CN106556698A - 一种空肠弯曲菌检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种空肠弯曲菌检测方法，包括以下步骤：a)将待测样品加样于包被有捕捉抗体的固相载体，从而使待测样品中的空肠弯曲菌与固相载体上的捕捉抗体结合，形成带有“空肠弯曲菌‑捕捉抗体”二元复合物的固相载体；所述的捕捉抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体3G2D8H3G9，所述的单克隆抗体3G2D8H3G9由小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9，CGMCCNo.8766产生；b)将检测抗体加样于a)获得的固相载体，从而形成带有“检测抗体‑空肠弯曲菌‑捕捉抗体”三元复合物的固相载体。本发明空肠弯曲菌检测方法，有效提升了空肠弯曲菌的检测速度，而且操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体是一种空肠弯曲菌检测方法。
背景技术
空肠弯曲菌(Campylobacter)，属螺旋菌科、革兰氏阴性，菌体轻度弯曲似逗点状，长1.5～5μm，宽0.2～0.8μm，菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼。该菌种于1973年自腹泻病人粪便中首次分离，是导致人类腹泻的主要致病菌之一。空肠弯曲菌有内毒素能侵袭小肠和大肠粘膜引起急性肠炎，亦可引起腹泻的暴发流行或集体食物中毒。潜伏期一般为3～5天，对人的致病部位是空肠、回肠及结肠。主要症状为腹泻和腹痛，有时发热，偶有呕吐和脱水。细菌有时可通过肠粘膜入血流引起败血症和其他脏器感染，如脑膜炎、关节炎、肾盂肾炎等。孕妇感染本菌可导致流产，早产，而且可使新生儿受染。在这种情况下，建立灵敏、快速的检测方法是有效防治空肠弯曲菌的重要技术前提。现有技术中针对空肠弯曲菌检测方法主要是生化鉴定方法，但检测时间长、试剂成本高、尤其空肠弯曲菌的微需氧特性，使其分离培养更为困难，需要额外的维持微需氧条件的设施和试剂，近年来，随着分子生物学的发展，DNA测序技术在空肠弯曲菌的检测中得到了广泛的应用，此类方法敏感性较高、特异性较强，但缺陷也较为突出一方面其成本较高，此外操作步骤相对繁琐、耗时较长，因此此类方法的产业化应用始终受到限制。近年来，酶联免疫吸附法(ELISA)在空肠弯曲菌的检测中受到了越来越多的重视，此类方法因具有快速、灵敏、特异、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，因此特别适用于大批量样品的检测。然而，现有技术中检测空肠弯曲菌的ELISA方法普遍基于辣根过氧化物酶标记的抗体或抗原催化双氧水生成羟自由基，进而氧化无色的化学显色底物四甲基联苯二胺(TMB)形成蓝色产物，然后使用终止液(2MH2SO4)终止反应形成黄色溶液于450nm处记录吸光度值。该类方法因其显色强度较低，因此检测灵敏度相对较低，当待测样品中目标物含量较低时易出现假阴性结果，从而无法满足实际应用的要求。近年来，一些新型的信号传导机制被报道用于替代传统ELISA的信号传导机制用于提高ELISA的灵敏度，如放射免疫分析底物、化学发光底物、荧光底物以及共振胶体金溶液等。然而，发光体系的构建需要充分考虑被检测对象的分子生物学性质，例如在方法层面，抗体的包被及其与抗原的结合性能，选用何种标记物酶及其与抗体的偶联方法，显色底物的选择以及具体发光方法；在效果层面，既要保证显色反应的灵敏性，又应满足显色强度与目标物含量的线性关系。因此，针对空肠弯曲菌的ELISA检测方法，尤其以提升其检测灵敏性为目的的方法改进，具有突出的技术难度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种空肠弯曲菌检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种空肠弯曲菌检测方法，包括以下步骤：a)将待测样品加样于包被有捕捉抗体的固相载体，从而使待测样品中的空肠弯曲菌与固相载体上的捕捉抗体结合，形成带有“空肠弯曲菌-捕捉抗体”二元复合物的固相载体；所述的捕捉抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体3G2D8H3G9，所述的单克隆抗体3G2D8H3G9由小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9，CGMCCNo.8766产生；b)将检测抗体加样于a)获得的固相载体，从而形成带有“检测抗体-空肠弯曲菌-捕捉抗体”三元复合物的固相载体；所述的检测抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体4C9E1G7H3，所述的单克隆抗体4C9E1G7H3由小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3，CGMCCNo.8457产生，且所述的单克隆抗体4C9E1G7H3携带一可检测标记物；c)包被空肠弯曲菌抗体；d)取步骤c)包被后的抗体，与待测样品混合后于35～39℃避光环境中反应40～80min，洗涤；e)而后加入生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体混合，于35～39℃避光环境中反应40～80min，洗涤；f)而后加入链霉亲和素标记的触酶C100混合，于35～39℃避光环境中反应40～80min，洗涤；g)而后加入浓度为8～12μmol/L的双氧水溶液混合，于35～39℃避光环境中反应20～40min；h)而后加入巯基丙酸修饰的碲化镉量子点混合，于35～39℃避光环境中反应10～20min；i)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待测样品中空肠弯曲菌的存在与否以及存在的量。
