CN106520750A - 一种固定化微生物溢油修复剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种固定化微生物溢油修复剂及其制备方法。该修复剂以海藻酸钠‑CaCl2‑生物基活性碳为载体包埋微生物制成，包埋的微生物的浓度为8×108‑6×109cell/g。制备方法为：将生物基活性碳与微生物种子液混合进行吸附，形成混合悬浊液；在混合悬浊液中加入30～40℃的已灭菌的海藻酸钠溶液，混匀后得到粘稠状混合液，粘稠状混合液加入到CaCl2溶液中分散成球，交联12h～24h，得到固定化微生物溢油修复剂。本发明修复剂的制备方法简单易操作，反应条件温和，制得的修复剂中微生物不易泄漏，稳定性和重复利用性好，并且有较高的微生物活性和细胞容量，对石油烃的降解率可达81‑95％。

Description

一种固定化微生物溢油修复剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种微生物修复剂及其制备方法，尤其涉及一种固定化微生物溢油修复剂及其制备方法。
背景技术
随着海上石油开发和海上运输业的快速发展，井喷、运输船舶的石油泄漏、撞沉船以及输油管道的泄漏等造成的溢油事故也日益频发。而溢油事故发生后，虽经物理方法(如围栏回收等)、化学方法(如喷洒消油剂等)可清除部分表面溢油，但是，残存的石油烃长期滞留在海洋环境中，对海洋生态系统及人体健康会造成巨大的持久性损害。
随着研究的深入，国内外研究者发现在海水和淡水中生长有200多种烃类降解微生物，包括细菌、真菌及藻类，其密度及繁殖速度与水域的油污染程度密切相关。因此，石油污染的生物修复技术也应运而生，目前主要以微生物修复为主，是国际上公认的高效修复石油污染的新技术。这种微生物修复技术中的微生物能适应各种复杂的生态环境，繁殖代谢能力极强，能快速降解石油中各种有毒物质，而且具有价格低廉、环境友好等诸多优势。采用该技术处理物理和化学方法无法清除的溢油是恢复生态环境的最佳途径，对保护我国海洋生态环境，维持海洋资源的可持续性发展具有重大的科学意义和应用价值。
自上世纪七十年代开始，加入适当的微生物治理石油污染就被认为是一个有力的策略，试验中成功的例子如：1990年利用Alpha BioSea处理德克萨斯州海岸的原油泄漏，2000年利用Terra-zyme(TM)处理日本Nakhodka港口原油泄漏，1989年夏到1991年应用投加营养剂和高效烃降解菌对阿拉斯加Exxon Valdez王子海湾由于油轮泄露造成的污染进行的处理等，都取得了非常明显的效果。
但是，在海洋溢油微生物修复过程中，却依然存在着有效菌株流失严重，修复效率大幅度下降等问题。所以，针对海洋溢油修复所特有的处理环境，需要采用微生物固定化技术。固定化微生物技术与其它生物修复技术相比，能够保持微生物高密度、高活性，减轻或消除微生物的流失，处理效率高，对环境的耐受力强，反应易控制，能够有效提高目标区域内海洋溢油污染微生物菌剂的修复效率。
其中，包埋固定化技术作为固定化方法的一种，与吸附法、交联法、共价结合法等其他固定化技术相比，由于制备方法简单易操作，反应条件温和易实现，微生物不易泄漏，稳定性和重复利用性好，并且有较高的微生物活性和细胞容量，固定化效率能达到70％以上，目前应用较为广泛。包括海藻酸钠-CaCl2包埋与聚乙烯醇-H3BO3包埋这两种是最常用的包埋固定化方法。而相对于海藻酸钠-CaCl2包埋法，聚乙烯醇-H3BO3制备的固定化制剂虽机械强度较高、使用寿命较长，但聚乙烯醇因附聚作用强而成球较为困难，且用于交联聚乙烯醇的饱和硼酸溶液对微生物的毒害大，会显著降低在固定化后微生物的活性。海藻酸钠-CaCl2包埋法虽反应条件温和，包埋材料对生物无毒害，包埋的细胞具有较高的活性，但制剂机械强度较低、传质性较差。因此，两者均具有各自的优缺点，并不能达到一种较为理想的状态。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种机械强度高、传质性好、包埋的微生物活性高的固定化微生物溢油修复剂。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：所述修复剂以海藻酸钠-CaCl2-生物基活性碳为载体包埋微生物制成，包埋的微生物的浓度为8×108-6×109cell/g。
