CN106701732A - 一种藤黄球菌固定化小球的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种藤黄球菌固定化小球的制备方法，本方法是将藤黄球菌包埋在海藻酸钠‑多孔土质滤材混合液中，可稳定保持藤黄球菌活性，使其成为长期提供复苏促进因子Rpf蛋白的来源，Rpf蛋白可复苏促进有毒难降解有机污染环境中的潜在功能菌群，强化该类污染物的高效降解。本发明还提供了藤黄球菌固定化小球在降解有毒有机污染物中的应用，与常用的固定化载体粉末活性炭相比，运行成本更低，更具显著的经济效益与环保效益。本发明可用于焦化废水、高盐含酚废水、印染废水和制药废水等有毒有害、难降解高浓度有机工业废水的生物处理系统中。

Description

一种藤黄球菌固定化小球的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及污染物微生物降解领域，尤其涉及一种藤黄球菌固定化小球的制备方法及其在降解有毒有机污染物中的应用。
背景技术
近年来，随着石油化工、制药、建材、农药、造纸、电子、煤气、纺织、染料、塑料和焦化等工业的迅速发展，难降解有机工业废水排放量大大增加。难降解有机污染物的工业废水不仅对环境造成严重污染，而且对人体、水生生物及农作物的危害日益加剧，严重破坏生态平衡。有毒有害、难降解高浓度有机工业废水的处理一直是国内外污水处理领域的研究热点和难点。因此，有效治理难降解有机废水具有重要意义，开发高效、经济环保的有机工业废水处理技术是社会发展中迫切需要解决的关键技术问题。虽然基于物理和化学原理的难降解有机工业废水处理技术，如吸附法、萃取法、膜分离法、高级氧化法等已得到一定程度的应用，但因不同废水中有机物种类和含量具有相当宽的范围，具体应用时存在低效、成本高、二次污染等问题而很难达到预期的处理效果。由于微生物降解治理技术具有安全、高效、经济等特点而成为有机工业废水无害化处理的研究热点。同时，固定化微生物、基因工程改造微生物、质粒育种、微生物制剂等生物强化技术已发展为污染环境微生物修复领域备受关注的新研究方向。
然而，迄今为止用于有机废水生物处理的降解菌筛选菌源仅限于基于常规分离培养方法所能获得的仅占0.01～10％的微生物菌群，大量的潜在功能菌群因处于活的但非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态而未被研究。早在1985年，美国微生物学家Colwell教授在Nature Biotechnology发表论文提出VBNC概念，细菌的VBNC状态是非芽孢形成菌应对各种环境压力时所选择的一种生存机制，其具体表现为细胞浓缩成球形，用常规的培养方法不能使其生长繁殖，但仍具代谢活性，当给予适宜条件时能够恢复其生长繁殖。三十多年来在VBNC菌的诱导、复苏及其形成机理方面已有众多研究成果。研究发现，传统分离方法能够培养的微生物数量仅占活性污泥微生物总量的1％-15％，难降解有机废水中存在大量VBNC状态或难培养菌群，如将从某污染物驯化的富集培养体中分离的单菌株重新混合培养，无法获得与富集培养体相同的降解活性，其原因可能为某些降解菌或与降解菌协同共生的菌株无法分离培养。另外，大多数由实验室分离获得的高效降解菌株或富集培养体在实际废水处理的生物系统中均表现出较低的降解活性，推测其可能受环境压力胁迫进入了VBNC状态。基于上述分析可知，在难降解有机废水的生物处理系统中，大量的功能菌群因来自高浓度有毒难降解有机物的胁迫而处于VBNC状态。虽然随着分子生物学技术的发展，基于非培养方法可研究难降解有机废水中微生物群落的组成、菌群的活性及数量动态变化，但不能获得有机污染物降解过程中起关键作用的功能菌群。因此，复苏培养作为绝大部分微生物资源的VBNC菌群，成为寻找高效有机污染物降解菌种资源的重要途径，同时为防止降解菌进入VBNC状态以获得更好的水污染环境修复能力提供新的思路。