作为本发明进一步的方案：所述的固相载体为酶标反应板。
作为本发明进一步的方案：所述的可检测标记物为辣根过氧化物酶。
作为本发明再进一步的方案：所述生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体是通过以下方法制备的：配制含有1～3mg/mL空肠弯曲菌单克隆抗体、0.07～0.08mg/mL生物素的PBS溶液，于避光条件下反应30～60min，所述PBS溶液的浓度为0.005～0.02mol/L，而后透析去除生物素，即得到所述生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明空肠弯曲菌检测方法，有效提升了空肠弯曲菌的检测速度，而且操作简单。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明实施例中，一种空肠弯曲菌检测方法，包括以下步骤：a)将待测样品加样于包被有捕捉抗体的固相载体，从而使待测样品中的空肠弯曲菌与固相载体上的捕捉抗体结合，形成带有“空肠弯曲菌-捕捉抗体”二元复合物的固相载体；所述的捕捉抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体3G2D8H3G9，所述的单克隆抗体3G2D8H3G9由小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9，CGMCCNo.8766产生；b)将检测抗体加样于a)获得的固相载体，从而形成带有“检测抗体-空肠弯曲菌-捕捉抗体”三元复合物的固相载体；所述的检测抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体4C9E1G7H3，所述的单克隆抗体4C9E1G7H3由小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3，CGMCCNo.8457产生，且所述的单克隆抗体4C9E1G7H3携带一可检测标记物；c)包被空肠弯曲菌抗体；d)取步骤c)包被后的抗体，与待测样品混合后于35～39℃避光环境中反应40～80min，洗涤；e)而后加入生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体混合，于35～39℃避光环境中反应40～80min，洗涤；f)而后加入链霉亲和素标记的触酶C100混合，于35～39℃避光环境中反应40～80min，洗涤；g)而后加入浓度为8～12μmol/L的双氧水溶液混合，于35～39℃避光环境中反应20～40min；h)而后加入巯基丙酸修饰的碲化镉量子点混合，于35～39℃避光环境中反应10～20min；i)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待测样品中空肠弯曲菌的存在与否以及存在的量。所述的固相载体为酶标反应板。所述的可检测标记物为辣根过氧化物酶。所述生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体是通过以下方法制备的：配制含有1～3mg/mL空肠弯曲菌单克隆抗体、0.07～0.08mg/mL生物素的PBS溶液，于避光条件下反应30～60min，所述PBS溶液的浓度为0.005～0.02mol/L，而后透析去除生物素，即得到所述生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体。
实施例1：
本发明空肠弯曲菌检测方法，包括以下步骤：a)将待测样品加样于包被有捕捉抗体的固相载体，从而使待测样品中的空肠弯曲菌与固相载体上的捕捉抗体结合，形成带有“空肠弯曲菌-捕捉抗体”二元复合物的固相载体；所述的捕捉抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体3G2D8H3G9，所述的单克隆抗体3G2D8H3G9由小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9，CGMCCNo.8766产生；b)将检测抗体加样于a)获得的固相载体，从而形成带有“检测抗体-空肠弯曲菌-捕捉抗体”三元复合物的固相载体；所述的检测抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体4C9E1G7H3，所述的单克隆抗体4C9E1G7H3由小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3，CGMCCNo.8457产生，且所述的单克隆