CN111122523A - 一种快速识别Ag+和Cys的三相输出功能的分子逻辑门及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速识别Ag+和Cys的三相输出功能的分子逻辑门及其构建方法，属于分子计算机技术领域，可解决现有分子逻辑门单一信号输出的局限性的问题，包括：以Cys和Ag+作为平行的两路输入信号，以荧光强度、荧光各向异性及荧光寿命为输出信号。以小檗碱为信号报告单元，Ag+‑核酸适体为分子识别基质，利用小檗碱在Ag+‑核酸适体及Cys、Ag+存在时的不同微环境中的荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减的变化，构建了“禁止”门基本布尔逻辑门。构建的分子逻辑门电路性能好、灵敏度高、较容易区别，能够解决单一输出信号所带来的局限性。
Description
技术领域
本发明属于分子计算机技术领域，具体涉及一种基于核酸适体-靶标相互作用及金属离子配位作用的快速识别Ag+和Cys的三相输出功能的分子逻辑门及其构建方法。
背景技术
作为模拟逻辑运算的化学系统，分子逻辑门是在分子水平上通过计算实现信息处理和集成的小型化。与数字电路中的逻辑门类似，像利用电子运动的硅处理器一样，去创造可以利用分子的内在多样性完成计算功能的微型系统，用分子来分别描述逻辑门的输入和输出信号，进而实现分子水平上的逻辑操作。分子逻辑门中的分子能对外界刺激有所响应，并且分子逻辑门也遵循布尔逻辑规则。
分子逻辑门利用分子，如DNA、金属离子、蛋白质、抗体等进行逻辑操作，不仅缩小了逻辑器件的体积，还有可能用于生物医疗诊断中。其次，分子逻辑门输入型号可选类型多，可以是各种金属离子、小分子、蛋白质、抗体等。最后，分子逻辑门的输出信号易检测，开关比大，仪器依赖性小。
目前，分子逻辑门在传感、诊断和小分子标靶识别中表现出潜在的应用前景，涉及的识别基质多为聚合物、纳米粒子和核酸。其中，基于核酸特别是基于核酸适体的分子逻辑门因其能够与互补链或特定目标物相互作用而应用于核酸酶、DNA、金属离子、小分子等的分析检测。只是，这些分子逻辑门大多只有一个单一功能的信号输出，其分析检测的准确性需进一步提高。
信号输出是构成逻辑门的关键因素之一，在逻辑门的结构中起着举足轻重的作用。一般来说，比色、电化学发光、电化学和荧光信号通常用作分子逻辑门系统的输出。与其它输出信号相比，荧光光谱技术以其简单、成本低、灵敏度高、特异性强等优点。更重要的是，荧光技术可以提供更多的技术参数，如荧光强度、波长、荧光各向异性和荧光衰减等，为构建分子逻辑门时的多信号输出提供了更多的选择。与单信号输出方式相比，多功能集成分子逻辑门在提高多信号联合输出实验结果的准确性和灵敏度方面具有潜在的优势。
目前相关研究多以荧光强度和波长为单一或双信号输出，同时，所用的核酸适体基质多需要荧光标记。
发明内容
本发明针对现有分子逻辑门单一信号输出的局限性的问题，提供一种快速识别Ag+和Cys的三相输出功能的分子逻辑门及其构建方法，该分子逻辑门构建方法中的信号输出为荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减三相信号联合输出，提供了更可靠、更灵敏的分析检测策略，同时，核酸适体无需标记，分析检测简便、成本更低。
本发明采用如下技术方案：
一种快速识别Ag+和Cys的三相输出功能的分子逻辑门，以小檗碱为荧光探针，Ag+-核酸适体为模板，以Cys和Ag+作为平行的两路输入信号，小檗碱在Ag+-核酸适体及Cys、Ag+存在时的不同微环境中的荧光强度、荧光各向异性、荧光寿命为输出信号；在Ag+-核酸适体体系中，小檗碱发射较弱的荧光信号，同时，其荧光各向异性及荧光衰减均较小，输出为“0”；Ag+存在时，其会与Ag+-核酸适体形成稳定的C-Ag+-C双链结构，小檗碱则会键合在C-Ag+-C双链上，引起其荧光强度、荧光各向异性及荧光衰减的增加，输出为“1”；当在体系中加入Cys后，Ag+与Cys较强的配合作用使得Ag+从C-Ag+-C结构中释放，使得C-Ag+-C双链结构解离，小檗碱的荧光强度、荧光各向异性及荧光衰减又重新恢复，输出为“0”。
所述Ag+-核酸适体序列为：5’-CCT CCT CCC TCC TTT TCC ACC CAC CAC C-3’。
一种快速识别Ag+和Cys的三相输出功能的分子逻辑门的构建方法，包括如下步骤：
第一步，配制小檗碱母液：
称量74.3mg盐酸小檗碱，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第二步，Ag+-核酸适体溶液的配制：
先将Ag+-核酸适体离心5-10min，将经离心的Ag+-核酸适体溶解于20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液中配成浓度为100 μM的Ag+-核酸适体溶液，在90℃下加热7 min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用，使用时用20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液稀释至10 μM；
第三步，配制不同浓度梯度的Ag+标准溶液：
称量67.9mg硝酸银，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中，使用时逐级稀释，配制成不同浓度的标准溶液；
第四步，配制不同浓度梯度的Cys标准溶液：
称量48.5mgL的Cys，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中，使用时逐级稀释，配制成不同浓度的标准溶液；
第五步，“禁止”分子逻辑门的构建：取四只EP管，编号1、2、3、4，分别做以下处理：
向1号管中加入5 μL小檗碱溶液、20-30μLAg+-核酸适体溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液1；
向2号管中加入5 μL小檗碱溶液、20-30μLAg+-核酸适体溶液、1-100μLAg+溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液2；
