CN106519037A - 可活化的嵌合受体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可活化的嵌合受体。本发明的可活化的嵌合受体只有在病理性组织特异性表达或高表达的蛋白酶存在的条件下才能够靶向相应的抗原，实现病理性组织或细胞的杀伤作用；而在蛋白酶不存在的条件下不发挥作用，为减免on-target-off-tumor等问题提供了可行的解决方案。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗领域，更具体地，本发明涉及可活化的嵌合受体，其制备方法及其应用。
背景技术
免疫效应细胞在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。基于免疫效应细胞的过继性免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的上述缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意[Grupp SA，et al.Adoptive cellular therapy.Curr Top Microbiol Immunol.，2011；344:149-72.]。近年来，根据细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(T Cell Receptor，TCR)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的抗体的scFv与T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimeric antigenreceptor，CAR；现也称为嵌合受体(Chimeric receptor，CR))，并将其通过如慢病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CAR T淋巴细胞能够以主要组织兼容性复合物(Major Histocompatibility Complex，MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。CAR T淋巴细胞是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略[Schmitz M，et al.Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of Cancer.JBiomed Biotechnol，2010，doi:10.1155/2010/956304.]。此外，CAR修饰的NK细胞(Klingemann H.Challenges of cancer therapy with natural killer cells.Cytotherapy.2014Dec 18.pii：S 1465-3249(14)00791-9)或者NKT细胞也在临床前研究中展示了良好的抗肿瘤活性(Heczey A1，Liu D1，Tian G2，CourtneyAN1，Wei J1，Marinova E1，Gao X1，Guo L1，Yvon E3，Hicks J2，Liu H4，Dotti G5，Metelitsa LS6.Invariant NKT cells with chimeric antigen receptorprovide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.Blood.2014；124(18):2824-33)。
嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ或FcεRIγ及共刺激信号分子CD28、CD27、CD137、CD134等的胞内信号区。
胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM。该种CAR T可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应[Zhang T.et al.Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemicT-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxicpathways，Can Res 2007，67(22)：11029-11036.]。
随后发展的第二代CAR T淋巴细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-/CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR T在体内的存活周期和抗肿瘤效果[Dotti G.et al.CD28 costimulation improves expansion andpersistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients.J Clin Invest，2011，121(5)：1822-1826.]。
