CN106563004B - 碳纳米材料在制备天然产物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了碳纳米材料在制备天然产物的用途，通过使用碳纳米材料对复杂体系中天然产物进行高效率的提取分离，实现复杂体系中微量成分的快速、准确的定性和定量分析。本方法选择性好、简便、高效率，为天然产物的制备开辟了新的思路。

Description

碳纳米材料在制备天然产物的用途

技术领域

本发明涉及天然产物的制备方法领域，涉及复杂成分体系中有效成分的提取方法，具体地说碳纳米材料在制备天然产物的用途，运用氧化石墨烯从复杂成分体系中提取黄酮。

背景技术：

氧化石墨烯是近几年一种新兴的碳纳米材料，广泛用于环境监测与修复，染色剂分离，电化学材料以及药物体内释放载体。文献证明氧化石墨烯具有离域π电子体系的芳香烃骨架，可以与具有π-π共轭结构的化学结构结合在一起。另外，氧化石墨烯是石墨烯官能团修饰后的产物，其表面具有羟基、羧基、环氧基等基团，可以与具有羟基结构的化合物形成氢键儿结合在一起。根据此原理，氧化石墨烯将成为一种很好的多羟基芳香结构化合物的吸附剂。

Hao Chen提出了利用摇床震荡48小时的方法运用氧化石墨烯从复杂成分中分离出磺胺甲恶唑和环丙沙星，2011年Qian Liu运用微基质固相分散的方法使用氧化石墨烯提取复杂环境体系中的多溴联苯醚及其甲氧基化和羟基化的产物等，这些方法都是利用碳纳米材料这一特点作为吸附剂，分离具有共轭结构的化合物。

CN104496956A公开了：一种基于氨基化石墨烯的黄酮类成分提取分离方法，所述黄酮类成分包括黄酮、黄烷醇、异黄酮、双氢黄酮、双氢黄酮醇、黄烷酮、花色素、查耳酮和色原酮，所述提取分离方法为吸附萃取，所述吸附萃取介质为氨基化石墨烯；

第二步、植物浓缩液加入氨基化石墨烯材料转移进入超声器中400W超声萃取2h，用0.2μm微孔滤膜过滤，去离子水、乙醇洗涤多次，除去物理吸附的其它离子或有机物，得到吸附有黄酮类化合物的黑色固体；

第三步、洗涤分离，将第二步所得的黑色固体重新分散于去离子水中，调节pH值小于7，呈弱碱性的氨基化石墨烯与呈弱酸性的黄酮物类化合物结合力减弱逐渐分离。随后把浸泡有黑色固体的去离子水分散液中加入适量的丙酮，超声萃取1小时，使黄酮类化合物被萃取到丙酮相中。分离丙酮相，选装蒸发除去丙酮，用无水硫酸纳干燥，则分离得到最终的黄酮类化合物产品。最终分离得到的黄酮类成分包括黄酮、黄烷醇、异黄酮、双氢黄酮、双氢黄酮醇、黄烷酮、花色素、查耳酮和色原酮。

第四步、分离结束后将浸泡有氨基化石墨烯的分散液重新调节至弱碱性，过滤，反复去离子水洗涤，室温真空干燥24小时活化，可循环供后续分离环节使用。

CN103520275A公开了：一种氧化石墨烯-乙醇协同提取黄芩总黄酮的方法，其特征在于按以下步骤操作：将黄芩药材清洗除杂，干燥并粉碎后过10- 20目筛得黄芩粉料；将所述黄芩粉料和催化剂氧化石墨烯加入乙醇水溶液中进行回流提取，提取温度为50-70℃，提取时间为4-6小时，过滤后将滤液减压浓缩，回收溶剂，得到黄芩总黄酮浸膏；所述催化剂氧化石墨烯的添加量为所述黄芩粉料质量的0.005-0.5％；所述黄芩粉料与所述乙醇水溶液的质量体积比为1g∶10-20mL；所述乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为30-70％。

然而，所有这些方法操作都非常复杂，耗时长，其中步骤受人为因素较大，而且操作时间长，受外界干扰较多，重复性不好，且过程中所需的有机试剂用量较大。本发明提出了一种绿色、简便、省时、高效、重复性良好的方法，运用氧化石墨烯提取分离天然产物。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是通过使用氧化石墨烯采用适合的工艺条件对复杂体系中天然产物进行高效率的提取分离，实现复杂体系中微量成分的快速、准确的定性和定量分析。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备天然产物的用途。