向3号管中加入5 μL小檗碱溶液、20-30μLAg+-核酸适体溶液、1-100μL的Cys溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液3；
向4号管中加入小檗碱溶液、20-30μLAg+-核酸适体溶液、1-100μLAg+溶液、1-100μL的Cys溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液4；
将上述溶液分别混匀，分别于室温静置30min后，激发波长为346nm，发射波长为546nm分别测定每种溶液的荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减，分别记为Fi，ri，τi，i=1，2，3，4；
根据上述测定结果，对其进行归一化处理，即分别除以四种条件下，出现最大的F2、r2、τ2，计算公式如下所示：
Normalized Fi=Fi/F2；
Normalized ri= ri/r2；
Normalized τi =τi /τ2；
将归一化处理后的数据进行统计分析，做柱状图，定位相应的阈值，低于阈值，记为0，高于阈值，记为1，以Ag+和Cys为平行的两路输入信号，分别以荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减的归一化结果为输出信号，构成一个“禁止”门；
第六步，Ag+检测标准曲线：分别取25 μL小檗碱溶液、100μLAg+-核酸适体溶液和50μL不同浓度梯度的Ag+标准溶液，用Tris-HAc缓冲溶液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+）定容至5mL，分别于室温静置30min后，转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长346nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的荧光光谱图并记录其荧光发射强度；将每条曲线546nm处的荧光强度F对Ag+标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；
第七步，待测样品Ag+及其加标回收率的检测：
待测样品Ag+的检测，用100mmol/L的Tris-HAc缓冲溶液将待测样品稀释至0-50倍，在比色管中，按照小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液的体积比为25μL:100μL的比例，分别加入小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用稀释后的待测样品定容，室温静置30min，倒入石英比色皿中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm；
待测样品Ag+加标回收率的检测，用100mmol/L的Tris-HAc缓冲溶液将待测样品稀释至0-50倍，在比色管中，按照小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液的体积比为25μL:100μL的比例，分别加入小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液，再分别加入250μL不同浓度的Ag+标准溶液样品，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用稀释后的待测样品定容，室温静置30min，然后将样品倒入比色池中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的荧光强度测量值和标准曲线方程，计算出Ag+浓度值，得出Ag+在待测样品中的加标回收率；
第八步，Cys检测标准曲线：分别取25 μL小檗碱溶液、100μLAg+-核酸适体溶液、250μL的Ag+溶液和不同浓度梯度的Cys标准溶液，用Tris-HAc缓冲溶液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+）定容至5mL，分别于室温静置30min后，转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长346nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的荧光光谱图并记录其荧光发射强度；将每条曲线546nm处的荧光强度F对Cys标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；
第九步，待测样品Cys及其加标回收率的检测：
待测样品Cys的检测，用100mmol/L的Tris-HAc缓冲溶液将待测样品稀释至0-50倍，在比色管中，按照小檗碱母液、Ag+-核酸适体和Ag+溶液的体积比为25μL:100μL：250μL的比例，分别加入小檗碱母液、Ag+-核酸适体和Ag+溶液，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用稀释后的待测样品定容，室温静置30min，倒入石英比色皿中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm；
待测样品Cys加标回收率的检测，用100mmol/L的Tris-HAc缓冲溶液将待测样品稀释至50-100倍，在比色管中，按照小檗碱母液、Ag+-核酸适体和Ag+溶液的体积比为25μL：100μL：250μL的比例，分别加入小檗碱母液、Ag+-核酸适体和Ag+溶液，再分别加入500μL不同浓度的Cys标准溶液样品，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用稀释后的待测样品定容，室温静置30min，然后将样品倒入比色池中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的荧光强度测量值和标准曲线方程，计算出Cys浓度值，得出Cys在待测样品中的加标回收率。