近些年发展的第三代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CAR T在体内的存活周期和其抗肿瘤效果[Carpenito C.，et al.Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted humanT cells containing CD28and CD137domains.PNAS，2009，106(9)：3360–3365.]。
尽管CAR T淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但其较高风险亦需要考虑。比如，由于某些/种正常组织低表达CAR所能识别的特异性抗原可能造成CAR T淋巴细胞对表达抗原的正常组织的损伤。如，针对肾细胞癌患者肿瘤细胞上表达的抗原碳酸酐酶IX(CAIX)是第一个用于临床的CART淋巴细胞过继治疗的案例，也是第一个报道含CAR细胞的脱靶效应的案例。病人在多次输入CAR T淋巴细胞后出现2-4级肝毒性。分析原因为肝胆管上皮细胞低表达CAIX，原临床试验被迫中断同时排除了病人治疗效果的任何评价[Stoter G.et al.Treatment of metastatic renal cell carcinoma withautologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX：first clinical experience.J clin oncol，2006，24(13)：e20-e22.；Ngo MC.，et al.Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer.HumanMolecular Genetics，2011，R1-R7]。另外，CAR中过多的共刺激信号会降低效应细胞激活所需的阈值，使得基因修饰的T淋巴细胞在低水平抗原或没有抗原触发的条件下也可能会被活化，导致大量细胞因子的释放以致可能引发所谓的“细胞因子风暴”。这种信号外漏(signal leakage)会导致脱靶细胞毒性，从而产生非特异性的组织损伤。例如，在采用针对Her2的第三代CAR临床治疗一个具有肝和肺转移的晚期结肠癌患者的过程中由于正常肺组织中低表达Her2而引发所谓的“细胞因子风暴”致病人猝死[Morgan RA.，et al.Report of a serious adverse event following the administration of T cellstransduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2.MolecularTherapy，2010，18(4)：843-851.]。
因此，需要找到合适的方法，来使基于CAR的免疫效应细胞能够更为精准地作用于肿瘤，避免应用于肿瘤免疫治疗时存在的较高风险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可活化的嵌合受体，其制备方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种可活化的嵌合受体(Activatable ChimericReceptor，ACR)，其包括：
嵌合受体(Chimeric Receptor，CR)，其在活化状态下能靶向(结合)病理性组织高表达的抗原；
封闭元件(Blocking element，BE)，其能抑制嵌合受体与所述病理性组织高表达的抗原结合；和
可剪切元件(Cleavable element，CE)，其位于嵌合受体与封闭元件之间。
在一个优选例中，所述的嵌合受体包含顺序连接的：胞外的抗原结合区、跨膜区和胞内信号区；所述的胞内信号区选自：CD3ζ，FcεRIγ，CD27，CD28，CD137，CD134，CD40的胞内信号区序列或Myd88，或其组合。
在另一优选例中，所述的胞外的抗原结合区是特异性结合所述病理性组织高表达的抗原的抗体。
在另一优选例中，所述的特异性结合所述病理性组织高表达的抗原的抗体可以是：单链抗体(scFV)，单克隆抗体，单结构域抗体，Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab’)2片段和其衍生物，或其它形式的抗体。
在另一优选例中，所述的特异性结合所述病理性组织高表达的抗原的抗体选自(但不限于)：单链抗体或单结构域抗体。
在另一优选例中，嵌合受体在封闭元件不存在的情况下能有效识别所述病理性组织高表达的抗原，封闭元件可以干扰或竞争嵌合受体与所述病理性组织高表达的抗原的结合。
在另一优选例中，所述的可活化的嵌合受体按照从氨基端到羧基端的顺序，依次包括：封闭元件，可剪切元件，嵌合受体。
在另一优选例中，所述的嵌合受体、封闭元件、可剪切元件之间，还包括连接肽。
在另一优选例中，所述的可活化的嵌合受体，其中含有第一连接多肽(LP1)和第二连接多肽(LP2)；其中可活化的嵌合受体按照从氨基端到羧基端的顺序，依次包括：封闭元件，第一连接多肽，可剪切元件，第二连接多肽，嵌合受体。
在另一优选例中，所述的封闭元件选自但不限于：直接与所述的嵌合受体结合的多肽；或从空间上阻碍所述的嵌合受体与抗原结合的多肽。
