CN107937383A - 一种固定化微生物复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种固定化微生物复合菌剂，所述固定化微生物复合菌剂包括氨化细菌、硝化细菌和好氧反硝化细菌，其配比为2：(1～2)：(1～2)；制备方法，制备氨化菌株湿菌体、硝化菌株湿菌体和好氧反硝化菌株湿菌体；将三种混合体通过注射器分别滴入交联剂中，后得固定化小球；将得到的固定化小球按比例混合得到所述固定化微生物复合菌剂。本发明可以用于废水中氮素的降解，不仅有很高的降解效率和耐受浓度，而且可以重复使用。

Description

一种固定化微生物复合菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及湖水净化领域或者水质生态修复领域或者微生物复合菌制备领域，特别涉及一种固定化微生物复合菌剂及其制备方法。

背景技术

固定化微生物技术是上世纪60年代基于固定化酶技术发展起来的一种新型生物技术，该技术利用一些生物或化学材料，再通过一定的物理或化学手段将环境中存在的一些能够凭借微生物活性和自身新陈代谢将环境中的污染物吸附或降解的游离微生物聚集在限定的空间内，在保持微生物具有生物活性的前提下，进一步提高微生物的浓度，并延长其作用的时间，增加微生物对外界环境不利因素的耐受性，同时还可以实现其循环利用的价值。氮(N)是导致水体富营养化的关键营养元素之一。研究表明，通过植物吸收仅能去除水体1％～5％的氮，而微生物驱动的氮的生物地球化学循环才是氮素脱离污染水体的主要途径。其中，有机氮在氨化细菌的氨化作用下被降解为NH₄ ⁺-N，之后在硝化细菌的硝化作用下将NH₄ ⁺-N转化为NO₂ ^--N和NO₃ ^--N，最后，在反硝化细菌的作用下，利用NO₃ ^--N为电子受体进行新陈代谢，最终将氮转化为氮气而脱离系统，从而实现对氮素污染的净化和修复。

然而，由于我国当前水环境，尤其是城市河道呈现出低透明度，低溶解氧，高氨氮的严重污染现状，使得沉水植物、漂浮植物等诸多高等水生植物消失，城市河道水体异质性差，从而导致水体中微生物含量下降，缺乏栖息附着的场所，最终降低了氮素的净化效果。如专利号为201110218629.X的专利公开了一种复合微生物菌剂及其固定化方法和应用，专利号为201610271762.4的专利公开了一种提高硝基苯降解菌降解能力的固定化方法。微生物固定化技术可有效减少或抑制菌体的流失，经固定后可保持较高的微生物活性，显著提高了对有毒物质的耐受性和对有机物的降解效率，并且能够反复循环使用。固定化微生物复合菌剂在对生活污水、高浓度有机废水的处理中都具有很好的净化功能。在污染水处理过程中，主要是利用复合微生物的高浓度、高代谢活性以及微生物不同种类之间的共代谢作用充分有效地降解污水中的污染物质。由此可见，该处理方法不仅不向水体中投放任何化学或有毒试剂，不会造成二次污染，并且高效、操作简便、低能低耗。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种固定化微生物复合菌剂及其制备方法，该固定化微生物复合菌剂具有较高的降解总氮的效率，固定化微生物复合菌剂的固定化小球可重复使用，能够适应实际条件中的不同情况。

本发明是通过以下技术手段实现上述技术目的的。

一种固定化微生物复合菌剂，所述固定化微生物复合菌剂包括氨化细菌、硝化细菌和好氧反硝化细菌，氨化细菌、硝化细菌和好氧反硝化细菌的质量配比为：氨化细菌：硝化细菌：好氧反硝化细菌＝2：(1～2)：(1～2)。