本发明在现有的海藻酸钠-CaCl2包埋法的基础上，首次将生物基活性碳添加至海藻酸钠-CaCl2包埋固定化载体中，提高了修复剂的机械强度，且由于生物基活性碳的多孔结构，可大大提高修复剂的传质性，使营养物质更容易被微生物摄取，极大的提高了微生物的活性及降解效率。
在上述的一种固定化微生物溢油修复剂中，所述生物基活性碳占修复剂的质量百分比为0.8-1.5wt％。
在上述的一种固定化微生物溢油修复剂中，所述生物基活性碳为汉麻杆基活性碳。汉麻是一种传统的可再生经济作物，在我国有大面积种植，其表皮、籽实被广泛应用于服装、造纸、食品、医药等行业，而大量的汉麻杆被废弃。因此，用汉麻杆为原料制备活性碳既有实际应用价值，也可减少资源浪费。且汉麻杆内部粗糙多孔是优良的活性碳制备前驱体，得到的汉麻杆基活性碳具有多孔结构，可提高修复剂的传质性，另外，将汉麻杆基活性碳加入到海藻酸钠-CaCl2包埋法中，以提高制剂的机械强度。
在上述的一种固定化微生物溢油修复剂中，所述微生物为石油烃降解菌，进一步优选为对1g/L原油的降解效率达50％以上的石油烃降解菌，如：铜绿假单胞菌D-1，芽孢杆菌ASS-1中的至少一种。
本发明另一个目的在于提供上述固定化微生物溢油修复剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将生物基活性碳与微生物种子液混合进行吸附，形成混合悬浊液；
S2、在上述混合悬浊液中加入30～40℃的已灭菌的海藻酸钠溶液，混匀后得到粘稠状混合液，粘稠状混合液加入到CaCl2溶液中分散成球，交联12h～24h，得到固定化微生物溢油修复剂。
本发明修复剂的制备方法简单易操作，反应条件温和，制得的修复剂中微生物不易泄漏，稳定性和重复利用性好，并且有较高的微生物活性和细胞容量，对石油烃的降解率可达81-95％。
在上述的一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法中，步骤S1中所述生物基活性碳与微生物种子液的质量比1:3～1:6。
在上述的一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法中，步骤S1中所述生物基活性碳为汉麻杆基活性碳，粒径为100～250目。
在上述的一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法中，步骤S1中所述微生物种子液为石油烃降解菌，微生物种子液的浓度为1.5×1010～6.5×1010cell/mL。
在上述的一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法中，步骤S2中所述混合悬浊液与海藻酸钠溶液的体积比为1:10，海藻酸钠溶液的浓度为4wt％～6wt％。
在上述的一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法中，步骤S2中所述CaCl2溶液与海藻酸钠溶液的体积比为5:1，CaCl2溶液的浓度为2.5wt％～3.5wt％。
作为优选，所述汉麻杆基活性碳的制备过程为：
将原料汉麻杆清理、筛拣、干燥、粉碎，过25～35目筛得到汉麻杆粒料，将汉麻杆粒料加入到质量分数为5-15％的柠檬酸溶液中，搅拌混匀，在室温下浸渍0.5～1.5h，然后进行活化，活化后倒入氢氧化钠溶液中浸泡15-30min，浸泡后洗涤至pH中性，然后干燥、粉碎，过100～250目筛，得到汉麻杆基活性碳。
