CN115951058B - 一种高通量筛选parg抑制剂的方法及其应用 - Google Patents
一种高通量筛选parg抑制剂的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物化学技术领域，尤其是涉及一种高通量筛选PARG抑制剂的方法及其应用，该方法包括以下步骤：S1、将组蛋白包被在酶标板中；S2、向酶标板中加入酶反应体系，酶反应体系包括：PARP1、DNA和生物素标记的NAD；S3、向酶标板中加入不同浓度的PARG抑制剂；S4、向酶标板中加入PARG；S5、向酶标板中加入标记HRP的链和亲霉素抗体以及HRP检测试剂，通过酶标仪读取化学发光信号值，并通过化学发光信号值拟合得到PARG抑制剂的IC50值。本发明的实验体系稳定，且降低了荧光的干扰，大大降低了假阴性的结果；而且在检测过程中可以通过对组蛋白进行ADP‑核糖化，极大的降低了成本，且不需要额外的制备ADP‑核糖化底物，保证了每次实验的重复性。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，尤其是涉及一种高通量筛选PARG抑制剂的方法及其应用。
背景技术
目前，相关技术中记载：TR-FRTE实验方法去检测未被水解的ADP-核糖基化底物的量，原理是ADP-核糖基化的PARP(聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶)的底物上带有生物素标签以及His标签，且所产生的荧光能量共振转移信号与ADP-核糖基化底物成正比。在存在PARG(聚(腺苷二磷酸核糖)水解酶)的情况下，底物的ADP-核糖基被切割，该方法可以高通量的检测PARG抑制剂的抑制效果，可用高通量酶标仪读数，Ratio＝signal 665nm/signal620nm，但PARG TR-FRTE实验方法具有以下三个缺点：
一、该检测方法通过荧光能量转移定量ADP-核糖基化底物的量，检测信号是665nm/620nm，该信号会被某些待筛选小分子产生荧光干扰，从而造成假阳性或假阴性；
二、该方法检测原理是检测ADP-核糖基化的PARP，所以需要先进行底物的制备，其中NAD、生物素-NAD、DNA、PARP1需要先进行ADP-核糖基化反应，并在反应后通过透析来去除掉未结合到ADP-核糖链上的NAD，该过程不稳定，每次制备底物的重复性不佳；
三、该方法检测原理是检测ADP-核糖基化的PARP，制备底物过程中需要透析以去除未结合的NAD等，在这个过程会损失掉一部分蛋白样品，对于PARP1蛋白的需求量高，每次测试成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量筛选PARG抑制剂的方法及其应用，该方法能够高通量的检测PARG抑制剂的抑制效果。
本发明的第一方面，提供一种高通量筛选PARG抑制剂的方法，包括以下步骤：
S1、将组蛋白包被在酶标板中；
S2、向酶标板中加入酶反应体系，酶反应体系包括：PARP1、DNA和生物素标记的NAD；
S3、向酶标板中加入不同浓度的PARG抑制剂；
S4、向酶标板中加入PARG；
S5、向酶标板中加入标记HRP的链和亲霉素抗体以及HRP检测试剂，通过酶标仪读取化学发光信号值，并通过化学发光信号值拟合得到PARG抑制剂的IC50值。
本发明利用化学发光法的检测技术，通过PARP1的多聚ADP核糖聚合功能将底物组蛋白上进行ADP-核糖链加成，所耗费的PARP1蛋白量极少，极大的节省了实验成本。
此外，本发明引入了化学发光法技术优点，ADP-核糖基化的底物是组蛋白，每次测试时直接制备ADP-核糖基化底物，且化学发光法通过洗板直接可以将未结合的NAD去除且不影响结合蛋白的量，反应过程稳定且重复性好。
优选的，步骤S1包括：
S11、向酶标板中加入组蛋白，离心后孵育；
S12、将酶标板中未结合的组蛋白去除，经PBST洗涤后，添加封闭液进行封闭；
S13、将酶标板中封闭液去除，并用PBST洗涤。