本发明的有益效果如下：
本方案构建的分子逻辑门具有三相信号输出，大大提高了分析检测的准确度与灵敏度；
可高效、简单、快速地检测出Cys和Ag+；
核酸适体免标记，降低的分析检测的繁琐度与检测成本，同时也提高了分析检测的灵敏度。
附图说明
图1为实施例1中Cys和Ag+为平行输入信号，构建的“禁止”门示意图；
图2为实施例1中Cys和Ag+为平行输入信号，归一化荧光强度为输出信号，构建的“禁止”门柱状图；
图3为实施例1中Cys和Ag+为平行输入信号，归一化荧光各向异性为输出信号，构建的“禁止”门柱状图；
图4为实施例1中Cys和Ag+为平行输入信号，归一化荧光衰减为输出信号，构建的“禁止”门柱状图。
具体实施方式
实施例1
第一步，配制小檗碱母液：
称量74.3mg盐酸小檗碱，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第二步，Ag+-核酸适体溶液的配制：
先将Ag+-核酸适体离心5-10min，将经离心的Ag+-核酸适体溶解于20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液中配成浓度为100 μM的Ag+-核酸适体溶液，在90℃下加热7 min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用，使用时用20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液稀释至10 μM；
第三步，配制不同浓度梯度的Ag+离子标准溶液：
称量67.9mg硝酸银，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第四步，配制不同浓度梯度的Cys标准溶液：
称量48.5mgL-半胱氨酸，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第五步，“禁止”分子逻辑门的构建：取四只EP管，编号1、2、3、4，分别做以下处理：
向1号管中加入5 μL小檗碱溶液、20μL Ag+-核酸适体溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液1；
向2号管中加入5 μL小檗碱溶液、20μL Ag+-核酸适体溶液、25μL Ag+溶液，然后加入20mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液2；
向3号管中加入5 μL小檗碱溶液、20μL Ag+-核酸适体溶液、25μL Cys溶液，然后加入20mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液3；
向4号管中加入小檗碱溶液、20μL Ag+-核酸适体溶液、25μL Ag+溶液、25μL Cys溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液4；
将上述溶液分别混匀，分别于室温静置30min后，激发波长为346nm，发射波长为546nm分别测定每种溶液的荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减，分别记为Fi，ri，τi，（i=1，2，3，4）；
根据上述测定结果，对其进行归一化处理，即分别除以F2、r2、τ2 (四种条件下，出现最大的)，计算公式如下所示：
Normalized Fi=Fi/F2；
Normalized ri= ri/r2；
Normalized τi =τi /τ2；
将归一化处理后的数据进行统计分析，做柱状图，结果见图2、3、4，将阈值定位0.71，只有低于0.71，记为“0”，高于0.71，记为“1”。以Ag+和Cys为平行的两路输入信号，分别以荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减的归一化结果为输出信号，构成一个“禁止”门，构建的“禁止”门示意图如图1所示。对于输入，含Ag+或Cys定义为“1”，不含Ag+或Cys设置为“0”。四种可能的信号输入模式（0，0），（1，0），（0，1）和（1，1）如表1所示。对于输出，分别以荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减的归一化结果为输出信号，构成一个“禁止”门，其所对应的真值表见表1，
表1 “禁止”逻辑门真值表
实施例2
第一步，配制小檗碱母液：
称量74.3mg盐酸小檗碱，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第二步，Ag+-核酸适体溶液的配制：
先将Ag+-核酸适体离心5-10min，将经离心的Ag+-核酸适体溶解于20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液中配成浓度为100 μM的Ag+-核酸适体溶液，在90℃下加热7 min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用，使用时用20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液稀释至10 μM；
第三步，配制不同浓度梯度的Ag+标准溶液：
称量67.9mg硝酸银，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中，并逐级稀释得到不同浓度的标准溶液；
第四步，配制不同浓度梯度的Cys标准溶液：
称量48.5mgL-半胱氨酸，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第五步，“禁止”分子逻辑门的构建：取四只EP管，编号1、2、3、4，分别做以下处理：
向1号管中加入5 μL小檗碱溶液、30μL Ag+-核酸适体溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液1；
向2号管中加入5 μL小檗碱溶液、30μL Ag+-核酸适体溶液、50μL Ag+溶液，然后加入20mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液2；
