CN106520867A - 一种糖基化胶原蛋白改性聚己内酯的酶促合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种糖基化胶原蛋白改性聚己内酯的酶促合成方法，属于聚己内酯改性技术领域。本发明首先利用还原胺化法将含有脂肪酶催化位点——伯羟基的小分子还原糖引入胶原蛋白表面，之后以此为引发剂，采用脂肪酶对ε‑己内酯单体进行开环聚合，反应完毕后通过除酶以及丙酮提纯，最终制得糖基化胶原蛋白改性聚己内酯。该方法具有反应条件温和，无金属离子残留等问题。聚己内酯的生物法改性对于提升材料的细胞亲和性能具有重要意义。

Description

一种糖基化胶原蛋白改性聚己内酯的酶促合成方法

技术领域

本发明涉及一种糖基化胶原蛋白改性聚己内酯的酶促合成方法，属于聚己内酯改性技术领域。

背景技术

聚己内酯是一种重要的医用生物可降解材料，它被广泛用作手术缝线、药物缓释材料以及医用支架材料。但是作为医用材料，聚己内酯存在疏水性过强的缺陷，这会导致聚己内酯与细胞培养基不易浸润，细胞在其表面的粘附生长比较困难。因此，为了提高聚己内酯的细胞相容性，有必要对其进行改性。

有报道采用不同的单体聚合方法先合成了一种氨基修饰的聚己内酯改性材料（NPCL），之后在此基础上利用乳糖酸采用EDC聚合法合成了侧链带半乳糖的改性聚己内酯。该方法主要是采用传统的单体聚合以及化学接枝来进行，其氨基修饰的聚己内酯改性膜材料亲水性只有65.2±1°左右，亲水性能有待提高。也有研究人员利用开环聚合合成了端基马来酰亚胺化的聚己内酯，之后利用马来酰亚胺与BSA的自由巯基之间的迈克尔加成反应，制备出了一种牛白蛋白改性聚己内酯结合体；该法采用传统的化学合成法，在马来酰亚胺化的聚己内酯制备中需要采用辛酸亚锡作为催化剂进行开环聚合，存在反应条件苛刻（温度为130℃，无水、无氧）、反应后容易存在金属离子残留的问题。也有报道制备了淀粉改性聚己内酯塑料材料，主要是采用淀粉改性制得霉菌制剂后，再以环己酮为原料与二价锰和浓硫酸反应，其反应过程中仍然需要以异辛酸亚锡作为催化剂来制备淀粉改性聚己内酯，因此其制备过程存在重金属离子残留，对聚己内酯的应用有较大限制，且得到改性聚己内酯是否具有亲水性、亲水性效果如何尤未可知。也有专利将大豆分离蛋白、改性木薯淀粉、改性壳聚糖和复合增塑剂与聚己内酯进行混合制备改性聚己内酯，然而，这种混合改性容易存在界面相容性问题。

在聚己内酯的改性方法中，末端官能化修饰以其方便性备受研究者青睐。特别是近年来随着酶催化技术的发展，采用末端官能化对聚己内酯进行改性也变得越来越简单。研究者们分别利用纷纷利用几丁质、壳聚糖、羟乙基纤维素以及淀粉等基团在脂肪酶或者其他无机金属催化剂的催化下引入到聚己内酯末端，实现了聚己内酯的功能改性，但是没有人能够采用脂肪酶催化方法合成胶原蛋白改性的聚己内酯。与普通的多糖类物质相比，胶原蛋白是哺乳动物体中普遍存在的一种大分子蛋白质，其细胞相容性更好，因此，若能将胶原蛋白引入聚己内酯组织材料中，对提高其细胞亲和性和生物相容性更有利。但是胶原蛋白本身缺乏足够的脂肪酶催化位点——伯羟基，因此采用脂肪酶催化时无法直接实现其官能化改性，如果采用传统的金属离子催化剂进行催化，则由于其高温条件限制，胶原蛋白会发生变性，失去改性意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明利用“架桥”的方法，通过脂肪酶催化方法制备了一种胶原蛋白改性聚己内酯，在聚己内酯材料中引入细胞识别性较好的胶原蛋白大分子，提高聚己内酯材料的细胞亲和性与生物相容性。本发明先将葡萄糖或者乳糖等含有伯羟基的小分子还原糖接枝到胶原蛋白分子中，提升胶原蛋白上的伯羟基数目，得到适于脂肪酶催化的糖基化胶原蛋白，再以此为引发剂，借助于脂肪酶催化ε-己内酯单体进行开环聚合反应，最终得到糖基化胶原蛋白改性聚己内酯。该法避免了传统金属催化剂开环聚合时高温对蛋白质的破坏及其金属离子残留问题，而且小分子糖引入后得到的糖基化胶原蛋白是一种功能性、细胞亲和性和生物相容性更好的材料，它能够促进细胞的生存、粘附以及免疫应答，有助于提高聚己内酯的生物相容性。

