δH 7.10(t，1H)，6.19(t，2H)，6.09(s，1H)，4.86(s，1H)，3.28(t，4H)，2.02(t，4H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δC 156.55，149.47，130.06，104.81，102.57，98.69，47.71，and 25.44。
2)合成2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚
将3-吡咯烷基苯酚(324.6毫克，2毫摩尔)溶解在12毫升的浓盐酸(37wt％)和4mL的水混合溶剂中，将亚硝酸钠(138毫克，2毫摩尔)的4毫升水溶液加入到低于5℃的上述溶液中，混合物反应1.5小时并过滤。固体用饱和醋酸钠溶液洗涤三次，获得呈红褐色固体最终产物(340毫克，产率：88.4％)。
表征如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6，TMS)：δH 7.30(d，1H)，6.72(d，1H)，5.91(s，1H)，5.32(s，1H)，3.44(t，4H)，1.92(t，4H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δC 173.88，169.19，156.46，134.66，117.30，96.28，49.63，and 23.49。
3)合成3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮：
将2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚(720.75毫克，2.5毫摩尔)和1563微升80％的水合肼加入到17毫升乙醇中，将混合物加热至30-40℃，然后加入41.5毫克Pd-C催化剂。将上述混合物回流直至溶液的红色在氩气氛消失。加入2.5毫升丙酮酸乙酯，将反应溶液回流4小时。通过真空蒸馏得到的粗产物，并用乙酸乙酯/石油醚(1/20)为洗脱液过柱提纯得到终产物，产率为68％。
表征如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6，TMS)：δH 7.40(d，1H)，6.56(d，1H)，6.37(s，1H)，3.31(t，4H)，1.98(t，4H)，1.26(s，3H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δC 149.39，148.96，146.66，129.21，122.24，110.08，97.11，61.96，and 48.04。
4)合成7-(吡咯烷-1-)-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-3-甲醛：
将3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮(345.4毫克，1.5毫摩尔)与SeO2(204.4毫克，1.8毫摩尔)溶解在12mL1，4-二氧六环中，回流7小时。减压蒸馏，过柱分离提纯(展开剂为二氯甲烷/乙醇＝500∶1)得到产物(式III)，产率：84.7％。
表征如下：1H NMR(400MHz，CDCl3，TMS)：δH 10.08(s，1H)，7.67(d，1H)，6.68(d，1H)，6.31(s，1H)，3.51(t，4H)，2.15(t，4H).13C NMR(100MHz，CDCl3)：δC 187.86，153.07，152.64，151.30，134.17，133.42，124.64，112.46，96.96，48.59，and 25.33。
5)化合物2的制备：
称取4-羧基苯肼盐酸盐(500mg，2.46mmol)和氢氧化钠(98.5mg，2.46mmol)于100mL的茄形瓶中，加入适量的乙醇超声，室温条件下搅拌，溶解30min，随后将乙醇旋出，将剩余的固体转移至100mL三口瓶中，加入16mL冰乙酸溶解，再加入醋酸钠(405mg，4.94mmol)，超声溶解，最后加入3-甲基-2-丁酮(397μL，3.7mmol)，加热至100℃，回流16h，待反应完全后，停止反应，冷却至室温，减压蒸馏，旋出冰乙酸，用冰水冷却至0℃，慢慢加入饱和的碳酸钠溶液，直至没气泡产生为止，用盐酸调节pH＝4，用二氯甲烷萃取三次，收集油相，用无水硫酸钠干燥，抽滤，再旋出二氯甲烷，得红色油状物2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸(405mg，产率为81％)。
将2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸(1.0g，4.93mmol)和碘甲烷(700mg，4.93mmol)溶解于10毫升乙腈中。混合物加热回流反应12小时，冷却至室温。过滤旋蒸除去溶剂得到化合物2(0.76g，44.7％)。
化合物2表征如下：1H NMR(400MHz，DMSO-d6，TMS)：δH 8.38(s，1H)，8.19(d，1H)，8.03(d，21H)，4.00(s，3H)，2.82(s，3H)，1.57(sd，6H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δC199.48，166.95，142.42，141.72，132.04，130.83，124.68，115.85，54.72，35.52，21.96，and15.12。
6)近红外比率检测精氨酸的溶酶体定位荧光探针的制备：
将化合物3(209.9毫克，0.64毫摩尔)和化合物2(155.3毫克，0.64毫摩尔)溶解在17毫升乙醇中，加热至78℃并回流12小时。将反应溶液冷却至室温后过滤，滤饼用乙醚洗涤三次，得到为暗绿色固体，产率：76.4％。