进一步，所述质量配比为：氨化细菌：硝化细菌：好氧反硝化细菌＝2：1：1。

一种固定化微生物复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：

S01：制备氨化菌株湿菌体、硝化菌株湿菌体和好氧反硝化菌株湿菌体；

S02：分别取三种湿菌体与聚乙烯醇和海藻酸钠的混合溶液混合，得到三种混合体；

S03：将三种混合体通过注射器分别滴入交联剂中，经充分交联后，用无菌水清洗小球过滤后即得氨化细菌固定化小球、硝化细菌固定化小球和好氧反硝化细菌固定化小球；

S04：将得到的氨化细菌固定化小球、硝化细菌固定化小球和好氧反硝化细菌固定化小球按照质量比例2：(1～2)：(1～2)混合，得到所述固定化微生物复合菌剂。

进一步，所述S01步骤具体为：

S01.1：将底泥样品加入盛有无菌水的三角瓶中，然后在三角瓶中加入玻璃球；将三角瓶放在恒温震荡箱中培养，得到菌悬液；

S01.2：取菌悬液，分别制得氨化菌株、硝化菌株和好氧反硝化菌株；

S01.3：将氨化菌株、硝化菌株和好氧反硝化菌株在富集培养基中分别培养至对数期，离心后得到三种湿菌体。

进一步，所述S01.1步骤中恒温震荡箱的温度为30℃，恒温震荡箱的转速为160rpm，在恒温震荡箱中培养时间为24h。

进一步，所述S02步骤中混合溶液的聚乙烯醇和海藻酸钠质量比为10:3。

进一步，所述S03步骤中交联剂为质量浓度为2％的饱和硼酸-氯化钙溶液。

进一步，所述S03步骤中得到氨化细菌固定化小球、硝化细菌固定化小球和好氧反硝化细菌固定化小球直径均为2.0～3.5mm。

进一步，所述的固定化微生物复合菌剂在降解有机废水或者生活污水中的氮的用途。

进一步，所述固定化微生物复合菌剂为权利要求1所述的固定化微生物复合菌剂；所述固定化微生物复合菌剂的用量为：设废水中氮素的含量为A g/L，所述固定化微生物复合菌剂中的氨化细菌固定化小球为10*A份。

本发明的有益效果在于：

1.本发明所述的固定化微生物复合菌剂，通过氨化细菌：硝化细菌：好氧反硝化细菌＝2：(1～2)：(1～2)，该配比的固定化微生物复合菌剂，用于废水中氮素的降解，不仅有很高的降解效率和耐受浓度，而且可以重复使用。

2.本发明所述的固定化微生物复合菌剂的制备方法，不向水体中投放有毒试剂，不会造成二次污染，并且经济高效、操作简便、低能低耗。

3.本发明所述的固定化微生物复合菌剂的制备方法，实验条件下的最佳配置比例，不仅对实际工程中的应用有一定的指导意义，而且对去除污水中氮素的固定化微生物菌剂研究具有重要意义。

4.本发明所述的固定化微生物复合菌剂的制备方法，该配比的固定化微生物复合菌剂的氮素去除率达90％以上。

附图说明

图1为本发明所述固定化微生物复合菌剂在不同固定化微生物配置比例的实验条件下降解氮含量的性能测定结果图。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

本发明所述的固定化微生物复合菌剂，所述固定化微生物复合菌剂由氨化细菌、硝化细菌和好氧反硝化细菌组成，其质量配比为：氨化细菌：硝化细菌：好氧反硝化细菌＝2：(1～2)：(1～2)。

本发明所述的固定化微生物复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：

S01：制备氨化菌株湿菌体、硝化菌株湿菌体和好氧反硝化菌株湿菌体；具体如下：

S01.1：将底泥样品1g加入盛有99ml无菌水的三角瓶中，然后在三角瓶中加入玻璃球；将三角瓶放在恒温震荡箱中培养，恒温震荡箱温度为30℃，恒温震荡箱转速为160rpm，培养时间为24h，得到菌悬液；

S01.2：取菌悬液，分别制得氨化菌株、硝化菌株和好氧反硝化菌株；具体为：

S01.2.1：制得好氧反硝化菌株具体为：取菌悬液10mL，进行梯度稀释分别制得浓度为10^-3～10^-8的菌悬液，取10^-5、10^-6、10^-7个稀释梯度涂布于BTB选择性固体培养基，在温度35℃下，倒置培养约48h，选取生长快、形态不同且周围有蓝色晕圈的菌落在BTB选择性固体培养基上划线，反复划线分离直至得到单菌落。对分离得到的纯菌株，进行试管斜面划线，作为保藏菌株，即为好氧反硝化菌株；

S01.2.2：制得氨化菌株具体为：取菌悬液10mL，进行梯度稀释分别制得浓度为10^-3～10^-8的菌悬液，取10^-4、10^-5、10^-6个稀释梯度涂布于氨化细菌固体培养基，将平板倒置于35℃恒温培养箱内培养。对菌落形态颜色各异的菌株，进行单菌落划线挑选，并编号。将挑选所得的菌株进行划线分离纯化，经过行多次划线分离，直至得到纯菌株。对分离得到的纯菌株，进行试管斜面划线，作为保藏菌株，即为氨化菌株；