本发明涉及一种碳纳米材料在提取天然产物的用途。

本发明涉及一种石墨烯在制备天然产物的用途。

本发明涉及一种石墨烯在提取天然产物的用途。

本发明涉及一种氧化石墨烯、石墨烯、氧化石墨烯、氨基化石墨烯、羧基化石墨烯、羟基石墨烯在制备天然产物的用途。

本发明涉及一种氧化石墨烯、石墨烯、氧化石墨烯、氨基化石墨烯、羧基化石墨烯、羟基石墨烯在提取天然产物的用途。

本发明涉及一种碳纳米材料在提取天然产物的用途。

本发明涉及一种石墨烯在提取天然产物的用途。

本发明涉及一种氧化石墨烯、石墨烯、氧化石墨烯、氨基化石墨烯、羧基化石墨烯、和、或、羟基石墨烯在提取天然产物的用途。

本发明涉及一种碳纳米材料在提取黄酮类化合物、酚酸类化合物、皂苷类化合物、和、或、环烯醚萜类化合物的用途。

本发明涉及一种石墨烯在提取黄酮类化合物、酚酸类化合物、皂苷类化合物、和、或、环烯醚萜类化合物的用途。

本发明涉及一种氧化石墨烯、石墨烯、氧化石墨烯、氨基化石墨烯、羧基化石墨烯、和、或、羟基石墨烯在提取黄酮类化合物、酚酸类化合物、皂苷类化合物、和、或、环烯醚萜类化合物的用途。

本发明涉及一种碳纳米材料在提取黄酮类化合物的用途。

本发明涉及一种石墨烯在提取黄酮类化合物的用途。

本发明涉及一种氧化石墨烯、石墨烯、氧化石墨烯、氨基化石墨烯、羧基化石墨烯、羟基石墨烯在提取黄酮类化合物的用途。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备酚酸类化合物的用途。

本发明涉及一种石墨烯在制备酚酸类化合物的用途。

本发明涉及一种氧化石墨烯、石墨烯、氧化石墨烯、氨基化石墨烯、羧基化石墨烯、羟基石墨烯在制备酚酸类化合物的用途。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备皂苷类化合物的用途。

本发明涉及一种石墨烯在制备皂苷类化合物的用途。

本发明涉及一种氧化石墨烯、石墨烯、氧化石墨烯、氨基化石墨烯、羧基化石墨烯、羟基石墨烯在制备皂苷类化合物的用途。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备环烯醚萜类化合物的用途。

本发明涉及一种石墨烯在制备环烯醚萜类化合物的用途。

本发明涉及一种氧化石墨烯、石墨烯、氧化石墨烯、氨基化石墨烯、羧基化石墨烯、羟基石墨烯在制备环烯醚萜类化合物的用途。

本发明涉及一种碳纳米材料在提取酚酸类化合物的用途。

本发明涉及一种石墨烯在提取酚酸类化合物的用途。

本发明涉及一种氧化石墨烯、石墨烯、氧化石墨烯、氨基化石墨烯、羧基化石墨烯、羟基石墨烯在提取酚酸类化合物的用途。

本发明涉及一种碳纳米材料在提取皂苷类化合物的用途。

本发明涉及一种石墨烯在提取皂苷类化合物的用途。

本发明涉及一种氧化石墨烯、石墨烯、氧化石墨烯、氨基化石墨烯、羧基化石墨烯、羟基石墨烯在提取皂苷类化合物的用途。

本发明涉及一种碳纳米材料在提取环烯醚萜类化合物的用途。

本发明涉及一种石墨烯在提取环烯醚萜类化合物的用途。

本发明涉及一种氧化石墨烯、石墨烯、氧化石墨烯、氨基化石墨烯、羧基化石墨烯、羟基石墨烯在提取环烯醚萜类化合物的用途。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备天然产物的用途，其步骤为：

(1)称碳纳米材料分散于溶液中，将复杂成分体系提取液与与碳纳米材料分散液混合，处理；

复杂成分体系提取液是从植物、动物、真菌、微生物、化学合成产品得到的含有多种成分的提取液；

(2)将步骤(1)中所得的混合物进行处理，得到化合物与碳纳米材料的结合物；

(3)将步骤(2)中所得沉淀与解吸附液处理，解吸附；

(4)将步骤(3)中所得的混合物处理，所得沉淀为解吸附后的碳纳米材料，上层溶液为分离出来的天然产物溶液；

(5)从天然产物溶液中制备化合物、提取物、组合物。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备天然产物的用途步骤为：