藤黄球菌复苏促进因子(resuscitation-promoting factor,RPF)的发现被认为是复苏培养VBNC状态菌的最重要突破，它不仅能复苏促进近缘高G+C的革兰氏阳性(G+)菌的生长，对低G+C的G+菌及部分革兰氏阴性(G-)菌也有较好的复苏促进功能。近年来，利用复苏促进因子Rpf复苏培养VBNC状态菌的研究主要集中于医学和流行病学领域中的潜在病原菌发现、疫苗研制，及农业系统中食源性病原菌的检测等方面。以寻找新的菌种资源及环境功能菌角度研究RPF对VBNC菌群的复苏促进作用较为罕见。VBNC菌作为自然环境中绝大部分微生物资源，面对日益严重的水环境污染问题，如何利用VBNC菌中潜在的功能菌群进行水污染治理及生态修复具有重要的研究价值。藤黄球菌Rpf作为一种高效生物强化剂，在皮摩尔浓度即可使细菌的可培养数量增长100倍以上且能促进可培养细胞的生长，利用Rpf复苏促进废水生物处理系统中的潜在功能菌群具有重要意义。但藤黄球菌Rpf蛋白提取和纯化成本较高，Rpf蛋白不稳定，成为阻碍该技术广泛应用的限制性因素。包埋固定化微生物技术是用化学或物理的手段将游离微生物定位于限定的载体空间领域，并使其保持活性和反复利用的方法。这种固定化细菌的方法能纯化和保持高效菌种，因此具有处理效率高、反应易于控制、菌种高纯高效、生物浓度高等优点，现在常用的包埋材料有聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠(SA)，但这些材料固定的包埋小球普遍存在成球形差、机械强度低、易破碎等问题。
本专利试图寻找一种方法将藤黄球菌固定在限定的载体中，既可以从载体外部获取物质和能源并持续地分泌Rpf蛋白，又可以抵抗污染环境中恶劣极端环境。因此，该技术方法不需提取和纯化藤黄球菌Rpf蛋白，直接利用藤黄球菌分泌Rpf蛋白进行高效强化有毒有机污染物的降解，解决有毒有机污染物毒性高和难生物降解难题。同时，可在保证处理效果的情况下，多次回收反复利用，显著降低处理成本，具有很好的经济和环境效益。
因此，制备藤黄球菌固定化小球，一方面可以使藤黄球菌持续不断的分泌Rpf蛋白，另一方面可以保护藤黄球菌抵抗不良或不利的污染极端环境，最终实现有毒有机污染物的高效降解，正是本发明的关键所在。
发明内容
本发明的目的是针对高浓度有毒难降解有机工业废水生物处理的难点，提供一种藤黄球菌固定化小球的制备方法及其在降解有毒有机污染物中的应用，利用藤黄球菌Rpf蛋白的复苏促进功能，以实现有毒有机污染物的高效降解及Rpf蛋白的低成本循环利用。
为达上述目的是通过以下技术方案实现的:一种藤黄球菌固定化小球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将-70℃保存的藤黄球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)接种至液体复活培养基中培养，其液体复活培养基组成是：3-5g的蛋白胨，2-4g的酵母膏，1.0-2.0g的矿质盐溶液，pH为6.5-7.5；30℃培养24-48h，获得活化后的种子培养液。
(2)将步骤(1)获得的种子液接种至LMM液体培养基中进行扩大培养，使其培养液OD600nm为0.3-0.6，将菌液在6000-9000r/min下离心10-20min，收集菌体，用磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)洗涤2-4次，加入PBS制备OD600nm为0.3-0.6的菌悬液。
(3)将步骤(2)获得的菌悬液与一定量的多孔土质滤材充分混合，然后与一定量海藻酸钠溶液混合均匀，得到藤黄球菌-海藻酸钠-多孔土质滤材混合溶液，其中，藤黄球菌、海藻酸钠和多孔土质滤材的质量浓度分别为5.0-7.0％、2.0-3.5％和0.5-1.5％。
(4)在步骤(3)所获的藤黄球菌-海藻酸钠-多孔土质滤材混合液中逐滴加入固定剂CaCl2溶液，使得CaCl2的最终质量分数为3.5-5.0％，边搅拌边滴加，滴加速度为1.5-2.0mL/min,得到凝胶颗粒；将凝胶颗粒在空气中静置0.5-1.5h后，浸没于4℃，质量分数为3.0％-4.5％的CaCl2溶液中交联2-4h，获得直径为2-4mm的固定化小球，之后用无菌蒸馏水冲洗3-4次，得到藤黄球菌固定化小球于4℃保存备用。
进一步地，最佳包埋条件为(质量浓度)：包埋藤黄球菌量为6.5％、固定化载体多孔土质滤材为1.0％、包埋剂海藻酸钠为2.5％、固定剂CaCl2为4％；固定剂的滴加速度为1.5mL/min，凝胶颗粒放置时间为1.5h，浸没于4℃、质量分数为4.5％的CaCl2溶液中，交联时间为4h。