S01.2.3：制得硝化菌株具体为：取菌悬液10mL，进行梯度稀释分别制得浓度为10^-3～10^-8的菌悬液，取10^-4、10^-5、10^-6个稀释梯度涂布于硝化细菌固体分离培养基，将平板倒置于35℃恒温培养箱内培养。对菌落形态颜色各异的菌株，进行单菌落划线挑选，并编号。将挑选所得的菌株进行划线分离纯化，经过行多次划线分离，直至得到纯菌株。对分离得到的纯菌株，进行试管斜面划线，作为保藏菌株，即为硝化菌株；

S01.2.4：将氨化菌株、硝化菌株和好氧反硝化菌株在LB富集培养基中分别培养至对数期，取处于对数期的三种菌液各10mL，5000rpm，离心7min，用无菌水吹洗，重复三次后得到三种湿菌体；

S02：分别取1mL(1×10⁸cfu·mL^-1)三种湿菌体与含30mL最佳固定化的聚乙烯醇PVA和海藻酸钠SA的混合溶液混合，得到三种混合体；混合溶液的聚乙烯醇和海藻酸钠质量比为10:3。

S03：将三种混合体通过注射器分别滴入交联剂中，经充分交联后，用无菌水清洗小球过滤后即得氨化细菌固定化小球、硝化细菌固定化小球和好氧反硝化细菌固定化小球，氨化细菌固定化小球、硝化细菌固定化小球和好氧反硝化细菌固定化小球直径均为2.0～3.5mm；交联剂为质量浓度为2％的饱和硼酸-氯化钙溶液，即氯化钙溶度为20g/L；

S04：将得到的氨化细菌固定化小球、硝化细菌固定化小球和好氧反硝化细菌固定化小球按照质量比例2：(1～2)：(1～2)混合，得到所述固定化微生物复合菌剂。

上述步骤中提到的培养基，下面具体说明：

氨化细菌培养基：蛋白胨5g·L^-1；NaCl 0.25g·L^-1；FeSO₄·7H₂O 0.01g·L^-1；MgSO₄·7H₂O 0.5g·L^-1；K₂HPO₄ 0.5g·L^-1；pH7.3。

硝化细菌培养基：牛肉膏3g·L^-1；蛋白胨10g·L^-1；NaCl 5g·L^-1；琼脂20g·L^-1；pH7.0～7.3。

硝化细菌分离培养基：葡萄糖5g·L^-1；(NH₄)₂SO₄ 0.5g·L^-1；NaCl 0.3g·L^{- 1}MgSO₄·7H₂O 0.3g·L^-1；CaCl₂ 0.03g·L^-1；K₂HPO₄ 1g·L^-1；FeSO₄·7H₂O 0.03g·L^-1；pH7.1～7.3。

好氧反硝化细菌富集培养基：NaCl 5g·L^-1；蛋白胨8.6g·L^-1；C₄H₄Na₂O₄ 1.5g·L^-1；KNO₃ 1g·L^-1；pH 7.0～7.2。

选择性培养基(BTB培养基)：Na₂HPO₄ 7.9g·L^-1；BTB 1mL(0.1g BTB溶于10mL酒精)；K₂HPO₄ 1.5g·L^-1；MgSO₄·7H₂O 0.1g·L^-1；KNO₃ 1g·L^-1；C₄H₄Na₂O₄ 9.4g·L^-1；pH7.1。

反硝化性能测定培养基：KNO₃ 1g·L^-1；C₄H₄Na₂O₄ 9.4g·L^-1；Na₂HPO₄ 7.9g·L^-1；MgSO₄·7H₂O 0.1g·L^-1；K₂HPO₄ 1.5g·L^-1；pH7.0～7.3。

本发明所述的固定化微生物复合菌剂用于降解水中的氮的方法为：

a：设1mL氨化菌湿菌体制得的氨化细菌固定化小球视作1份，设1mL硝化菌湿菌体制得的硝化细菌固定化小球视作1份，设1mL好氧反硝化菌湿菌体制得的好氧反硝化细菌固定化小球视作1份；

b：设废水中氮素的含量为A g/L，将氨化细菌固定化小球、硝化细菌固定化小球和好氧反硝化细菌固定化小球按照质量比例2∶1：1混合后投入废水中，其中氨化细菌固定化小球为A*10份，经过一段时间后，废水中氮素去除率达90％以上。

如表1所示，为本发明所述的固定化微生物复合菌剂具体使用方法的实施例，将氨化细菌固定化小球、硝化细菌固定化小球和好氧反硝化细菌固定化小球按照不同的配比进行组合，每组分别对100mL模拟废水进行处理。模拟废水终浓度组成为：NH₄Cl 15mg/L，KNO₃5mg/L，KH₂PO₄ 1.5mg/L，葡萄糖60mg/L，pH 7.0～7.2，溶剂为水，氯化铵和硝酸钾为氮源。本水质指标依照GB18918-2002，生活污水排放标准的一级B标准；其中模拟废水中的氮素的含量0.2g/L。