优选的，步骤S2中DNA的模板序列为：
5’-GTATCCTCGTAGTGCAGATGCGTC-3’(SEQ ID NO：1)；
5’-GTCGGACTGATTCGGTAGATCTG-3’(SEQ ID NO：2)。
更优选的，步骤S2中DNA的模板序列经磷酸化修饰后对PARP1的ADP-核糖功能激活效率更高。
优选的，步骤S2包括：
S21、向酶标板中添加PARP1，离心；
S22、向酶标板中添加DNA、生物素标记的NAD，离心，孵育；
S23、将酶标板中未结合的反应物去除，用PBST洗涤。
优选的，步骤S3包括：用DMSO将PARG抑制剂稀释为不同浓度的PARG抑制剂溶液，向酶标板中加入不同浓度的PARG抑制剂溶液进行水解反应。
优选的，步骤S4包括：
S41、向酶标板中加入PARG，离心，孵育；
S42、将酶标板中未结合的反应物去除，用PBST洗涤。
优选的，步骤S5包括：
S51、向酶标板中加入标记HRP的链和亲霉素抗体，孵育；
S52、将酶标板中未结合的标记HRP的链和亲霉素抗体去除，用PBST洗涤；
S53、向酶标板中加入HRP检测试剂，离心，通过酶标仪读取化学发光信号值，并通过化学发光信号值拟合得到PARG抑制剂的IC50值。
优选的，步骤S53包括：选择酶标仪内置的化学发光模块，读取化学发光信号值，通过抑制率计算公式计算PARG抑制剂的抑制率，再用PRISM软件拟合PARG抑制剂的IC50值。
具体的，抑制率计算公式：
抑制率(％Inh)＝100％-((信号最大值-信号化合物)/(信号最大值-信号最小值)*100％)，其中，
最小信号值代表最小浓度的PARG抑制剂的化学发光值(DMSO点对应的化学发光值)；
最大信号值代表最大浓度的PARG抑制剂的化学发光值；
信号化合物代表检测样本PARG抑制剂的化学发光值；
具体的，PRISM 8.0软件拟合公式为非线性四参数拟合方程：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))，其中：
X代表PARG抑制剂浓度的对数值；
Y代表PARG抑制剂的抑制率(％inh)；
Top代表最小浓度的PARG抑制剂的抑制率(DMSO点对应的抑制率)；
Bottom代表PARG抑制剂的最大抑制率；
LogIC50代表PARG抑制剂的IC50对数值；
HillSlope代表曲线对应的斜率。
优选的，步骤S53中所述HRP检测试剂包括：ADHP和H2O2。
利用化学发光法的检测技术，在HRP存在的情况下，ADHP与H2O2以1:1的化学定量比反应，生成高荧光的试卤灵，灵敏度高，检测范围广，发射波长接近红光区，此波长下生物样品自发荧光(位于波长较短的蓝绿光区)的干扰较小，因此在筛选化合物样品尤其是高通量筛选化合物样品时可以排除系统内荧光的干扰，大大降低假阴性的结果。
本发明的第二方面，提供了上述的高通量筛选PARG抑制剂的方法在PARG抑制剂的筛选试剂盒中的应用。
有益效果：
本发明的技术方案以组蛋白做为底物，特定的DNA作为PARP1激活因子，在反应中添加了带有生物素标记的NAD，因此PARP1进行ADP-核糖化时，生物素标记的NAD会掺入到延伸的ADP-核糖链上；然后通过PARG对ADP-核糖链进行水解，将生物素标记的NAD水解下来；然后加入标记HRP的链和亲霉素抗体以及HRP检测试剂去识别生物素的基团，然后读取化学发光信号值。本发明的实验体系稳定，且降低了荧光的干扰，大大降低了假阴性的结果；而且在检测过程中可以通过对组蛋白进行ADP-核糖化，极大的降低了成本，且不需要额外的制备ADP-核糖化底物，保证了每次实验的重复性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明PARG抑制剂的IC50示意图，其中，PDD00017273为PARG抑制剂。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本实施例提供一种高通量筛选PARG抑制剂的方法，包括以下步骤：