进一步地，所述矿质盐溶液的配方如下：0.375g/L的CuSO4·5H2O，0.785g/L的MnCl2·4H2O，0.18g/L的FeSO4·7H2O，0.029g/L的Na2MoO4·2H2O，0.089g/L的ZnSO4·7H2O，溶剂为水。
进一步地，所述多孔土质滤材由火山灰性土烧制成，空隙直径为0.1-4.0μm，每升比表面积1-5万M2、颗粒直径1-10mm。
一种藤黄球菌固定化小球在降解有毒有机污染物中的应用，该应用具体为：将藤黄球菌固定化小球固定化小球浸泡在液体复活培养基20-25h。然后将固定化小球置于废水中，其固定化小球体积与废水的体积比为1:1000-1:100。
本发明与现有的难降解有机工业废水生物强化技术相比，其有益效果在于：
1、将藤黄球菌固定在海藻酸钠-多孔土质滤材中，一方面，多孔土质滤材可吸附废水中有机物，为藤黄球菌提供充足的碳源，保持菌体生长活性，并不断分泌Rpf蛋白，由此不仅可以促进有毒难降解有机工业废水中可培养功能菌群的生长，同时可复苏刺激废水中潜在的功能菌群的生长，使得功能菌群保持高降解活性，从而强化有毒难降解污染物的高效降解。另一方面，藤黄球菌包埋在固定化小球中，可以保护藤黄球菌免受有毒污染物的冲击，使其成为长期提供复苏促进因子Rpf蛋白的来源。
2、在废水生物处理体系中，多孔土质滤材可以改善活性污泥性能。如发明专利《水质净化微生物生态系统及其应用》(CN102701463B)所述多孔土质滤材中，为由火山灰性土烧制成，具有空隙直径为0.1-4.0μm，每升比表面积1-5万M2、颗粒直径1-10mm的通水性过滤材料，向活性污泥系统中添加多孔土质滤材可以增大活性污泥絮体粒径，进而改善污泥沉降性，提高固液分离效果。
3、固定化小球中添加多孔土质滤材可以提高小球的机械强度，克服传统固定化小球的机械强度低的缺陷，可耐受高强度的力学或水力学冲击。
4、固定化小球中的多孔土质滤材可直接释放到生物处理系统中，以作为生物膜附着的载体，而提高生物处理系统的运行效率。与常用的固定化载体粉末活性炭相比，运行成本更低，更具显著的经济效益与环保效益。
5、应用前景广泛。该技术可强化各种高浓度有毒难降解有机工业废水的生物处理，利用Rpf复苏促进废水生物处理系统中的潜在功能菌群，为难降解有机工业废水的生物处理提供新的思路及开辟新的途径，同时为微生物修复技术的开发应用提供更广阔的前景。
附图说明
图1为本发明的发明流程图。
具体实施方式
本发明以海藻酸钠为包埋剂，多孔土质滤材为添加剂，将藤黄球菌包埋制备藤黄球菌凝胶小球。海藻酸钠具有原料价廉易得、无毒、网络孔隙大、传质阻力小、制备简单等优点，是一种常用的包埋材料，但也存在机械强度不足的问题。利用孔土质滤材的立体多孔结构，除了可以吸附污染物增强污染物的降解作用外，还可起到支撑包埋小球空间骨架的作用，提高其机械强度，并为藤黄球菌提供附着环境，减少生物量的流失。具体包括以下步骤：
(1)藤黄球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)可购于日本理化学研究所微生物菌种保藏中心。将-70℃保存的藤黄球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)接种至液体复活培养基中培养，其液体复活培养基组成是：5g的蛋白胨，4g的酵母膏，2.0g的矿质盐溶液，pH为7.5；30℃培养24h，获得活化后的种子培养液；所述矿质盐溶液的配方如下：0.375g/L的CuSO4·5H2O，0.785g/L的MnCl2·4H2O，0.18g/L的FeSO4·7H2O，0.029g/L的Na2MoO4·2H2O，0.089g/L的ZnSO4·7H2O，溶剂为水。