表1各组固定化微生物的具体配比

配比编号	氨化细菌	硝化细菌	好氧反硝化细菌
				1	1	0	0
2	0	1	0
				3	0	0	1
4	0	1	1
				5	1	0	1
6	1	1	0
				7	1	1	1
8	2	1	1
				9	1	2	1
10	1	1	2
				11	1	2	2
12	2	1	2
				13	2	2	1

该实验在250mL锥形瓶中进行，将其放入恒温震荡培养箱内，在35℃，160rpm的条件下培养三天，三天后取样，测定氮的有关指标，如图1所示，评价指标为：总氮、氨氮、硝氮。图中可以看出第8组，即氨化细菌：硝化细菌：好氧反硝化细菌＝2∶1∶1时，总氮，氨氮，硝氮三个指标的浓度均为最低。

制作最佳配比的固定化微生物菌剂，将复合菌剂置入100mL模拟废水系统中，在35℃，160rpm的条件下进行培养，检测复合菌剂对氮素的去除情况，采样周期为24h，采样后立即测定N的相关指标(总氮、氨氮、硝氮)。实验系统进行至氮素去除率达90％以上，具体检测结果如表2所示。

表2最佳配比的复合菌剂对模拟废水的去除率

处理时间

1d

2d

3d

4d

5d

6d

7d

8d

总氮(去除率)

16.10％

37.40％

52.81％

75.95％

85.10％

89.25％

92.10％

92.90％

氨氮(去除率)

21.07％

45.00％

59.98％

78.73％

86.53％

94.20％

92.53％

92.60％

硝氮(去除率)

18.60％

37.00％

46.60％

80.20％

85.20％

89.20％

95.80％

97.20％

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种固定化微生物复合菌剂，其特征在于，所述固定化微生物复合菌剂包括氨化细菌、硝化细菌和好氧反硝化细菌，氨化细菌、硝化细菌和好氧反硝化细菌的质量配比为：氨化细菌：硝化细菌：好氧反硝化细菌＝2：(1～2)：(1～2)。

2.根据权利要求1所述的固定化微生物复合菌剂，其特征在于，所述质量配比为：氨化细菌：硝化细菌：好氧反硝化细菌＝2：1：1。

3.一种固定化微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S01：制备氨化菌株湿菌体、硝化菌株湿菌体和好氧反硝化菌株湿菌体；

S02：分别取三种湿菌体与聚乙烯醇和海藻酸钠的混合溶液混合，得到三种混合体；

S03：将三种混合体通过注射器分别滴入交联剂中，经充分交联后，用无菌水清洗小球过滤后即得氨化细菌固定化小球、硝化细菌固定化小球和好氧反硝化细菌固定化小球；

S04：将得到的氨化细菌固定化小球、硝化细菌固定化小球和好氧反硝化细菌固定化小球按照质量比例2：(1～2)：(1～2)混合，得到所述固定化微生物复合菌剂。

4.根据权利要求3所述的固定化微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述S01步骤具体为：

S01.1：将底泥样品加入盛有无菌水的三角瓶中，然后在三角瓶中加入玻璃球；将三角瓶放在恒温震荡箱中培养，得到菌悬液；

S01.2：取菌悬液，分别制得氨化菌株、硝化菌株和好氧反硝化菌株；

S01.3：将氨化菌株、硝化菌株和好氧反硝化菌株在富集培养基中分别培养至对数期，离心后得到三种湿菌体。

5.根据权利要求4所述的固定化微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述S01.1步骤中恒温震荡箱的温度为30℃，恒温震荡箱的转速为160rpm，在恒温震荡箱中培养时间为24h。

6.根据权利要求3所述的固定化微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述S02步骤中混合溶液的聚乙烯醇和海藻酸钠质量比为10:3。

7.根据权利要求3所述的固定化微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述S03步骤中交联剂为质量浓度为2％的饱和硼酸-氯化钙溶液。

8.根据权利要求3所述的固定化微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述S03步骤中得到氨化细菌固定化小球、硝化细菌固定化小球和好氧反硝化细菌固定化小球直径均为2.0～3.5mm。

9.根据权利要求1所述的固定化微生物复合菌剂在降解有机废水或者生活污水中的氮的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述固定化微生物复合菌剂为权利要求1所述的固定化微生物复合菌剂；所述固定化微生物复合菌剂的用量为：设废水中氮素的含量为A g/L，所述固定化微生物复合菌剂中的氨化细菌固定化小球为10*A份。