(1)称碳纳米材料分散于溶液中，将复杂成分体系提取液与碳纳米材料分散液混合，处理；

碳纳米材料为石墨烯、氧化石墨烯、或、氨基化石墨烯；

步骤(1)的溶液是：水溶液，有机溶液，或有机水混合溶液

步骤(1)的处理是：超声处理、加热回流处理、固相萃取处理；

复杂成分体系提取液是从植物、动物、真菌、微生物、化学合成产品得到的含有多种成分的提取液；

(2)将步骤(1)中所得的混合物进行处理，得到化合物与碳纳米材料的结合物；

步骤(2)的处理是：离心、静置；

(3)将步骤(2)中所得沉淀用解吸附进行处理，；

步骤(3)的处理包括：沉淀与解吸附液充分混合，在一定温度下超声处理，解吸附；或

步骤(3)的处理包括：沉淀与解吸附液充分混合，在一定温度下加热回流处理，解吸附；或

步骤(3)的处理包括：沉淀与解吸附液充分混合，在一定温度下处理，解吸附；

(4)将步骤(3)中所得的混合物处理，所得沉淀为解吸附后的碳纳米材料，上层溶液为分离出来的天然产物溶液；

(5)从天然产物溶液中制备化合物、提取物、组合物。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备天然产物的用途，其步骤为：

(1)称取碳纳米材料分散于水溶液中，将复杂成分体系提取液与氧化石墨烯水分散液混合，在一定适合条件下超声处理，其中复杂体系中包含黄酮类成分，以及其他不具有或具有弱π-π共轭结构的化合物；

(2)将步骤(1)中所得的混合物离心，所得沉淀为黄酮类化合物与碳纳米材料的结合物；

(3)将步骤(2)中所得沉淀与解吸附液充分混合，在一定温度下超声处理，解吸附；

(4)将步骤(3)中所得的混合物离心，所得沉淀为解吸附后的碳纳米材料单体，上层溶液为分离出来的黄酮类化合物溶液。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备天然产物的用途，其步骤为：

(1)称取氧化石墨烯分散于水溶液中，将复杂成分体系提取液与与氧化石墨烯水分散液混合，在一定适合条件下超声处理，其中复杂体系中包含黄酮类成分，以及其他不具有或具有弱π-π共轭结构的化合物；

(2)将步骤(1)中所得的混合物离心，所得沉淀为黄酮类化合物与氧化石墨烯的结合物；

(3)将步骤(2)中所得沉淀与解吸附液充分混合，在一定温度下超声处理，解吸附；

(4)将步骤(3)中所得的混合物离心，所得沉淀为解吸附后的氧化石墨烯单体，上层溶液为分离出来的黄酮类化合物溶液。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备天然产物的用途，其步骤为：所述复杂成分体系溶液为复杂体系由水、甲醇、乙醇、等有机试剂制备得到的天然产物提取液。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备天然产物的用途，步骤(3)中解吸附液可以为甲醇、乙醇、苯酚水溶液、异丙醇、或、丙酮、或它们之间的组合。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备天然产物的用途，其步骤为：

(5)利用适当的检测手段对步骤(4)中所得的黄酮类化合物溶液进行定性、定量。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备天然产物的用途，其步骤为：

步骤(5)中检测方法可以为高效液相色谱检测，或高分辨质谱检测。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备天然产物的用途，其步骤为：