向3号管中加入5 μL小檗碱溶液、30μL Ag+-核酸适体溶液、50μL Cys溶液，然后加入20mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液3；
向4号管中加入小檗碱溶液、30μL Ag+-核酸适体溶液、50μL Ag+溶液、50μL Cys溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液4；
将上述溶液分别混匀，分别于室温静置30min后，激发波长为346nm，发射波长为546nm分别测定每种溶液的荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减，分别记为Fi，ri，τi（i=1，2，3，4）；
根据上述测定结果，对其进行归一化处理，即分别除以F2、r2、τ2 (四种条件下，出现最大的)，计算公式如下所示：
Normalized Fi=Fi/F2；
Normalized ri= ri/r2；
Normalized τi =τi /τ2；
将归一化处理后的数据进行统计分析，做柱状图，将阈值定位0.69，只有低于0.69，记为0，高于0.69，记为1，以Ag+和Cys为平行的两路输入信号，分别以荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减的归一化结果为输出信号，构成一个“禁止”门。
第六步，Ag+检测标准曲线：分别取25 μL小檗碱溶液、100μLAg+-核酸适体溶液和50μL不同浓度梯度的Ag+标准溶液，用Tris-HAc缓冲溶液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+）定容至5mL，分别于室温静置30min后，转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长346nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的荧光光谱图并记录其荧光发射强度；将每条曲线546nm处的荧光强度F对Ag+标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；当Ag+浓度在0μM-264.52 μM范围内时，体系的荧光强度F与其浓度c呈现较好的线性关系。
第七步，自来水样中Ag+及其加标回收率的检测：
自来水样取自本实验室，无需特殊处理。在比色管中，按照小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液的体积比为25μL:100μL的比例，分别加入小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液，再分别加入250μL不同浓度的Ag+标准溶液样品，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用待测水品定容，定容后Ag+的浓度分别为7.80、42.00、96.00、235.00μM，同时做空白样，室温静置30min，然后将样品倒入比色池中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的荧光强度测量值和标准曲线方程，计算出Ag+浓度值，得出Ag+在自来水样中的加标回收率，结果见表2，Ag+在自来水样中的加标回收率为94.20-103.85%。
表2自来水样中Ag+离子加标回收实验
实施例3
第一步，配制小檗碱母液：
称量74.3mg盐酸小檗碱，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第二步，Ag+-核酸适体溶液的配制：
先将Ag+-核酸适体离心5-10min，将经离心的Ag+-核酸适体溶解于20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液中配成浓度为100 μM的Ag+-核酸适体溶液，在90℃下加热7 min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用，使用时用20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液稀释至10 μM；
第三步，配制不同浓度梯度的Ag+标准溶液：
称量67.9mg硝酸银，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中，并逐级稀释得到不同浓度的标准溶液；
第四步，配制不同浓度梯度的Cys标准溶液：
称量48.5mgL-半胱氨酸，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第五步，“禁止”分子逻辑门的构建：取四只EP管，编号1、2、3、4，分别做以下处理：
向1号管中加入5 μL小檗碱溶液、30μL Ag+-核酸适体溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5mM Mg2+，25 mM Na+离子），使溶液体积为1mL，得溶液1；
向2号管中加入5 μL小檗碱溶液、30μL Ag+-核酸适体溶液、50μL Ag+溶液，然后加入20mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液2；
向3号管中加入5 μL小檗碱溶液、30μL Ag+-核酸适体溶液、50μL Cys溶液，然后加入20mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液3；
向4号管中加入小檗碱溶液、30μL Ag+-核酸适体溶液、50μL Ag+离子溶液、50μL Cys溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+, 25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液4；