抗体4C9E1G7H3携带一可检测标记物；c)包被空肠弯曲菌抗体；d)取步骤c)包被后的抗体，与待测样品混合后于35℃避光环境中反应40～80min，洗涤；e)而后加入生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体混合，于35℃避光环境中反应40min，洗涤；f)而后加入链霉亲和素标记的触酶C100混合，于35～℃避光环境中反应40min，洗涤；g)而后加入浓度为8μmol/L的双氧水溶液混合，于35℃避光环境中反应20～40min；h)而后加入巯基丙酸修饰的碲化镉量子点混合，于35℃避光环境中反应10min；i)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待测样品中空肠弯曲菌的存在与否以及存在的量。所述的固相载体为酶标反应板。所述的可检测标记物为辣根过氧化物酶。所述生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体是通过以下方法制备的：配制含有1mg/mL空肠弯曲菌单克隆抗体、0.07mg/mL生物素的PBS溶液，于避光条件下反应30min，所述PBS溶液的浓度为0.005mol/L，而后透析去除生物素，即得到所述生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体。
实施例2：
本发明空肠弯曲菌检测方法，包括以下步骤：a)将待测样品加样于包被有捕捉抗体的固相载体，从而使待测样品中的空肠弯曲菌与固相载体上的捕捉抗体结合，形成带有“空肠弯曲菌-捕捉抗体”二元复合物的固相载体；所述的捕捉抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体3G2D8H3G9，所述的单克隆抗体3G2D8H3G9由小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9，CGMCCNo.8766产生；b)将检测抗体加样于a)获得的固相载体，从而形成带有“检测抗体-空肠弯曲菌-捕捉抗体”三元复合物的固相载体；所述的检测抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体4C9E1G7H3，所述的单克隆抗体4C9E1G7H3由小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3，CGMCCNo.8457产生，且所述的单克隆抗体4C9E1G7H3携带一可检测标记物；c)包被空肠弯曲菌抗体；d)取步骤c)包被后的抗体，与待测样品混合后于39℃避光环境中反应80min，洗涤；e)而后加入生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体混合，于39℃避光环境中反应80min，洗涤；f)而后加入链霉亲和素标记的触酶C100混合，于39℃避光环境中反应80min，洗涤；g)而后加入浓度为12μmol/L的双氧水溶液混合，于39℃避光环境中反应40min；h)而后加入巯基丙酸修饰的碲化镉量子点混合，于39℃避光环境中反应20min；i)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待测样品中空肠弯曲菌的存在与否以及存在的量。所述的固相载体为酶标反应板。所述的可检测标记物为辣根过氧化物酶。所述生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体是通过以下方法制备的：配制含有3mg/mL空肠弯曲菌单克隆抗体、0.08mg/mL生物素的PBS溶液，于避光条件下反应60min，所述PBS溶液的浓度为0.02mol/L，而后透析去除生物素，即得到所述生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体。
实施例3：
本发明空肠弯曲菌检测方法，包括以下步骤：a)将待测样品加样于包被有捕捉抗体的固相载体，从而使待测样品中的空肠弯曲菌与固相载体上的捕捉抗体结合，形成带有“空肠弯曲菌-捕捉抗体”二元复合物的固相载体；所述的捕捉抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体3G2D8H3G9，所述的单克隆抗体3G2D8H3G9由小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9，CGMCCNo.8766产生；b)将检测抗体加样于a)获得的固相载体，从而形成带有“检测抗体-空肠弯曲菌-捕捉抗体”三元复合物的固相载体；所述的检测抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体4C9E1G7H3，所述的单克隆抗体4C9E1G7H3由小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3，CGMCCNo.8457产生，且所述的单克隆抗体4C9E1G7H3携带一可检测标记物；c)包被空肠弯曲菌抗体；d)取步骤c)包被后的抗体，与待测样品混合后于37℃避光环境中反应60min，洗涤；e)而后加入生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体混合，于37℃避光环境中反应40min，洗涤；f)而后加入链霉亲和素标记的触酶C100混合，于35℃避光环境中反应40min，洗涤；g)而后加入浓度为8μmol/L的双氧水溶液混合，于35℃避光环境中反应30min；h)而后加入巯基丙酸修饰的碲化镉量子点混合，于35℃避光环境中反应10min；i)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待测样品中空肠弯曲菌的存在与否以及存在的量。