(2)将步骤(1)将所获得的种子液接种至LMM液体培养基中，其中LMM液体培养基组成是：4.5g/L的NH4Cl，1.0-2.0g/L的KH2PO4，0.005g/L的生物素，0.02g/L的L-蛋氨酸，0.04g/L的维生素B1，0.5-1.5g/L的肌苷，0.03g/L的MgSO4，10.0g/L的L-乳酸锂盐，1.5-3.0ml/L的矿质盐溶液(0.375g/L的CuSO4·5H2O，0.785g/L的MnCl2·4H2O，0.18g/L的FeSO4·7H2O，0.029g/L的Na2MoO4·2H2O，0.089g/L的ZnSO4·7H2O，溶剂为水)，pH为6.5-8.0，160r/min振荡培养36-48h，使其培养液OD600nm为0.3-0.6，将菌液在6000-9000r/min下离心20min，收集菌体，用磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)洗涤2-4次，加入PBS制备OD600nm为0.3-0.6的菌悬液；
(3)将步骤(2)获得的菌悬液与一定量的多孔土质滤材充分混合，然后与一定量海藻酸钠溶液混合均匀，得到藤黄球菌-海藻酸钠-多孔土质滤材混合溶液，其中，藤黄球菌、海藻酸钠和多孔土质滤材的质量浓度分别为7.0％、3.5％和1.5％。其中的多孔土质滤材可以采用如发明专利《水质净化微生物生态系统及其应用》(CN102701463B)所述的多孔土质滤材，由火山灰性土烧制成，具有空隙直径为0.1-4.0μm，每升比表面积1-5万M2、颗粒直径1-10mm，向活性污泥系统中添加多孔土质滤材可以增大活性污泥絮体粒径，进而改善污泥沉降性，提高固液分离效果。
(4)在步骤(3)所获的藤黄球菌-海藻酸钠-多孔土质滤材混合液中逐滴加入固定剂CaCl2溶液，使得CaCl2的最终质量分数为3.5％，边搅拌边滴加，滴加速度为2.0mL/min；将所形成的凝胶颗粒在空气中静置1.5h后，浸没于4℃，质量分数为4.5％的CaCl2溶液中交联2h，获得直径为2-4mm的固定化小球，之后用无菌蒸馏水冲洗3-4次，得到藤黄球菌固定化小球于4℃保存备用。
将上述制备得到的藤黄球菌固定化小球用于难降解有机废水的降解，具体为：
(1)在处理有毒难降解有机废水前，将固定化小球浸泡在液体复活培养基25h。然后将固定化小球添加至废水处理系统中，其固定化小球体积与废水体积比为1:1000；
(2)以相同运行条件未添加固定化小球为对照组，每隔10h取两组的水样及污泥样，通过对出水COD和难降解有机化合物含量的测定，及对活性污泥中菌群多样性的研究，从而分析固定化小球对难降解有机工业废水生物处理效能的影响。
(3)结果表明，添加固定化小球的效果显著，具体为COD去除率提高65％、难降解有机化合物去除率提高60％、香农多样性指数值由1.50上升至2.40。
实施例2
1.藤黄球菌菌悬液的制备
藤黄球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)可购于日本理化学研究所微生物菌种保藏中心。将-70℃保存的藤黄球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)接种至液体复活培养基中培养，其液体复活培养基组成是：3g的蛋白胨，3g的酵母膏，1.5g的矿质盐溶液，pH为7.3；30℃培养36h，获得活化后的种子培养液；
将所获得的种子液接种至LMM液体培养基中，其中LMM液体培养基组成是：3.5g/L的NH4Cl，1.5g/L的KH2PO4，0.005g/L的生物素，0.02g/L的L-蛋氨酸，0.04g/L的维生素B1，1.0g/L的肌苷，0.03g/L的MgSO4，9.0g/L的L-乳酸锂盐，2.0ml/L的矿质盐溶液(0.375g/L的CuSO4·5H2O，0.785g/L的MnCl2·4H2O，0.18g/L的FeSO4·7H2O，0.029g/L的Na2MoO4·2H2O，0.089g/L的ZnSO4·7H2O，溶剂为水)，pH为7.5，160r/min振荡培养40h，获使其培养液OD600nm为0.5，将菌液在7000r/min下离心15min，收集菌体，用磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)洗涤3次，加入等量PBS制备OD600nm为0.5的菌悬液；
2.包埋藤黄球菌固定化小球的制备