将上述溶液分别混匀，分别于室温静置30min后，激发波长为346nm，发射波长为546nm分别测定每种溶液的荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减，分别记为Fi，ri，τi（i=1，2，3，4）；
根据上述测定结果，对其进行归一化处理，即分别除以F2、r2、τ2 (四种条件下，出现最大的)，计算公式如下所示：
Normalized Fi=Fi/F2；
Normalized ri= ri/r2；
Normalized τi =τi /τ2；
将归一化处理后的数据进行统计分析，将阈值定位0.69，只有低于0.69，记为0，高于0.69，记为1，以Ag+和Cys为平行的两路输入信号，分别以荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减的归一化结果为输出信号，构成一个“禁止”门。
第六步，Ag+检测标准曲线：分别取25 μL小檗碱溶液、100μLAg+-核酸适体溶液和50μL不同浓度梯度的Ag+标准溶液，用Tris-HAc缓冲溶液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+）定容至5mL，分别于室温静置30min后，转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长346nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的荧光光谱图并记录其荧光发射强度；将每条曲线546nm处的荧光强度F对Ag+标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；当Ag+浓度在0μM-264.52 μM范围内时，体系的荧光强度F与其浓度c呈现较好的线性关系。
第七步，实际样品的处理：
血液样品由某医院提供，3000rpm，离心5min，取上清液。取血清10mL，加入100 mmol/L的Tris-HAc缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第八步，血清样品Ag+及其加标回收率的检测：
在比色管中，按照小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液的体积比为25μL:100μL的比例，分别加入小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用稀释后的血清样品定容，室温静置30min，倒入石英比色皿中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm；
血清样品Ag+离子加标回收率的检测，在比色管中，按照小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液的体积比为25μL:100μL的比例，分别加入小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液，再分别加入500μL不同浓度的Ag+标准溶液样品，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用稀释后的血清样品定容，定容后Ag+的浓度分别为7.50、42.00、96.00、235.00μM，同时做空白样，室温静置30min，然后将样品倒入比色池中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的荧光强度测量值和标准曲线方程，计算出Ag+浓度值，计算出Ag+在血清样品中的加标回收率位于95.00%-105.47%之间，结果见表3。
表3人血清样品中Ag+加标回收实验
实施例4
第一步，配制小檗碱母液：
称量74.3mg盐酸小檗碱，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第二步，Ag+-核酸适体溶液的配制：
先将Ag+-核酸适体离心5-10min，将经离心的Ag+-核酸适体溶解于20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液中配成浓度为100 μM的Ag+-核酸适体溶液，在90℃下加热7 min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用，使用时用20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液稀释至10 μM；
第三步， Ag+溶液的配制：
称量67.9mg硝酸银，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第四步，配制不同浓度梯度的Cys标准溶液：
称量48.5mgL-半胱氨酸，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中，并逐级稀释得到不同浓度的标准溶液；
第五步，“禁止”分子逻辑门的构建：取四只EP管，编号1、2、3、4，分别做以下处理：
向1号管中加入5 μL小檗碱溶液、30μL Ag+-核酸适体溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液1；
向2号管中加入5 μL小檗碱溶液、30μL Ag+-核酸适体溶液、50μL Ag+溶液，然后加入20mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液2；
向3号管中加入5 μL小檗碱溶液、30μL Ag+-核酸适体溶液、50μL Cys溶液，然后加入20mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液3；
向4号管中加入小檗碱溶液、30μL Ag+-核酸适体溶液、50μL Ag+溶液、50μL Cys溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液（含5 mM Mg2+，25 mM Na+），使溶液体积为1mL，得溶液4；