所述的固相载体为酶标反应板。所述的可检测标记物为辣根过氧化物酶。所述生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体是通过以下方法制备的：配制含有3mg/mL空肠弯曲菌单克隆抗体、0.08mg/mL生物素的PBS溶液，于避光条件下反应60min，所述PBS溶液的浓度为0.01mol/L，而后透析去除生物素，即得到所述生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (4)
1.一种空肠弯曲菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：a)将待测样品加样于包被有捕捉抗体的固相载体，从而使待测样品中的空肠弯曲菌与固相载体上的捕捉抗体结合，形成带有“空肠弯曲菌-捕捉抗体”二元复合物的固相载体；所述的捕捉抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体3G2D8H3G9，所述的单克隆抗体3G2D8H3G9由小鼠杂交瘤细胞系3G2D8H3G9，CGMCCNo.8766产生；b)将检测抗体加样于a)获得的固相载体，从而形成带有“检测抗体-空肠弯曲菌-捕捉抗体”三元复合物的固相载体；所述的检测抗体是特异性地结合于空肠弯曲菌的单克隆抗体4C9E1G7H3，所述的单克隆抗体4C9E1G7H3由小鼠杂交瘤细胞系4C9E1G7H3，CGMCCNo.8457产生，且所述的单克隆抗体4C9E1G7H3携带一可检测标记物；c)包被空肠弯曲菌抗体；d)取步骤c)包被后的抗体，与待测样品混合后于35～39℃避光环境中反应40～80min，洗涤；e)而后加入生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体混合，于35～39℃避光环境中反应40～80min，洗涤；f)而后加入链霉亲和素标记的触酶C100混合，于35～39℃避光环境中反应40～80min，洗涤；g)而后加入浓度为8～12μmol/L的双氧水溶液混合，于35～39℃避光环境中反应20～40min；h)而后加入巯基丙酸修饰的碲化镉量子点混合，于35～39℃避光环境中反应10～20min；i)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待测样品中空肠弯曲菌的存在与否以及存在的量。
2.根据权利要求1所述的空肠弯曲菌检测方法，其特征在于，所述的固相载体为酶标反应板。
3.根据权利要求1所述的空肠弯曲菌检测方法，其特征在于，所述的可检测标记物为辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求1所述的空肠弯曲菌检测方法，其特征在于，所述生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体是通过以下方法制备的：配制含有1～3mg/mL空肠弯曲菌单克隆抗体、0.07～0.08mg/mL生物素的PBS溶液，于避光条件下反应30～60min，所述PBS溶液的浓度为0.005～0.02mol/L，而后透析去除生物素，即得到所述生物素化的空肠弯曲菌单克隆抗体。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109884291A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-06-14 | 苏州和锐生物科技有限公司 | 弯曲菌多肽、抗体捕获器件及试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105223363A (zh) * | 2015-09-10 | 2016-01-06 | 上海慧耘生物科技有限公司 | 检测空肠弯曲菌的方法及其单抗 |
| CN105759031A (zh) * | 2016-03-18 | 2016-07-13 | 南昌大学 | 一种针对空肠弯曲菌的快速检测方法 |
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- 2016-12-05 CN CN201611102843.8A patent/CN106556698A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN109884291A (zh) * | 2017-12-25 | 2019-06-14 | 苏州和锐生物科技有限公司 | 弯曲菌多肽、抗体捕获器件及试剂盒 |
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