步骤(1)中石墨烯分散液的终浓度为0.5-3mg/ml；

步骤(1)中超声处理温度为20-40℃，超声时间为10-60min，溶液酸碱度为偏酸性、中性、偏碱性。

步骤(2)及步骤(4)中离心转速6000-60000rpm，离心时间为5-30min。

步骤(3)中解吸附液可以为甲醇、乙醇、苯酚水溶液、异丙醇、或、丙酮、或他们之间的组合。

步骤(3)中超声处理温度为20-40℃，超声时间为10-60min，溶液酸碱度为偏酸性、中性、偏碱性。

本发明涉及一种碳纳米材料在制备天然产物的用途，其步骤为：

步骤(1)中石墨烯分散液的终浓度为1mg/ml；

步骤(1)中超声处理温度为30℃，超声时间为40min，溶液酸碱度为7；

步骤(2)及步骤(4)中离心转速13000rpm，离心时间为10min；

步骤(3)中解吸附液可以为甲醇、乙醇、苯酚水溶液、异丙醇、或、丙酮、或他们之间的组合；

步骤(3)中超声处理温度为30℃，超声时间为40min，溶液酸碱度为7。

本发明涉及一种运用氧化石墨烯从复杂成分体系中提取黄酮的方法，其包括以下步骤：

(1)取药材金银花粉，加入甲醇，加热回流，冷却至室温，

(2)取氧化石墨烯，加入水，另加入金银花提取液，超声处理，

(3)向沉淀中加入丙酮∶异丙醇混合液，使之分散均匀，超声处理。

(4)取出混合液，离心，吸取上层清液，得到金银花中黄酮类化合物的溶液，真空干燥即得金银花黄酮。

本发明涉及一种运用氧化石墨烯从复杂成分体系中提取黄酮的方法，其包括以下步骤：

(1)取药材金银花粉，加入甲醇，加热回流，冷却至室温，

(2)取氧化石墨烯，加入水，另加入金银花提取液，超声处理，

(3)向沉淀中加入7％苯酚水∶丙酮混合液，使之分散均匀，超声处理。

(4)取出混合液，离心，吸取上层清液，得到金银花中黄酮类化合物的溶液，真空干燥即得金银花黄酮。

本发明涉及一种运用氧化石墨烯提取金银花黄酮的方法，其包括以下步骤：

1.取药材金银花粉，加入甲醇，加热回流，冷却至室温，

2.取氧化石墨烯，加入水，另加入金银花提取液，超声处理，

3.向沉淀中加入7％苯酚水∶丙酮(v∶v＝4∶1)混合液，使之分散均匀，超声处理40min。

4.取出混合液，离心，吸取上层清液，得到金银花中黄酮类化合物的溶液，真空干燥即得金银花黄酮。

本发明涉及一种运用氧化石墨烯提取金银花黄酮的方法，其包括以下步骤：

1.取药材金银花粉，加入甲醇，加热回流，冷却至室温，

2.取氧化石墨烯，加入水，另加入金银花提取液，超声处理，

3.向沉淀中加入丙酮∶异丙醇(v∶v＝4∶1)混合液，使之分散均匀，超声处理40min。

4.取出混合液，离心，吸取上层清液，得到金银花中黄酮类化合物的溶液，真空干燥即得金银花黄酮。

本发明涉及一种运用氧化石墨烯提取金银花黄酮的方法，其包括以下步骤：

1.取药材灰毡毛忍冬粉末，加入甲醇，加热回流，冷却至室温，

2.取氧化石墨烯，加入水，另加入金银花提取液，超声处理，

3.向沉淀中加入7％苯酚水∶丙酮(v∶v＝4∶1)混合液，使之分散均匀，超声处理40min。

4.取出混合液，离心，吸取上层清液，得到金银花中黄酮类化合物的溶液，真空干燥即得灰毡毛忍冬黄酮。

本发明涉及一种运用氧化石墨烯提取金银花黄酮的方法，其包括以下步骤：

1.取药材黄褐毛忍冬粉末，加入甲醇，加热回流，冷却至室温，

2.取氧化石墨烯，加入水，另加入金银花提取液，超声处理，

3.向沉淀中加入丙酮∶异丙醇(v∶v＝4∶1)混合液，使之分散均匀，超声处理40min。

4.取出混合液，离心，吸取上层清液，得到金银花中黄酮类化合物的溶液，真空干燥的黄褐毛忍冬黄酮。

本发明涉及一种金银花中黄酮类化合物的定量分析方法：

需进行定量的15种化合物的标准品(毛蕊异黄酮、金合欢素、芹菜素、染料木素、香叶木素、槲皮素、木犀草素、柏木双黄酮、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、异槲皮苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、芦丁、苜蓿素-7-O-葡萄糖苷)，作出15条相应的标准曲线，得到浓度关于峰面积的标准曲线方程，将待测物质中相应化合物峰面积带入得到浓度，进行定量分析；

定量分析中运用的是高效液相仪器，C18反相色谱柱，

流动相A为甲酸水，流动相B为甲醇。

流动相洗脱梯度为

0-2min，30-36％B；

2-5min，36％B；

5-7min，36-50％B；

7-10min，50-55％B，

10-12min，55-70％B，

12-12.5min，70-100％B，

12.5-17min，100％B。

进入三重四级杆质谱检测不需要检测波长，

本发明的优选过程：

本发明以氧化石墨烯作为吸附剂，而不是催化剂。CN103520275A中氧化石墨烯是作为黄芩提取过程中催化剂的存在。

碳纳米材料-石墨烯结构中具有大π键的结构，此结构决定了石墨烯是一种良好的吸附剂，而本发明中所选用的碳纳米材料为氧化石墨烯，其为石墨烯经过多种官能团修饰后的产物，具有羟基、羧基、环氧基、氨基等多种官能团。它比一般普通石墨烯和单官能团修饰的石墨烯具有更多的性质和特点。不但能通过π-π共轭来达到吸附的目的，而且可以通过上面各种官能团发挥作用与被吸附物质产生氢键进而加强吸附的作用。