作为优选，所述汉麻杆粒料与柠檬酸溶液的质量比为1:2～1:5。
作为优选，所述活化温度为350～700℃，保温时间为30～90min；从室温升至所需活化温度的升温速率为40～60℃/min。
作为优选，所述氢氧化钠溶液为10mol/L的氢氧化钠与水按体积比为1:8～10配置而成。
作为优选，所述浸泡的温度为70～80℃。
作为优选，所述干燥的温度为100～120℃，时间为3～5h。
与现有技术相比，本发明具有以下几个优点：
1.本发明首次将生物基活性碳添加至海藻酸钠-CaCl2包埋固定化载体中，提高了提高修复剂的机械强度，且由于生物基活性碳的多孔结构，大大提高了修复剂传质性，使营养物质更容易被微生物摄取，极大的提高了微生物的活性及降解效率。
2.本发明生物基活性碳为汉麻杆基活性碳，与一般的活性碳相比，原料来源更为广泛，价格更为低廉，且使固定化微生物的性能更优。
3.本发明修复剂的制备方法简单易操作，反应条件温和，制得的修复剂中微生物不易泄漏，稳定性和重复利用性好，并且有较高的微生物活性和细胞容量，对石油烃的降解率可达81-95％。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：
汉麻杆基活性碳的制备：将原料汉麻杆清理、筛拣、干燥、粉碎，过25目筛，备用。称取上述粉碎好的汉麻杆，按汉麻杆与柠檬酸溶液的质量比1:2加入到质量分数为5％的柠檬酸溶液中，搅拌混匀，在室温下浸渍1.5h。再将浸渍好的料液放入马福炉中，以40℃/min的升温速率升温至350℃下保温活化90min。将活化好的样品从马福炉中取出，冷却后，将样品倒入10mol/L的氢氧化钠与水按体积比为1:8配制而成的氢氧化钠溶液中浸泡15min。再将样品用70℃热水洗涤至pH中性，将洗涤好的样品放入电热鼓风烘箱中，在100℃干燥3h，取出后放在干燥器中冷却。最后将制得的活化后的样品粉碎过100目筛，制得汉麻杆基活性碳。
固定化微生物溢油修复剂的制备：将上述制得的汉麻杆基活性碳与浓度为1.5×1010cell/mL的铜绿假单胞菌D-1按质量比1:6混合进行吸附，吸附饱和后形成混合悬浊液。取10mL上述混合悬浊液并加入100mL的30℃的已灭菌的浓度为4wt％的海藻酸钠溶液，混匀后得到粘稠状混合液，粘稠状混合液用注射器吸取并注入到500mL的浓度为2.5wt％的CaCl2溶液中分散成球，交联24h，得到固定化微生物溢油修复剂。
经检测，该固定化微生物溢油修复剂中，生物基活性碳占修复剂的质量百分比为0.9wt％，包埋的微生物的浓度为1.1×109cell/g。将其用于石油烃的降解，对1g/L石油烃的降解率为90％。
实施例2：
汉麻杆基活性碳的制备：将原料汉麻杆清理、筛拣、干燥、粉碎，过30目筛，备用。称取上述粉碎好的汉麻杆，按汉麻杆与柠檬酸溶液的质量比1:3加入到质量分数为8％的柠檬酸溶液中，搅拌混匀，在室温下浸渍1h。再将浸渍好的料液放入马福炉中，以45℃/min的升温速率升温至400℃下保温活化80min。将活化好的样品从马福炉中取出，冷却后，将样品倒入10mol/L的氢氧化钠与水按体积比为1:8配制而成的氢氧化钠溶液中浸泡20min。再将样品用75℃热水洗涤至pH中性，将洗涤好的样品放入电热鼓风烘箱中，在105℃干燥4h，取出后放在干燥器中冷却。最后将制得的活化后的样品粉碎过150目筛，制得汉麻杆基活性碳。
固定化微生物溢油修复剂的制备：将上述制得的汉麻杆基活性碳与浓度为3×1010cell/mL的铜绿假单胞菌D-1按质量比1:5混合进行吸附，吸附饱和后形成混合悬浊液。取10mL上述混合悬浊液并加入100mL的32℃的已灭菌的浓度为4.5wt％的海藻酸钠溶液，混匀后得到粘稠状混合液，粘稠状混合液用注射器吸取并注入到500mL的浓度为2.5wt％的CaCl2溶液中分散成球，交联20h，得到固定化微生物溢油修复剂。