在另一优选例中，所述的封闭元件是2～100aa(如10aa，20aa，30aa，40aa，50aa，60aa，70aa，80aa)；较佳地是2～40aa的多肽。
在另一优选例中，所述的可剪切元件是能被病理性组织特异性表达或高表达的蛋白酶所剪切、还原或分解的元件，所述蛋白酶与所述病理性组织高表达的抗原共定位于同一病理性组织。
在另一优选例中，所述的病理性组织包括但不限于：肿瘤，自身免疫性疾病组织，受病毒(如HIV病毒)感染的组织。
在另一优选例中，所述的病理性组织是肿瘤，所述的病理性组织特异性表达或高表达的蛋白酶包括(但不限于)：尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)，legumain蛋白酶或matriptase(MT-SP1)。
在另一优选例中，所述的病理性组织特异性表达或高表达的蛋白酶是尿激酶型纤溶酶原激活物或matriptase，所述的可剪切元件是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，所述的病理性组织高表达的抗原包括但不限于：GPC3，EGFR，HER2，EphA2，Claudin18.1，Claudin18.2，Claudin 6，GD2，EpCAM，mesothelin，CD19，CD20或ASGPR1。
在另一优选例中，所述的病理性组织高表达的抗原是GPC3，所述的封闭元件是GC33抗体的结合多肽；较佳地，所述的封闭元件是SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，当所述的病理性组织高表达的抗原是GPC3时，该病理性组织为肿瘤，包括：肝癌，黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤。
在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的可活化的嵌合受体。
在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包含编码所述的可活化的嵌合受体的核酸。
在另一优选例中，所述的表达载体来源于慢病毒质粒pWPT。
在本发明的另一方面，提供一种病毒，所述的病毒包含所述载体。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的可活化的嵌合受体、或编码其的核酸、或包含该核酸的表达载体或病毒的用途，用于制备靶向病理性组织的嵌合受体免疫效应细胞。
在本发明的另一方面，提供一种嵌合受体免疫效应细胞，其转导有编码前面任一所述的可活化的嵌合受体的核酸，或前面所述的表达载体或所述的病毒；或其表面表达前面任一所述的可活化的嵌合受体。
在另一优选例中，所述的免疫效应细胞包括：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞，Treg细胞。
在本发明的另一方面，提供所述的嵌合受体免疫效应细胞的用途，用于制备靶向病理性组织的药物，该病理性组织高表达所述嵌合受体能结合的抗原。
在一个优选例中，所述的病理性组织是肿瘤，所述的靶向病理性组织的药物是抑制肿瘤的药物。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包括：前面所述的嵌合受体免疫效应细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、可活化的嵌合受体ACR的结构示意图。
按照N端→C端依次为：Sp：分泌信号肽，BE：封闭元件，LP1：接头1；CE1：可剪切元件；LP2：接头2，Ab：抗原结合区；LP3：接头3；TM：跨膜区；SD：胞内信号区。
图2、GC33-28BBZ-ACR的示意图。
按照N端→C端的方向，图中各个模块依次为CD8分泌信号，BE(封闭元件)，LP1，CE(可剪切元件，UP1的酶切底物)，LP2，CR(GC33-28BBZ)，F2A，eGFP。
图3、FACS分析T细胞的GC33-28BBZ-ACR阳性率。
通过GFP的阳性率作为指示慢病毒感染后T细胞的GC33-28BBZ-ACR阳性率。
图4、体外毒性实验。将肝癌细胞系Huh-7作为靶细胞，效应细胞为体外培养11天的表达了GC33-28BBZ-ACR的T细胞，效靶比分别为3:1，1:1和1:3，靶细胞数量为10000个/孔，根据不同效靶比对应效应细胞。分别加入uPA与MTSP1，各设置一个低剂量组，一个高剂量组及空白组。各组均设5个复孔，取5个复孔的平均值。检测时间为第18h。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，揭示了一种基于嵌合抗原受体(CAR)技术的可活化的嵌合受体，该可活化的嵌合受体只有在病理性组织特异性表达或高表达的蛋白酶存在的条件下才能够靶向相应的抗原，实现病理性组织或细胞的杀伤作用；而在蛋白酶不存在的条件下不发挥作用。本发明为避免on-target-off-tumor的提供了可行的解决方案。
如本文所用，所述的“嵌合受体”与“嵌合抗原受体”可互换使用。
如本发明所用，所述的“病理性组织高表达的抗原”是指活化的嵌合受体所靶向的抗原，该抗原在病理性组织或细胞中高表达。在本发明中，该“病理性组织高表达的抗原”也可能在病理性组织或细胞以外的正常组织或细胞中表达。较佳地，该“病理性组织高表达的抗原”是肿瘤相关抗原，例如选自(但不限于)：GPC3，EGFR，HER2，EphA2，Claudin18.1，Claudin18.2，Claudin 6，GD2，EpCAM，mesothelin，CD19，CD20或ASGPR1。