将上述所获的菌悬液与一定量的灭菌后的多孔土质滤材(121℃,15min)充分混合；称取2.0g海藻酸钠放入烧杯中，加入98mL超纯水，边搅拌边水浴加热直至海藻酸钠熔化，灭菌后冷却，再加入上述混合物质搅拌至均匀，得到藤黄球菌-海藻酸钠-多孔土质滤材混合液，其中，藤黄球菌、海藻酸钠和多孔土质滤材的质量浓度分别为6.5％、2.5％和1.0％。
将上述藤黄球菌-海藻酸钠-粉末活性炭混合液逐滴加入质量分数为4％的CaCl2中，边搅拌边滴加，滴加速度为1.5mL/min，将所形成的凝胶颗粒放置1h后，浸没于4℃，质量分数为4.5％的CaCl2溶液中交联4h，获得直径为2mm的固定化小球，之后用无菌蒸馏水冲洗3次，于4℃保存备用。
3.包埋藤黄球菌固定化小球对高毒性难降解印染废水生物处理效能的影响
应用包埋藤黄球菌固定化小球处理印染废水时，过程如下：从处理印染废水反应器中取一定量的污泥，与印染废水一起加入血清瓶中，分两组试验，处理组加入活化后的固定化小球(固定化小球与印染废水投加比为0.6％)，对照组不添加固定化小球，混合体系初始印染废水浓度为15000mg/L。之后将两组血清瓶于30℃，180rpm摇床中培养，每隔12h取水样，测定培养液中邻苯基苯酚的降解率。结果表明，未添加包埋藤黄球菌固定化小球的对照组，邻苯基苯酚48h的去除率约为29.3％，COD的去除率为64.7％，而添加包埋藤黄球菌固定化小球后，邻苯基苯酚48h的去除率显著提高至68.9％，COD去除率提高至98.2％，与未添加包埋藤黄球菌固定化小球相比，包埋后的藤黄球菌固定化小球具有良好的有毒有机污染物降解性能。

Claims (5)

1.一种藤黄球菌固定化小球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将-70℃保存的藤黄球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)接种至液体复活培养基中培养，其液体复活培养基组成是：3-5g的蛋白胨，2-4g的酵母膏，1.0-2.0g的矿质盐溶液，pH为6.5-7.5；30℃培养24-48h，获得活化后的种子培养液。
(2)将步骤(1)获得的种子液接种至LMM液体培养基中进行扩大培养，使其培养液OD600nm为0.3-0.6，将菌液在6000-9000r/min下离心10-20min，收集菌体，用磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)洗涤2-4次，加入PBS制备OD600nm为0.3-0.6的菌悬液。
(3)将步骤(2)获得的菌悬液与一定量的多孔土质滤材充分混合，然后与一定量海藻酸钠溶液混合均匀，得到藤黄球菌-海藻酸钠-多孔土质滤材混合溶液，其中，藤黄球菌、海藻酸钠和多孔土质滤材的质量浓度分别为5.0-7.0％、2.0-3.5％和0.5-1.5％。
(4)在步骤(3)所获的藤黄球菌-海藻酸钠-多孔土质滤材混合液中逐滴加入固定剂CaCl2溶液，使得CaCl2的最终质量分数为3.5-5.0％，边搅拌边滴加，滴加速度为1.5-2.0mL/min,得到凝胶颗粒；将凝胶颗粒在空气中静置0.5-1.5h后，浸没于4℃，质量分数为3.0％-4.5％的CaCl2溶液中交联2-4h，获得直径为2-4mm的固定化小球，之后用无菌蒸馏水冲洗3-4次，得到藤黄球菌固定化小球于4℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，最佳包埋条件为(质量浓度)：包埋藤黄球菌量为6.5％、固定化载体多孔土质滤材为1.0％、包埋剂海藻酸钠为2.5％、固定剂CaCl2为4％；固定剂的滴加速度为1.5mL/min，凝胶颗粒放置时间为1.5h，浸没于4℃、质量分数为4.5％的CaCl2溶液中，交联时间为4h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述矿质盐溶液的配方如下：0.375g/L的CuSO4·5H2O，0.785g/L的MnCl2·4H2O，0.18g/L的FeSO4·7H2O，0.029g/L的Na2MoO4·2H2O，0.089g/L的ZnSO4·7H2O，溶剂为水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多孔土质滤材由火山灰性土烧制成，空隙直径为0.1-4.0μm，每升比表面积1-5万M2、颗粒直径1-10mm。