本发明的第一个目的是提供一种细胞亲和性和生物相容性提高的改性聚己内酯制备方法，所述改性聚己内酯为胶原蛋白改性聚己内酯；所述制备方法是先将含有伯羟基的小分子还原糖接枝到胶原蛋白分子中得到糖基化胶原蛋白，然后以糖基化胶原蛋白为引发剂、以脂肪酶为催化剂，催化ε-己内酯单体进行开环聚合反应，得到糖基化胶原蛋白改性聚己内酯。

在本发明的一种实施方式中，所述含有伯羟基的小分子还原糖为含有伯羟基和还原性醛基的糖类，比如半乳糖、核糖、葡萄糖、乳糖、脱氧核糖等。

在本发明的一种实施方式中，所述小分子还原糖为葡萄糖和/或乳糖。这两种糖分子量较小，对蛋白的性能影响小，而且反应性能比较好。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶B或者猪胰脂肪酶。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶添加量为己内酯单体质量的0.1%～10%。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶的酶活为3000U/g以上。

在本发明的一种实施方式中，所述接枝，是采用还原胺化法进行接枝。

在本发明的一种实施方式中，所述接枝，具体是：将胶原蛋白、含有伯羟基的小分子还原糖、氰基硼氢化钠溶解于硼酸缓冲液(pH=9)中，35～40℃下反应2.5～3.5天，然后通过葡聚糖G-50柱分离纯化、冷冻干燥得到糖基化胶原蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述胶原蛋白、含有伯羟基的小分子还原糖、氰基硼氢化钠的质量比为（2.5～3.5）：（8.5～9.5）：（9～11）。

在本发明的一种实施方式中，所述开环聚合反应，是将ε-己内酯单体与糖基化胶原蛋白以1:1～1000:1的质量比混合均匀，之后加入占ε-己内酯单体质量0.1%～10%的脂肪酶，通氮气密封后将其置于温度为30～100℃恒温振荡反应器中反应1～144小时。

在本发明的一种实施方式中，所述制备方法还包括，在开环聚合反应完毕后向反应混合物中加入二氯甲烷，使目标产物完全溶解，过滤，再向滤液中加入适当体积的-20℃～-4℃冷甲醇，于-20℃～-4℃环境中静置一段时间，再过滤，得到粗产物；以丙酮为溶剂抽提上述粗产物，得到糖基化胶原蛋白改性聚己内酯。

在本发明的一种实施方式中，本发明的制备方法，具体如下：

（1）将含有伯羟基的小分子还原糖接枝到胶原蛋白分子中得到糖基化胶原蛋白；

（2）将ε-己内酯单体与糖基化胶原蛋白以1:1～1000:1的质量比混合均匀，之后加入占ε-己内酯单体质量0.1%～10%的脂肪酶，通氮气密封后将其置于温度为30～100℃恒温振荡反应器中反应1～144小时；

（3）反应完毕后，向产物中加入2倍产物体积的二氯甲烷，使产物完全溶解，之后用滤纸过滤掉脂肪酶，再向滤液中加入10倍滤液体积的-20℃冷甲醇，于-20℃环境中静置24小时后过滤，得到粗产物；

（4）以丙酮为溶剂对上述粗产物抽提48小时，得到糖基化胶原蛋白改性聚己内酯产物。

本发明的第二个目的是提供按照上述方法得到的糖基化胶原蛋白改性聚己内酯。

本发明的第三个目的是提供所述糖基化胶原蛋白改性聚己内酯的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是用作医用材料。

在本发明的一种实施方式中，所述应用具体是用作手术缝线、药物缓释材料或者医用支架材料。

本发明的有益效果：

（1）改性过程环保无污染。本发明述及的糖基化胶原蛋白改性聚己内酯合成方法，通过在胶原蛋白上引入含有伯羟基的小分子还原糖物质，成功实现了利用脂肪酶来催化合成胶原蛋白改性聚己内酯，其反应条件温和，并且无金属离子催化剂残留等问题。

（2）改性聚己内酯细胞亲和性更好。采用本发明述及的糖基化胶原蛋白对聚己内酯改性，可以获得更好的细胞亲和性，胶原蛋白经过糖基化改性后，是一种细胞亲和性和粘附性都更好的改性物质，采用该物质对聚己内酯改性可以提升其细胞亲和性。

具体实施方案

润湿性测试方法：

采用JC2000D4接触角测量仪进行滴液法测试。将改性聚己内酯采用压片机进行压片，制成厚约2mm的薄片。测试时，将样品平整的固定在仪器平台上。在距离样品10mm处滴下去离子水液滴，60秒后测定水滴与样品间形成的接触角，每个试样测5次，取平均值。

MTT检测即细胞毒性测定（非直接接触）：

样品经过24h紫外消毒杀菌后用DMEM浸泡36h，通过过滤器（孔径大小0.22μm）除去样品得到浸渍培养基，待用。在96孔的细胞培养板中加入100μL的NIH/3T3细胞悬浮液（5×10⁴个/mL），置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养24h，使细胞完全贴壁后去除培养板中的培养基，加入浸渍培养基继续培养24h，最后加入10μL的MTT（四甲基偶氮唑盐）溶液至每孔中，放入培养箱中继续孵育4h，通过ELISA酶标仪测定450nm处的吸光度，每个样品测试重复5次。