本发明以选择了多种类型的石墨烯作为吸附剂，如石墨烯、氧化石墨烯、氨基化石墨烯、羧基化石墨烯、羟基石墨烯。

本发明优选氧化石墨烯作为吸附剂。如图5、6、7、8、9所示，氧化石墨烯比氨基化石墨烯及其他种类的石墨烯在本发明中具有更好的吸附效率，峰面积与峰数均更优如图5中提取出黄酮类化合物的峰峰面积与峰高均明显高于图 6-9，高效液相图5中经氧化石墨烯处理后可以得到的有效黄酮峰的数量大于 30个，而图6-9中得到的有效黄酮峰数均不超过20个。且相同的黄酮物质在图 5中的峰面积明显高于其他四组，例如保留时间约在38分钟的一个黄酮峰，在图5中的峰面积为42，在图6-9中峰面积均不超过30。此结果可以充分说明氧化石墨烯能达到更好的黄酮富集效果。

吸附过程的我们优化了主要影响吸附效率的三个因素。

首先，我们优选了石墨烯的用量。在相同金银花提取液用量的情况下，我们分别考察了氧化石墨烯终浓度0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml的吸附效果。结果显示浓度为1mg/ml时吸附效率达到98％，且在氧化石墨烯终浓度超过1mg/ml后吸附效率便不再增加，故最后选取1mg/ml为实验用氧化石墨烯浓度。

未运用静置的方法因为静置吸附所需的时间过长，且不能很好的使提取液与氧化石墨烯接触，吸附效率不高。加热回流的方式，首先是考虑到设备、步骤简单化，同时加热回流时对氧化石墨烯不可避免的会有一些损失，吸附效率不高，本发明优选超声处理。

其次，考察了超声处理的时间，这也是一个重要的影响因素。超声时间在 40min时，吸附效果达到峰值98％，且随着时间增加吸附效率降低，所以 40min是我们优选出的最佳时间。

吸附效率的计算方法：

吸附效率是相同浓度的两份药材提取液，一份经过氧化石墨烯提取为A，另一份不经过氧化石墨烯提取为B。二者同浓度等体积进样，分别得到黄酮类物质总面积A和黄酮类总峰面积B。吸附效率＝黄酮类物质总面积A/黄酮类总峰面积B×100％。

然后，也对整个混合液体系的酸碱度对最后吸附效率的影响做了考察。在偏酸性、中性、偏碱性的体系中，中性体系表现出了良好的结果，故吸附实验选择在中性环境下进行。

酸碱度	吸附效率
		偏酸性	90％
中性	98％
		偏碱性	95％

解吸附液的种类在这个过程中具有重要的意义，根据需要解吸附的黄酮种类以及复杂体系种类，我们选择了如下解吸附液。

本发明的解吸附液是由于如下组分组成的：

丙酮、苯酚、异丙醇、水，或、和、它们之间的任何组合

本发明的优选解吸附液，丙酮∶异丙醇(v∶v＝4∶1)混合液，它对黄酮苷元类物质的解吸附能力比较强，解吸附效率可以达到85％以上；

本发明的优选解吸附液，7％苯酚水∶丙酮(v∶v＝4∶1)混合液，它对黄酮苷类物质的解吸附能力比较强，解吸附效率可以达到85％以上。

黄酮苷元的具体类型：毛蕊异黄酮、金合欢素、芹菜素、染料木素、香叶木素、槲皮素、木犀草素、柏木双黄酮

黄酮苷的具体类型：木犀草素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、异槲皮苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、芦丁、苜蓿素-7-O-葡萄糖苷

本发明对超声处理时间和处理后样品中可定性的黄酮类物质峰数目的关系考察如下。

超声时间	可定性的黄酮类物质峰数目(个)
		10min	25
20min	32
		30min	35
40min	41
		50min	40

超声40min时，处理后样品中可定性的黄酮类物质峰有41个，比30min 是多6个，而后随着时间的增加，峰数不会再增加，故最终确定超声处理时间为41分钟。整个体系的酸碱度也维持在pH＝7的中性环境，目的是为了保证黄酮类物质结构的稳定不变。

以上研究表明在吸附过程中混合物超声时间、溶液酸碱度和氧化石墨烯用量以及解吸附过程中解吸附液的种类、超声时间和溶液酸碱度对不同复杂体系中黄酮类成分的提取都具有不同程度的影响。

本发明基于如下原理：氧化石墨烯可通过物理吸附距离下的π键堆叠与黄酮类化合物的共轭体系相互作用，同时氧化石墨烯上羟基、羧基等官能团可以与黄酮类化合物的羟基形成氢键，在这两种物理吸附作用下可以运用氧化石墨烯将黄酮类化合物从复杂体系中提取分离出来。