步骤1：PARP1、组蛋白、DNA、NAD、PARG等相关试剂的获得。具体涉及的试剂、耗材和设备详见如下表。
其中，DNA经磷酸化修饰，DNA的模板序列为：
PrimerF：5’-GTATCCTCGTAGTGCAGATGCGTC-3’(SEQ ID NO：1)；
PrimerR：5’-GTCGGACTGATTCGGTAGATCTG-3’(SEQ ID NO：2)；
步骤2：向酶标板(Greiner781074)中转移50uL组蛋白(50nM)，1000rpm离心1min，4℃孵育过夜；
步骤3：将Greiner781074中未结合的组蛋白去除，100μL磷酸缓冲液(PBST)洗3次，每次5分钟；去除PBST后添加100μL封闭液(Blocking buffer)，25℃封闭90分钟；
步骤4：将Greiner781074中Blocking buffer去除，用100μLPBST洗3次，每次5分钟；
步骤5：向Greiner781074添加5μLPARP1(3.2nM)，1000rpm离心1min；
步骤6：向Greiner781074添加5μLDNA(1nM)，NAD/Biotin-NAD(生物素标记的NAD)混合液(5uM)，NAD：Biotin-NAD的摩尔比为5：1，1000rpm离心1min，25℃孵育60min；
步骤7：将Greiner781074中未结合的PARP1等反应物去除，用100μLPBST洗3次，每次5分钟；
步骤8：用二甲基亚砜(DMSO)将PARG抑制剂(阳性化合物PDD00017273)在384PPPlate中进行稀释，先在第一行的第2到第11个孔中加入45μLDMSO，第1个孔中加入30μLDMSO，取30μL的PDD00017273到第一个孔中，混匀，之后依次取出15μL样品加入到下一个孔中混匀进行，四倍稀释，PDD00017273的终浓度依次是：100，25，6.25，1.56，0.39，0.098，0.024，0.006，0.0015，0.0004，0μM；向Greiner781074中转移0.2μL的PDD00017273，每个浓度设置2个重复，DMSO在体系中的含量不超过1％；
步骤9：向Greiner784074转移20μLPARG(30pM)，1000rpm离心1min；25℃孵育60min；
步骤10：将Greiner781074中未结合的PARG等反应物去除，用100μLPBST洗3次，每次5分钟；
步骤11：向Greiner781074中加入记HRP的链和亲霉素抗体(Streptavidin-HRP)，25℃孵育30min；
步骤12：将Greiner781074中未结合的Streptavidin-HRP去除，用100μLPBST洗3次，每次5分钟；
步骤13：将过氧化氢荧光探针(ADHP)和H2O2化学定量比1:1混合，向Greiner781074中加入25μL混合液，1000rpm离心1min；
步骤14：选择BMG酶标仪内置的化学发光模块，选定所需要读取的区域，读取反应的化学发光信号值；
步骤15：通过抑制率计算公式计算每个浓度的抑制率并用PRISM8.0软件拟合PDD00017273的IC50(如图1所示)，拟合公式为非线性的四参数拟合方程：
(1)抑制率计算公式：
抑制率(％Inh)＝100％-((信号最大值-信号化合物)/(信号最大值-信号最小值)*100％)，其中，
最小信号值代表最小浓度的PARG抑制剂的化学发光值(DMSO点对应的化学发光值)；
最大信号值代表最大浓度的PARG抑制剂的化学发光值；
信号化合物代表检测样本PARG抑制剂的化学发光值；
(2)PRISM8.0软件拟合公式为非线性四参数拟合方程：
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))，其中：
X代表PARG抑制剂浓度的对数值；
Y代表PARG抑制剂的抑制率(％inh)；
Top代表最小浓度的PARG抑制剂的抑制率(1％DMSO对应的抑制率)；