细胞毒性测定结果表示为：

细胞存活百分比（%）=A1/A0×100

其中，A1、A0分别为样品和空白的吸光度

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

（1）将300mg胶原蛋白、900mg葡萄糖和1000mg氰基硼氢化钠溶于0.2mol/L的硼酸缓冲液(pH=9)中，于37℃下反应3天后，经过葡聚糖G-50柱分离纯化，冷冻干燥后得到糖基化胶原蛋白；

（2）将ε-己内酯单体与糖基化胶原蛋白以1000:1的质量比混合均匀，加入占ε-己内酯单体质量10%的猪胰脂肪酶，通氮气密封后将其置于温度为30℃恒温振荡反应器中反应48小时；

（3）反应完毕后，向产物中加入2倍产物体积的二氯甲烷，使产物完全溶解，之后用滤纸过滤掉脂肪酶，再向滤液中加入10倍滤液体积的-20℃冷甲醇，于-20℃环境中静置24小时后过滤，得到粗产物；

（4）以丙酮为溶剂对上述粗产物抽提48小时，得到糖基化胶原蛋白改性聚己内酯产物。

经上述方法得到糖基化胶原蛋白改性聚己内酯，压片后进行接触角测试，显示其水滴润湿接触角为45°，MTT法检测表明细胞存活率80%以上。

实施例2：

（1）将300mg胶原蛋白、900mg乳糖和1000mg氰基硼氢化钠溶于0.2mol/L的硼酸缓冲液(pH=9)中，于37℃下反应3天后，经过葡聚糖G-50柱分离纯化，冷冻干燥后得到糖基化胶原蛋白；

（2）将ε-己内酯单体与糖基化胶原蛋白以1:1的质量比混合均匀，加入占ε-己内酯单体质量0.1%的南极假丝酵母脂肪酶B，通氮气密封后将其置于温度为100℃恒温振荡反应器中反应144小时；

（3）反应完毕后，向产物中加入2倍产物体积的二氯甲烷，使产物完全溶解，之后用滤纸过滤掉脂肪酶，再向滤液中加入10倍滤液体积的-20℃冷甲醇，于-20℃环境中静置24小时后过滤，得到粗产物；

（4）以丙酮为溶剂对上述粗产物抽提48小时，得到糖基化胶原蛋白改性聚己内酯产物。

经上述方法得到糖基化胶原蛋白改性聚己内酯，压片后进行接触角测试，显示其水滴润湿接触角为41°，MTT法检测表明细胞存活率85%以上。

实施例3：

（1）按照与实施例2步骤（1）相同的方法制备糖基化胶原蛋白；

（2）将ε-己内酯单体与糖基化胶原蛋白以400:1的质量比混合均匀，加入占ε-己内酯单体质量5%的南极假丝酵母脂肪酶B，通氮气密封后将其置于温度为80℃恒温振荡反应器中反应48小时；

（3）反应完毕后，向产物中加入二氯甲烷，使产物完全溶解，之后用滤纸过滤掉脂肪酶，再向滤液中加入冷甲醇，于-20℃环境中静置后过滤，得到粗产物；

（4）以丙酮为溶剂对上述粗产物抽提，得到糖基化胶原蛋白改性聚己内酯产物。

经上述方法得到糖基化胶原蛋白改性聚己内酯，压片后进行接触角测试，显示其水滴润湿接触角为30°，MTT法检测表明细胞存活率90%以上。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种细胞亲和性和生物相容性提高的改性聚己内酯制备方法，其特征在于，所述改性聚己内酯为胶原蛋白改性聚己内酯；所述制备方法是先将含有伯羟基的小分子还原糖接枝到胶原蛋白分子中得到糖基化胶原蛋白，然后以糖基化胶原蛋白为引发剂、以脂肪酶为催化剂，催化ε-己内酯单体进行开环聚合反应，得到糖基化胶原蛋白改性聚己内酯。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有伯羟基的小分子还原糖为以下任意一种或者多种：半乳糖、核糖、葡萄糖、乳糖、脱氧核糖。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶B或者猪胰脂肪酶。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶添加量为ε-己内酯单体质量的0.1％～10％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接枝，是采用还原胺化法进行接枝。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述开环聚合反应，是将ε-己内酯单体与糖基化胶原蛋白以1～1000:1的质量比混合均匀，之后加入占ε-己内酯单体质量0.1％～10％的脂肪酶，通氮气密封后将其置于温度为30～100℃恒温振荡反应器中反应1～144小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备方法还包括，在开环聚合反应完毕后向反应混合物中加入二氯甲烷，使目标产物完全溶解，过滤，再向滤液中加入适当体积的-20℃～-4℃冷甲醇，于-20℃～-4℃环境中静置一段时间，再过滤，得到粗产物；以丙酮为溶剂抽提上述粗产物，得到糖基化胶原蛋白改性聚己内酯。

8.按照权利要求1～7任一所述方法得到的糖基化胶原蛋白改性聚己内酯。

9.权利要求8所述的糖基化胶原蛋白改性聚己内酯的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是用作医用材料。