经检测，该固定化微生物溢油修复剂中，生物基活性碳修复剂的质量百分比为1.2wt％，包埋的微生物的浓度为2.0×109cell/g。将其用于石油烃的降解，对1g/L石油烃的降解率为85％。
实施例3：
汉麻杆基活性碳的制备：将原料汉麻杆清理、筛拣、干燥、粉碎，过30目筛，备用。称取上述粉碎好的汉麻杆，按汉麻杆与柠檬酸溶液的质量比1:3加入到质量分数为10％的柠檬酸溶液中，搅拌混匀，在室温下浸渍1h。再将浸渍好的料液放入马福炉中，以50℃/min的升温速率升温至500℃下保温活化60min。将活化好的样品从马福炉中取出，冷却后，将样品倒入10mol/L的氢氧化钠与水按体积比为1:9配制而成的氢氧化钠溶液中浸泡20min。再将样品用75℃热水洗涤至pH中性，将洗涤好的样品放入电热鼓风烘箱中，在110℃干燥4h，取出后放在干燥器中冷却。最后将制得的活化后的样品粉碎过150目筛，制得汉麻杆基活性碳。
固定化微生物溢油修复剂的制备：将上述制得的汉麻杆基活性碳与浓度为5×1010cell/mL的铜绿假单胞菌D-1按质量比1:5混合进行吸附，吸附饱和后形成混合悬浊液。取10mL上述混合悬浊液并加入100mL的35℃的已灭菌的浓度为5wt％的海藻酸钠溶液，混匀后得到粘稠状混合液，粘稠状混合液用注射器吸取并注入到500mL的浓度为3wt％的CaCl2溶液中分散成球，交联18h，得到固定化微生物溢油修复剂。
经检测，该固定化微生物溢油修复剂中，生物基活性碳占修复剂的质量百分比为1.4wt％，包埋的微生物的浓度为3.5×109cell/g。将其用于石油烃的降解，对1g/L石油烃的降解率为91％。
实施例4：
汉麻杆基活性碳的制备：将原料汉麻杆清理、筛拣、干燥、粉碎，过35目筛，备用。称取上述粉碎好的汉麻杆，按汉麻杆与柠檬酸溶液的质量比1:4加入到质量分数为12％的柠檬酸溶液中，搅拌混匀，在室温下浸渍1h。再将浸渍好的料液放入马福炉中，以55℃/min的升温速率升温至600℃下保温活化50min。将活化好的样品从马福炉中取出，冷却后，将样品倒入10mol/L的氢氧化钠与水按体积比为1:9配制而成的氢氧化钠溶液中浸泡25min。再将样品用80℃热水洗涤至pH中性，将洗涤好的样品放入电热鼓风烘箱中，在115℃干燥3h，取出后放在干燥器中冷却。最后将制得的活化后的样品粉碎过200目筛，制得汉麻杆基活性碳。
固定化微生物溢油修复剂的制备：将上述制得的汉麻杆基活性碳与浓度为6×1010cell/mL的铜绿假单胞菌D-1按质量比1:4混合进行吸附，吸附饱和后形成混合悬浊液。取10mL上述混合悬浊液并加入100mL的38℃的已灭菌的浓度为5.5wt％的海藻酸钠溶液，混匀后得到粘稠状混合液，粘稠状混合液用注射器吸取并注入到500mL的浓度为3wt％的CaCl2溶液中分散成球，交联15h，得到固定化微生物溢油修复剂。
经检测，该固定化微生物溢油修复剂中，生物基活性碳占修复剂的质量百分比为1.0wt％，包埋的微生物的浓度为4.0×109cell/g。将其用于石油烃的降解，对1g/L石油烃的降解率为89％。
实施例5：
汉麻杆基活性碳的制备：将原料汉麻杆清理、筛拣、干燥、粉碎，过35目筛，备用。称取上述粉碎好的汉麻杆，按汉麻杆与柠檬酸溶液的质量比1:5加入到质量分数为5％的柠檬酸溶液中，搅拌混匀，在室温下浸渍0.5h。再将浸渍好的料液放入马福炉中，以60℃/min的升温速率升温至700℃下保温活化30min。将活化好的样品从马福炉中取出，冷却后，将样品倒入10mol/L的氢氧化钠与水按体积比为1:10配制而成的氢氧化钠溶液中浸泡30min。再将样品用80℃热水洗涤至pH中性，将洗涤好的样品放入电热鼓风烘箱中，在120℃干燥3h，取出后放在干燥器中冷却。最后将制得的活化后的样品粉碎过250目筛，制得汉麻杆基活性碳。