将上述溶液分别混匀，分别于室温静置30min后，激发波长为346nm，发射波长为546nm分别测定每种溶液的荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减，分别记为Fi，ri，τi（i=1，2，3，4）；
根据上述测定结果，对其进行归一化处理，即分别除以F2、r2、τ2 (四种条件下，出现最大的)，计算公式如下所示：
Normalized Fi=Fi/F2；
Normalized ri= ri/r2；
Normalized τi =τi /τ2；
将归一化处理后的数据进行统计分析，将阈值定位0.69，只有低于0.69，记为0，高于0.69，记为1，以Ag+和Cys为平行的两路输入信号，分别以荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减的归一化结果为输出信号，构成一个“禁止”门。
第六步，Cys检测标准曲线：分别取25 μL小檗碱溶液、100μLAg+-核酸适体溶液、250μLAg+溶液和不同浓度梯度的Cys标准溶液，用Tris-HAc缓冲溶液（含5 mM Mg2+，25 mMNa+）定容至5mL，分别于室温静置30min后，转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长346nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的荧光光谱图并记录其荧光发射强度；将每条曲线546nm处的荧光强度F对Cys标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；当Cys浓度在0μM-70.0μM范围内时，体系的荧光强度F与其浓度c呈现较好的线性关系。
第七步，实际样品的处理：
血液样品由某医院提供，3000rpm，离心5min，取上清液。取血清10mL，加入100 mmol/L的Tris-HAc缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第八步，血清样品Cys及其加标回收率的检测：
血清样品Cys的检测，在比色管中，按照小檗碱母液、Ag+-核酸适体和Ag+溶液的体积比为25μL:100μL：250μL的比例，分别加入小檗碱母液、Ag+-核酸适体和Ag+溶液，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用稀释后的血清样品定容，室温静置30min，倒入石英比色皿中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm；
血清样品Cys加标回收率的检测，在比色管中，按照小檗碱母液、Ag+-核酸适体和Ag+溶液的体积比为25μL：100μL：250μL的比例，分别加入小檗碱母液、Ag+-核酸适体和Ag+溶液，再分别加入500μL不同浓度的Cys标准溶液样品，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用稀释后的血清样品定容，定容后Ag+的浓度分别为7.5、25.0、50.0μM，同时做空白样，室温静置30min，然后将样品倒入比色池中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的荧光强度测量值和标准曲线方程，计算出Cys浓度值，得出Cys在待测样品中的加标回收率，结果见表4，Cys在人血清中的加标回收率为97.33-102.24%。
表4人血清样品中Ag+加标回收实验
Claims (2)
1.一种快速识别Ag+和Cys的三相输出功能的分子逻辑门，其特征在于：以小檗碱为荧光探针，Ag+-核酸适体为模板，以Cys和Ag+作为平行的两路输入信号，小檗碱在Ag+-核酸适体及Cys、Ag+存在时的不同微环境中的荧光强度、荧光各向异性、荧光寿命为输出信号；在Ag+-核酸适体体系中，小檗碱发射较弱的荧光信号，同时，其荧光各向异性及荧光衰减均较小，输出为“0”；Ag+存在时，其会与Ag+-核酸适体形成稳定的C-Ag+-C双链结构，小檗碱则会键合在C-Ag+-C双链上，引起其荧光强度、荧光各向异性及荧光衰减的增加，输出为“1”；当在体系中加入Cys后，Ag+与Cys较强的配合作用使得Ag+从C-Ag+-C结构中释放，使得C-Ag+-C双链结构解离，小檗碱的荧光强度、荧光各向异性及荧光衰减又重新恢复，输出为“0”。
2.一种如权利要求1所述的快速识别Ag+和Cys的三相输出功能的分子逻辑门的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
第一步，配制小檗碱母液：
称量74.3mg盐酸小檗碱，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第二步，Ag+-核酸适体溶液的配制：
先将Ag+-核酸适体离心5-10min，将经离心的Ag+-核酸适体溶解于20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液中配成浓度为100 μM的Ag+-核酸适体溶液，在90℃下加热7 min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用，使用时用20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液稀释至10 μM；
第三步，配制不同浓度梯度的Ag+标准溶液：
称量67.9mg硝酸银，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中，使用时逐级稀释，配制成不同浓度的标准溶液；
第四步，配制不同浓度梯度的Cys标准溶液：
称量48.5mgL的Cys，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中，使用时逐级稀释，配制成不同浓度的标准溶液；
第五步，“禁止”分子逻辑门的构建：取四只EP管，编号1、2、3、4，分别做以下处理：
向1号管中加入5 μL小檗碱溶液、20-30μLAg+-核酸适体溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液，使溶液体积为1mL，得溶液1；