本发明优点如下：

操作简便。本发明改良了之前氧化石墨烯作为吸附剂的方法，运用简单的超声处理方法代替固相萃取、微固相分散长时间摇床震荡等方法，减少了中间步骤可能会出现的误差，宜于控制外界条件。

可重复性强。氧化石墨烯在水中形成均一分散的混悬液，性质稳定，与提取液进行超声处理，受外界影响较少，样品处理时重复性好，可用于定量分析。

应用效果好。氧化石墨烯作为黄酮类物质的吸附剂，其水分散液性质稳定，可以与多种性质的复杂体系混合不发生化学变化。且在解吸附过程中，经过鉴定黄酮类化合物的结构不会发生变化，表明本技术具有很好的稳定性及可靠性。可以广泛运用于各种复杂体系中黄酮类化合物的提取。

提取效率高。复杂体系中微量黄酮类成分提取效率高，可以用于微量成分在复杂体系中的定性定量。

附图说明：

图1：四种标准品混合物高效液相图

图2：氧化石墨烯与标准品混合液吸附后，离心所取上层清液的高效液相图

图3：解吸附试验后，离心所取上层清液的高效液相图

图4：金银花药材提取液的高分辨质谱扫描图

图5：经过氧化石墨烯提取的金银花药材提取液的超高效液相图

图6：经过石墨烯超声提取的金银花药材提取液的超高效液相图

图7：经过羧基化石墨烯提取的金银花药材提取液的超高效液相图

图8：经过氨基化石墨烯提取的金银花药材提取液的超高效液相图

图9：经过羟基化石墨烯提取的金银花药材提取液的超高效液相图

图10：未经处理的金银花提取液高效液相图谱

图11：经过氧化石墨烯处理后，上层清液的高效液相图谱

图1的具体解释：图1的1-4峰分别对应马钱子苷、绿原酸、川续断皂苷乙以及木犀草素(黄酮)。

图2的具体解释：图2的1-3峰分别对应马钱子苷、绿原酸和川续断皂苷乙。

图3的具体解释：图3的4峰对应木犀草素(黄酮)。

图4的具体解释，图4由图4A和图4B两部分组成；

图4A：未经过提取的金银花药材提取液的高分辨质谱扫描图；

图4B；经过氧化石墨烯提取的金银花药材提取液的高分辨质谱扫描图

具体实验方案：

下面结合附图通过优选实施例的方式对本发明作进一步的说明，应理解，所给出的实施例仅起到举例说明的目的，并非为了限制本发明的范围。

实施例一：利用氧化石墨烯分离含有木犀草素的标准品混合物

1.将标准品木犀草素(黄酮类)、绿原酸(酚酸类)、川续断皂苷乙(皂苷类)、马钱子苷(环烯醚萜类)各精确称取0.5mg，混匀，溶于甲醇，制成各浓度为0.5mg/ml的标准品混合液。

2.准确称取氧化石墨烯1mg，溶于水中，形成均以稳定的氧化石墨烯水分散液。

3.将氧化石墨烯水分散液与标准品混合液混和均匀，用少量NaOH调整混合液的酸碱度，使pH维持在7。

4.将混合物进行超声处理40min，取出，13000rpm离心10min，吸取上层清液待进入液相检测。

5.将4中沉淀分散到1ml甲醇中，并用甲酸调节混合液酸碱度使pH维持在7。

6.将混合液进行超声处理40min，取出，13000rpm离心10min，吸取上层清液待进入液相检测。

7.分别收集马钱子苷、绿原酸、川续断皂苷乙的流分，挥干溶剂，精制，得到马钱子苷、绿原酸、川续断皂苷乙。

结果分析：

如图1为分离前混和标准品的高效液相图，其中四个峰分别对应马钱子苷、绿原酸、川续断皂苷乙以及木犀草素。

如图2为上述步骤4中上层清液的高效液相图，其中三个峰分别对应钱子苷、绿原酸和川续断皂苷乙，这表明木犀草素(黄酮类)已经与其他三种物质分类，与氧化石墨烯结合，存在在步骤4中所产生的沉淀中。

如图3为最终步骤6中上层清液的高效液相图，其中可以清晰、明确的看到木犀草素的峰，表示木犀草素已与氧化石墨烯分离，溶解在甲醇中。且根据峰面积可以计算出木犀草素的分离提取效率已达到100％如表1所示。

表1

实施例二：氧化石墨烯萃取金银花中黄酮类化合物

1.精确称取药材金银花粉末0.5g，加入30ml甲醇，加热回流1.5h，冷却至室温，用甲醇补足损失重量，过滤，待分析。

2.准备两个1.5mlEP管分别编号A和B，每个EP管中各准确称取1mg氧化石墨烯，加入800μl水，另加入金银花提取液200μl，测得pH为7，超声处理 40min。