5.一种权利要求1所述方法得到的藤黄球菌固定化小球在降解有毒有机污染物中的应用，其特征在于，该应用具体为：将藤黄球菌固定化小球固定化小球浸泡在液体复活培养基20-25h。然后将固定化小球置于废水中，其固定化小球体积与废水的体积比为1:1000-1:100。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753647A (zh) * 2018-06-12 2018-11-06 湖北师范大学 一种除砷固载化小球及其用途
CN109536431A (zh) * 2018-12-04 2019-03-29 江苏省农业科学院 复合生化复苏因子组合物及其应用
CN109970183A (zh) * 2019-03-31 2019-07-05 浙江大学 一种复苏促进因子在印染废水处理中的应用及处理方法
CN111995063A (zh) * 2020-08-18 2020-11-27 普罗生物技术（上海）有限公司 粉末状活性炭载体及其制备方法与应用
CN112960778A (zh) * 2021-02-23 2021-06-15 吴奇桐 一种降解多环类有机物的组合物及其制备方法和应用
CN116062905A (zh) * 2022-12-23 2023-05-05 浙江大学 负载复苏促进因子的凹凸棒颗粒及其在污水处理中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001314882A (ja) * 2000-05-09 2001-11-13 Dreams:Kk バイオ浄化資材およびその製造方法
CN102701463A (zh) * 2012-06-20 2012-10-03 浙江师范大学 水质净化微生物生态系统及其应用
CN104830826A (zh) * 2015-04-13 2015-08-12 浙江海洋学院 包埋固定化微生物球的制备方法及其制备装置

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001314882A (ja) * 2000-05-09 2001-11-13 Dreams:Kk バイオ浄化資材およびその製造方法
CN102701463A (zh) * 2012-06-20 2012-10-03 浙江师范大学 水质净化微生物生态系统及其应用
CN104830826A (zh) * 2015-04-13 2015-08-12 浙江海洋学院 包埋固定化微生物球的制备方法及其制备装置

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753647A (zh) * 2018-06-12 2018-11-06 湖北师范大学 一种除砷固载化小球及其用途
CN109536431A (zh) * 2018-12-04 2019-03-29 江苏省农业科学院 复合生化复苏因子组合物及其应用
CN109970183A (zh) * 2019-03-31 2019-07-05 浙江大学 一种复苏促进因子在印染废水处理中的应用及处理方法
CN109970183B (zh) * 2019-03-31 2021-01-15 浙江大学 一种复苏促进因子在印染废水处理中的应用及处理方法
CN111995063A (zh) * 2020-08-18 2020-11-27 普罗生物技术（上海）有限公司 粉末状活性炭载体及其制备方法与应用
CN112960778A (zh) * 2021-02-23 2021-06-15 吴奇桐 一种降解多环类有机物的组合物及其制备方法和应用
CN116062905A (zh) * 2022-12-23 2023-05-05 浙江大学 负载复苏促进因子的凹凸棒颗粒及其在污水处理中的应用
CN116062905B (zh) * 2022-12-23 2023-10-03 浙江大学 负载复苏促进因子的凹凸棒颗粒及其在污水处理中的应用

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