向2号管中加入5 μL小檗碱溶液、20-30μLAg+-核酸适体溶液、1-100μLAg+溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液，使溶液体积为1mL，得溶液2；
向3号管中加入5 μL小檗碱溶液、20-30μLAg+-核酸适体溶液、1-100μL的Cys溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液，使溶液体积为1mL，得溶液3；
向4号管中加入小檗碱溶液、20-30μLAg+-核酸适体溶液、1-100μLAg+溶液、1-100μL的Cys溶液，然后加入20 mmol/L的Tris-HAc缓冲液，使溶液体积为1mL，得溶液4；
将上述溶液分别混匀，分别于室温静置30min后，激发波长为346nm，发射波长为546nm分别测定每种溶液的荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减，分别记为Fi，ri，τi，i=1，2，3，4；
根据上述测定结果，对其进行归一化处理，即分别除以四种条件下，出现最大的F2、r2、τ2，计算公式如下所示：
Normalized Fi=Fi/F2；
Normalized ri= ri/r2；
Normalized τi =τi /τ2；
将归一化处理后的数据进行统计分析，做柱状图，定位相应的阈值，低于阈值，记为0，高于阈值，记为1，以Ag+和Cys为平行的两路输入信号，分别以荧光强度、荧光各向异性、荧光衰减的归一化结果为输出信号，构成一个“禁止”门；
第六步，Ag+检测标准曲线：分别取25 μL小檗碱溶液、100μLAg+-核酸适体溶液和50μL不同浓度梯度的Ag+标准溶液，用Tris-HAc缓冲溶液定容至5mL，分别于室温静置30min后，转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长346nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的荧光光谱图并记录其荧光发射强度；将每条曲线546nm处的荧光强度F对Ag+标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；
第七步，待测样品Ag+及其加标回收率的检测：
待测样品Ag+的检测，用100mmol/L的Tris-HAc缓冲溶液将待测样品稀释至0-50倍，在比色管中，按照小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液的体积比为25μL:100μL的比例，分别加入小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用稀释后的待测样品定容，室温静置30min，倒入石英比色皿中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm；
待测样品Ag+加标回收率的检测，用100mmol/L的Tris-HAc缓冲溶液将待测样品稀释至0-50倍，在比色管中，按照小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液的体积比为25μL:100μL的比例，分别加入小檗碱母液和Ag+-核酸适体溶液，再分别加入250μL不同浓度的Ag+标准溶液样品，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用稀释后的待测样品定容，室温静置30min，然后将样品倒入比色池中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的荧光强度测量值和标准曲线方程，计算出Ag+浓度值，得出Ag+在待测样品中的加标回收率；
第八步，Cys检测标准曲线：分别取25 μL小檗碱溶液、100μLAg+-核酸适体溶液、250μL的Ag+溶液和不同浓度梯度的Cys标准溶液，用Tris-HAc缓冲溶液定容至5mL，分别于室温静置30min后，转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长346nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的荧光光谱图并记录其荧光发射强度；将每条曲线546nm处的荧光强度F对Cys标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；
第九步，待测样品Cys及其加标回收率的检测：
待测样品Cys的检测，用100mmol/L的Tris-HAc缓冲溶液将待测样品稀释至0-50倍，在比色管中，按照小檗碱母液、Ag+-核酸适体和Ag+溶液的体积比为25μL:100μL：250μL的比例，分别加入小檗碱母液、Ag+-核酸适体和Ag+溶液，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用稀释后的待测样品定容，室温静置30min，倒入石英比色皿中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm；
待测样品Cys加标回收率的检测，用100mmol/L的Tris-HAc缓冲溶液将待测样品稀释至50-100倍，在比色管中，按照小檗碱母液、Ag+-核酸适体和Ag+溶液的体积比为25μL：100μL：250μL的比例，分别加入小檗碱母液、Ag+-核酸适体和Ag+溶液，再分别加入500μL不同浓度的Cys标准溶液样品，按照小檗碱母液的体积和整个待测体系的体积比为1:200的比例，用稀释后的待测样品定容，室温静置30min，然后将样品倒入比色池中，进行荧光检测，选取的荧光激发波长为346nm，发射波长为546nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的荧光强度测量值和标准曲线方程，计算出Cys浓度值，得出Cys在待测样品中的加标回收率。
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