固定化微生物溢油修复剂的制备：将上述制得的汉麻杆基活性碳与浓度为6.5×1010cell/mL的铜绿假单胞菌D-1按质量比1:3混合进行吸附，吸附饱和后形成混合悬浊液。取10mL上述混合悬浊液并加入100mL的40℃的已灭菌的浓度为6wt％的海藻酸钠溶液，混匀后得到粘稠状混合液，粘稠状混合液用注射器吸取并注入到500mL的浓度为3.5wt％的CaCl2溶液中分散成球，交联12h，得到固定化微生物溢油修复剂。
经检测，该固定化微生物溢油修复剂中，生物基活性碳占修复剂的质量百分比为1.3wt％，包埋的微生物的浓度为5.1×109cell/g。将其用于石油烃的降解，对1g/L石油烃的降解率为93％。
对比例1-5：
对比例1-5与实施例1-5的区别仅在于，对比例1-5中不添加生物基活性碳，修复剂仅由海藻酸钠-CaCl2包埋微生物制成。将其用于石油烃的降解，对1g/L石油烃的降解率为67-71％。
在上述实施例及其替换方案中，所述石油烃降解菌还可以为芽孢杆菌ASS-1。
鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近，对石油烃的降解率可达81-95％。故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以实施例1-5作为代表说明本发明申请优异之处。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (10)

1.一种固定化微生物溢油修复剂，其特征在于，所述修复剂以海藻酸钠-CaCl2-生物基活性碳为载体包埋微生物制成，包埋的微生物的浓度为8×108-6×109cell/g。
2.根据权利要求1所述的一种固定化微生物溢油修复剂，其特征在于，所述生物基活性碳占修复剂的质量百分比为0.8-1.5wt％。
3.根据权利要求1或2所述的一种固定化微生物溢油修复剂，其特征在于，所述生物基活性碳为汉麻杆基活性碳。
4.根据权利要求1所述的一种固定化微生物溢油修复剂，其特征在于，所述微生物为石油烃降解菌。
5.一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将生物基活性碳与微生物种子液混合进行吸附，形成混合悬浊液；
S2、在上述混合悬浊液中加入30～40℃的已灭菌的海藻酸钠溶液，混匀后得到粘稠状混合液，粘稠状混合液加入到CaCl2溶液中分散成球，交联12h～24h，得到固定化微生物溢油修复剂。
6.根据权利要求5所述的一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述生物基活性碳与微生物种子液的质量比1:3～1:6。
7.根据权利要求5或6所述的一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述生物基活性碳为汉麻杆基活性碳，粒径为100～250目。
8.根据权利要求5或6所述的一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述微生物种子液为石油烃降解菌，微生物种子液的浓度为1.5×1010～6.5×1010cell/mL。
9.根据权利要求5所述的一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述混合悬浊液与海藻酸钠溶液的体积比为1:10，海藻酸钠溶液的浓度为4wt％～6wt％。
10.根据权利要求5所述的一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述CaCl2溶液与海藻酸钠溶液的体积比为5:1，CaCl2溶液的浓度为2.5wt％～3.5wt％。
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