表征如下：HRMS(EI)m/z：calcd for C26H26N3O4[M-I]，444.1923；found，444.1921.1H NMR(400MHz，DMSO-d6，TMS)：δH 8.39(s，1H)，8.24(s，1H)，8.19(d，1H)，8.02(d，1H)，7.80(d，1H)，7.66(d，1H)，6.96(d，1H)，6.67(s，1H)，4.04(s，3H)，3.59(t，4H)，2.00(t，4H)，1.79(s，6H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δC 166.99，153.39，145.75，143.88，133.14，131.55，131.04，127.48，124.22，115.58，114.86，98.14，52.30，49.49，34.98，26.22，and 25.25。
本实施例中制备的荧光探针的应用
荧光探针探针可以在水溶液中通过滴定的方式检测精氨酸，当精氨酸加入后溶液的颜色发生明显的变化由蓝色变为无色。由图1-3可以看出，精氨酸的水溶液(浓度0.1M)，通过滴定加入荧光探针(Vwater/VDMSO＝6/4，浓度1.0×10-5M)的水溶液中，紫外-可见光谱中650nm处的峰减弱消失，473nm出现新的吸收峰。
由图4-6可以看出荧光探针(浓度1.0×10-5M)滴定精氨酸水溶液(0-50.0当量)的荧光光谱中探针的水溶液的荧光光谱在470nm的光激发下，570nm处的荧光强度增强，720nm处的荧光强度减弱。由图7-8可以看出，探针识别精氨酸在5分钟内完成响应，2分钟内有明显的强度变化。图9和图10可以看出，通过精氨酸与生物小分子GSH，IIe，Pro，Thr，Ser，Met，Glc，His，Ala，Gly，Val，Leu，Phe，Cys，Asp，Glu，Tyr和Trp，及阳离子K+，Ca2+，Na+，Mg2+，Al3+，Zn2+，Ni2+，Hg2+，Mn2+和Cd2+和阴离子ClO4 -，SO4 2-，NO3 -，C2O4 2-，HSO3 -，HSO4 -，S2O3 2-，SH-，I-，N3 -，SO3 2-，ClO3 -，F-，Br-和Cl-的选择性和抗干扰性实验表明，探针分子对精氨酸具有很好的选择性和抗干扰性。由图15和图16可以看出，探针分子的时间、温度稳定性好。
图11和图12可以看出细胞荧光成像实验表明探针在细胞内具有细胞溶酶体定位的性质，可以实现比率荧光成像。

Claims (8)

1.一种溶酶体定位荧光探针，其特征在于，该探针的化学结构式如下：
2.如权利要求1所述的探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将化合物3和化合物2溶解在乙醇中，加热回流，将反应溶液冷却至室温后过滤，滤饼用乙醚洗涤；所述化合物3的结构为化合物2的结构为
3.如权利要求2所述的探针的制备方法，其特征在于，所述化合物3的合成方法如下：将3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮与SeO2溶解在1，4-二氧六环中，回流7小时，减压蒸馏，过柱分离提纯即得化合物3。
4.如权利要求3所述的探针的制备方法，其特征在于，所述3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮的合成方法如下：氩气保护下，将2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚和水合肼加入到乙醇中，将混合物加热，然后加入Pd-C催化剂，回流直至溶液的红色消失，然后加入丙酮酸乙酯，将反应溶液加热回流，通过真空蒸馏得到的粗产物，将粗产物过柱分离提纯即得3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮，3-甲基-7-(吡咯烷-1-)-2H-苯并[b][1，4]噁嗪-2-酮的结构式如下：
5.如权利要求4所述的探针的制备方法，其特征在于，所述2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚的合成方法如下：将3-吡咯烷基-1-苯酚溶解在浓盐酸和水混合溶剂中，将亚硝酸钠的水溶液加入到低于5℃的上述溶液中，反应并过滤，固体用饱和醋酸钠溶液洗涤三次即得2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚，2-亚硝基-5-吡咯烷-1-苯酚的结构式如下：
6.如权利要求5所述的探针的制备方法，其特征在于，所述3-吡咯烷基-1-苯酚的合成方法如下：将3-氨基苯酚、碳酸钾和1，4-二溴丁烷溶解于DMF中，加热至80℃，反应2小时，冷却至室温，过柱分离提纯即得3-吡咯烷基-1-苯酚，3-吡咯烷基-1-苯酚的结构式如下：
7.如权利要求2所述的探针的制备方法，其特征在于，所述化合物2的合成方法如下：取4-羧基苯肼盐酸盐和氢氧化钠，加入乙醇超声，室温条件下搅拌，溶解30min，随后将乙醇旋转蒸出，将剩余的固体转移至三口瓶中，加入冰乙酸溶解，再加入醋酸钠，超声溶解，最后加入3-甲基-2-丁酮，加热至100℃，回流反应16h，冷却至室温，减压蒸馏，旋转蒸出冰乙酸，用冰水冷却至0℃，慢慢加入饱和的碳酸钠溶液，直至没气泡产生为止，用盐酸调节pH＝4，用二氯甲烷萃取三次，收集油相，用无水硫酸钠干燥，抽滤，再旋转蒸出二氯甲烷，得红色油状物2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸；将2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸和碘甲烷溶解于乙腈中，混合物加热回流反应12小时，冷却至室温，过滤旋蒸除去溶剂得到化合物2。
8.如权利要求1所述的探针在近红外比率检测精氨酸中的应用。
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