3.分别取出两管混合液，13000rpm离心10min。

4.向A管沉淀中加入丙酮∶异丙醇(v∶v＝4∶1)混合液500μl，向B管沉淀中加入7％苯酚水∶丙酮(v∶v＝4∶1)混合液500μl。使之分散均匀，超声处理 40min。

5.分别取出两管混合液，13000rpm离心10min，吸取上层清液进行高分辨质谱定性分析。

6.并运用这种方法所对来自不同产地的4批金银花中黄酮类化合物进行三重四级杆定量分析。

7.定量方法为标准品绝对定量。

取需进行定量的15种化合物的标准品(毛蕊异黄酮、金合欢素、芹菜素、染料木素、香叶木素、槲皮素、木犀草素、柏木双黄酮、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、异槲皮苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、芦丁、苜蓿素-7-O-葡萄糖苷)，作出15条相应的标准曲线，得到浓度关于峰面积的标准曲线方程，将待测物质中相应化合物峰面积带入得到浓度，进行定量分析。

定量分析中运用的是高效液相仪器，C18反相色谱柱，流动相A为甲酸水，流动相B为甲醇。流动相洗脱梯度为0-2min，30-36％B；2-5min，36％B；5- 7min，36-50％B；7-10min，50-55％B，10-12min，55-70％B，12-12.5min，70-100％B， 12.5-17min，100％B。进入三重四级杆质谱检测不需要检测波长，是同一个液相条件就可以分离检测出来15个峰。

结果分析：

如图4A为未经处理的金银花提取液中各类成分的高分辨质谱扫描图，其中可被检测出的黄酮类成分有22种，而图4B所示为经过氧化石墨烯处理后提取液的高分辨质谱扫描图，其中可被检测出的黄酮类成分有41种。

以下为41中黄酮类化合物的结构。

Compounds	R<sub>1</sub>	R<sub>2</sub>	R<sub>3</sub>	R<sub>4</sub>
					F4	OH	OH	H	Rha
F5	H	OH	H	Glc
					F9	OH	OH	Glc	H
F17	OH	OH	H	Rha<sup>1-6</sup>Glc
					F18	OH	OH	H	Glc
F19	OH	OH	Gal	H
					F24	H	OH	H	Rha<sup>1-6</sup>Glc
F25	OCH<sub>3</sub>	OH	H	Glc
					F26	OCH<sub>3</sub>	OH	H	Rha<sup>1-6</sup>Glc
F27	OH	OH	H	H

Compounds	R<sub>1</sub>	R<sub>2</sub>	R<sub>3</sub>
				F11	H	CH<sub>3</sub>	Glc
F20	Glc	H	H
				F30	H	H	H
F34	H	H	H
				F40	H	CH<sub>3</sub>	H

表2为4批金银花药材中黄酮类化合物定量的结果。

结合上述图4结果可见，经过优化后的氧化石墨烯辅助提取方法提取出金银花中的黄酮类化合物比未经处理的金银花提取液中黄酮类化合物种类多19种，这表明经过氧化石墨烯前处理后，一些高含量的非黄酮类化合物被除掉，而且清晰可见图4A中一些峰度很高的非黄酮类杂质，在图4B中消失不见，这说明经过氧化石墨烯吸附处理之后大部分非黄酮类物质已经被剔除掉，例如图4 中保留时间在6至9分钟时，A图中有三个峰度很高、峰面积很大的杂质峰，在B图中消失不见这样就减少了大量非黄酮类物质的干扰，从而使一些微量的黄酮类化合物得到充分暴露，大大增加了药材金银花中可定性的黄酮类成分的数量。

表2

JYH-Shandong1山东产的金银花1，JYH-Shandong2山东产的金银花2，

JYH-Henan河南产的金银花，JYH-Hunan湖南产的金银花；

氧化石墨烯萃取药材金银花中黄酮类成分的方法与三重四级杆定量分析的方法结合定量了来自不同产地的4批金银花药材中有代表性的15种黄酮类成分。这是首次对金银花药材中黄酮类活性成分进行定量，因黄酮类成分在金银花药材中含量很低，未经处理，以现有的检测手段很难对其进行准确定量，故罕有报道对金银花药材中黄酮类成分单体进行定量的结果。

实施例三：氧化石墨烯萃取定量灰毡毛忍冬中黄酮类化合物

1.精确称取药材灰毡毛忍冬粉末0.5g，加入30ml甲醇，加热回流1.5h，冷却至室温，用甲醇补足损失重量，过滤，待分析。

2.准备两个1.5mlEP管分别编号A和B，每个EP管中各准确称取1mg氧化石墨烯，加入800μl水，另加入金银花提取液200μl，测得pH为7，超声处理 40min。