Bottom代表PARG抑制剂的最大抑制率；
LogIC50代表PARG抑制剂的IC50对数值；
HillSlope代表曲线对应的斜率。
本实施例的技术方案以组蛋白做为底物，特定的DNA作为PARP1激活因子，在反应中添加了带有生物素标记的NAD，因此PARP1进行ADP-核糖化时，生物素标记的NAD会掺入到延伸的ADP-核糖链上；然后通过PARG对ADP-核糖链进行水解，将生物素标记的NAD水解下来；然后加入标记HRP的链和亲霉素抗体以及HRP检测试剂去识别生物素的基团，然后读取化学发光信号值。本实施例的实验体系稳定，且降低了荧光的干扰，大大降低了假阴性的结果；而且在检测过程中可以通过对组蛋白进行ADP-核糖化，极大的降低了成本，且不需要额外的制备ADP-核糖化底物，保证了每次实验的重复性。
实施例二
本实施例提供了上述实施例一的高通量筛选PARG抑制剂的方法在PARG抑制剂的筛选试剂盒中的应用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种高通量筛选PARG抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将组蛋白包被在酶标板中；
S2、向酶标板中加入酶反应体系，酶反应体系包括：PARP1、DNA和生物素标记的NAD；所述的DNA经磷酸化修饰，所述的DNA模板序列为：
5’-GTATCCTCGTAGTGCAGATGCGTC-3’(SEQ ID NO：1)；
5’-GTCGGACTGATTCGGTAGATCTG-3’(SEQ ID NO：2)
S3、向酶标板中加入不同浓度的PARG抑制剂；
S4、向酶标板中加入PARG；
S5、向酶标板中加入标记HRP的链和亲霉素抗体以及HRP检测试剂，通过酶标仪读取化学发光信号值，并通过化学发光信号值拟合得到PARG抑制剂的IC50值。
2.根据权利要求1所述的高通量筛选PARG抑制剂的方法，其特征在于，步骤S1包括：
S11、向酶标板中加入组蛋白，离心后孵育；
S12、将酶标板中未结合的组蛋白去除，经PBST洗涤后，添加封闭液进行封闭；
S13、将酶标板中封闭液去除，并用PBST洗涤。
3.根据权利要求1所述的高通量筛选PARG抑制剂的方法，其特征在于，步骤S2包括：
S21、向酶标板中添加PARP1，离心；
S22、向酶标板中添加DNA、生物素标记的NAD，离心，孵育；
S23、将酶标板中未结合的反应物去除，用PBST洗涤。
4.根据权利要求1所述的高通量筛选PARG抑制剂的方法，其特征在于，步骤S3包括：用DMSO将PARG抑制剂稀释为不同浓度的PARG抑制剂溶液，向酶标板中加入不同浓度的PARG抑制剂溶液进行水解反应。
5.根据权利要求1所述的高通量筛选PARG抑制剂的方法，其特征在于，步骤S4包括：
S41、向酶标板中加入PARG，离心，孵育；
S42、将酶标板中未结合的反应物去除，用PBST洗涤。
6.根据权利要求1所述的高通量筛选PARG抑制剂的方法，其特征在于，步骤S5包括：
S51、向酶标板中加入标记HRP的链和亲霉素抗体，孵育；
S52、将酶标板中未结合的标记HRP的链和亲霉素抗体去除，用PBST洗涤；
S53、向酶标板中加入HRP检测试剂，离心，通过酶标仪读取化学发光信号值，并通过化学发光信号值拟合得到PARG抑制剂的IC50值。
7.根据权利要求6所述的高通量筛选PARG抑制剂的方法，其特征在于，步骤S53包括：选择酶标仪内置的化学发光模块，读取化学发光信号值，通过抑制率计算公式计算PARG抑制剂的抑制率，再用PRISM软件拟合PARG抑制剂的IC50值。
8.根据权利要求6所述的高通量筛选PARG抑制剂的方法，其特征在于，步骤S53中所述HRP检测试剂包括：ADHP和H2O2。
9.根据权利要求1-8任一项所述的高通量筛选PARG抑制剂的方法在PARG抑制剂的筛选试剂盒中的应用。
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