3.分别取出两管混合液，13000rpm离心10min。

4.向A管沉淀中加入丙酮∶异丙醇(v∶v＝4∶1)混合液500μl，向B管沉淀中加入7％苯酚水∶丙酮(v∶v＝4∶1)混合液500μl。使之分散均匀，超声处理 40min。

5.分别取出两管混合液，13000rpm离心10min，吸取上层清液进行高分辨质谱定性分析。

6.并运用这种方法所对来自不同产地的3批灰毡毛忍冬中黄酮类化合物进行三重四级杆定量分析。

7.定量方法同实施例一。

表3

HZM-Chongqing 收集地为重庆的灰毡毛忍冬

HZM-Hunan 收集地为湖南的灰毡毛忍冬

HZM-Guizhou 收集地为贵州的灰毡毛忍冬

实施例四：氧化石墨烯萃取定量黄褐毛忍冬中黄酮类化合物

1.精确称取药材黄褐毛忍冬粉末0.5g，加入30ml甲醇，加热回流1.5h，冷却至室温，用甲醇补足损失重量，过滤，待分析。

2.准备两个1.5mlEP管分别编号A和B，每个EP管中各准确称取1mg氧化石墨烯，加入800μl水，另加入金银花提取液200μl，测得pH为7，超声处理 40min。

3.分别取出两管混合液，13000rpm离心10min。

4.向A管沉淀中加入丙酮∶异丙醇(v∶v＝4∶1)混合液500μl，向B管沉淀中加入7％苯酚水∶丙酮(v∶v＝4∶1)混合液500μl。使之分散均匀，超声处理40min。

5.分别取出两管混合液，13000rpm离心10min，吸取上层清液进行高分辨质谱定性分析。

6.并运用这种方法对来自不同产地的3批黄褐毛忍冬中黄酮类化合物进行三重四级杆定量分析。

7.定量方法同实施例一。

表4

HHM-Zewu 收集地为则戊的黄褐毛忍冬

HHM-Jingnan 收集地位敬南的黄褐毛忍冬

HHM-Xingyi 收集地为兴义的黄褐毛忍冬

实施例五：氧化石墨烯萃取金银花中酚酸类化合物、皂苷类化合物、环烯醚萜类化合物

1.精确称取药材金银花粉末0.5g，加入30ml甲醇，加热回流1.5h，冷却至室温，用甲醇补足损失重量，过滤，待分析。

2.准备1.5mlEP管，准确称取1mg氧化石墨烯，加入800μl水，另加入金银花提取液200μl，测得pH为7，超声处理40min。

3.取出混合液，13000rpm离心10min。

4.吸取上层清液进行HPLC-高分辨质谱定性分析，分别为：酚酸类化合物、皂苷类化合物、环烯醚萜类化合物：

5.收集上层清液的制备高效液相的馏分，挥干溶剂，精制，分别得到：酚酸类化合物、皂苷类化合物、环烯醚萜类化合物：

对比图10(未经处理的金银花提取液高效液相图谱)与图11(经过氧化石墨烯处理后，上层清液<即除去黄酮后>的高效液相图谱)，可以看出，图11的色谱峰明显比图10的色谱峰分离度高，且每个峰的独立性更好，这说明在去除一些低含量黄酮类成分后，金银花中非黄酮类的其他成分如酚酸类成分、环烯醚萜类成分、皂苷类成分等可以被更好的分离提取出来。且如图可以看出，原金银花药材提取液中各类显著性成分(标*号的峰)的峰面积及峰度在经过氧化石墨烯处理后未有显著性变化，表明在氧化石墨烯处理时，药材提取液中的各类成分为发生结构以及含量等变化，故此方法可用于金银花提取液中其他成分的分离提取，并可以用于定性、定量分析。

虽然已经对本发明的具体实施方式进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims (1)

1.一种碳纳米材料用于提取灰毡毛忍冬或黄褐毛忍冬中黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述碳纳米材料为氧化石墨烯，该方法包括如下步骤：

步骤S1，取灰毡毛忍冬或黄褐毛忍冬粉末，加入适量甲醇热回流提取，冷却；

步骤S2，取氧化石墨烯，加入适量水，再加入上述甲醇提取液，超声处理，离心；

步骤S3，收集步骤S2所得沉淀，向沉淀中加入解析液，分散均匀，超声处理，所述解析液为体积比为4∶1的丙酮-异丙醇混合液，或体积比为4∶1的7％苯酚水-丙酮混合液；

步骤S4，离心，收集上清液，真空干燥即得。

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