如本发明所用，所述的“病理性组织特异性表达或高表达的蛋白酶”是指仅在病理性组织或细胞中表达，或在病理性组织或细胞中高表达的蛋白(水解)酶，其能够对其特异性底物进行水解。
如本发明所用，所述的“封闭元件”是指能够阻断所述的嵌合受体与其相应的抗原结合的多肽，其通过直接与所述的嵌合受体结合或从空间上阻碍所述的嵌合受体与抗原结合等方式来发挥阻断嵌合受体与靶位点结合的作用。
如本发明所用，所述的“可剪切元件”是一个位于嵌合受体与封闭元件之间的多肽，其是所述的“病理性组织特异性表达或高表达的蛋白酶”的底物，当存在所述的蛋白酶时，该“可剪切元件”可被剪切、还原或分解，从而使得封闭元件不再阻断所述的嵌合受体与其相应的抗原发生结合。
如本发明所用，所述的“病理性组织”包括(但不限于)：肿瘤，自身免疫性疾病组织，受病毒(如HIV病毒)感染的组织等。
本发明中，所述的病理性组织可以是机体内的各种不利于健康的有害组织或病灶，有必要从机体内去除。所述的病理性靶组织包括肿瘤。任何本领域已知的肿瘤均可包含在本发明中，只要该肿瘤能够表达正常组织中低表达的肿瘤相关抗原。例如，所述的肿瘤包括(但不限于)：肝癌、肺癌、胶质瘤、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、脑肿瘤、卵巢癌、骨肿瘤、结肠癌、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、肠肿瘤、肾肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、睾丸肿瘤、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经系统肿瘤、食管癌、胸腺间皮瘤、胰腺癌、白血病、头颈部肿瘤、宫颈癌、皮肤癌、黑色素瘤、阴道上皮癌、胆囊癌、恶性纤维组织细胞瘤。例如，所述的肿瘤相关抗原包括(但不限于)：GPC3，EGFR，HER2，EphA2，Claudin18.1，Claudin18.2，Claudin 6，GD2，EpCAM，mesothelin，CD19，CD20，ASGPR1，EGFRvIII，de4EGFR，CD19，CD33，IL13R，LMP1，PLAC1，NY-ESO-1，MAGE4，MUC1，MUC16，LeY，CEA，CAIX(碳酸酐酶IX)，CD123。
术语“嵌合受体疫效应细胞”是本领域公知的，其是利用基因改造技术表达抗原(如肿瘤抗原)特异性嵌合受体的免疫效应细胞，能靶向性发挥杀伤作用。所述的免疫效应细胞例如包括T细胞，NK细胞，NKT细胞，调节性T细胞(Regulatory cell，简称Treg)。常规的制备“嵌合受体免疫效应细胞”的方法是本领域技术人员已知的，包括让其表达胞内共刺激细胞分子胞内结构域，例如CD28(较佳地包括CD28a，CD28b)，CD137，CD27，CD3ζ(较佳地为CD3ζ细胞内域)，CD8，CD19，CD134，CD20，FcεRIγ中的一种或多种。通过它们与相应配体结合，激活免疫效应细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。
鉴于肿瘤绝对特异的靶点少之又少，因此大多数的CAR修饰的免疫细胞(如CAR T细胞)针对的抗原(如CD19，CD20，Her2，EGFR，EpCAM等)或多或少地在正常组织中表达，因此难以避免地出现on-target-off-tumor的副作用。如何减少或降低这种On-target-off-tumor的作用变得非常重要。本发明人广泛地比较了肿瘤组织的微环境与正常组织的微环境的差异，首次基于一些蛋白水解酶如uPA、MT-sp1、Legumain protease等在肿瘤组织中高表达而在正常组织不表达或低表达的特点，利用这些水解酶的特异性，改造了嵌合受体修饰的免疫细胞，所获得的免疫细胞只有在这些水解酶作用后才能更有效地发挥抗肿瘤功能，从而可有效地提高免疫细胞的安全性。
因此，本发明提供一种可活化的嵌合受体(Activatable Chimeric Receptor，ACR)，它包括嵌合受体(Chimeric Receptor，CR)、可剪切的元件(Cleavableelement，CE)以及封闭元件(Blocking element，BE)连接，三者之间可以藉由连接多肽进行连接。其中CE抗原被剪切、还原、光学分解或其他修饰后，ACRs可以展示出活化的构象，使得CR可以更容易与靶点结合。
作为本发明的优选方式，本发明的可活化的嵌合受体ACR的一种结构示意图见图1。从左到右排列，即从蛋白质的N端到C端排列组成的一个跨膜受体即可活化得嵌合受体ACR的示意图。在未活化状态下，BE会与Ab区结合，或在空间上阻碍Ab与靶抗原的结合；而一旦CE1被蛋白酶等剪切，那么Ab就可以与靶抗原结合。
所述的封闭元件可以是任何可通过直接与所述的嵌合受体结合或从空间上阻碍所述的嵌合受体与抗原结合等方式来发挥阻断嵌合受体与靶位点结合的作用的多肽。可以根据嵌合受体的抗原结合区的类型来选择该封闭元件。例如，所述的抗原结合区是一种抗体，则该封闭元件可以是该抗体的结合多肽。在本发明的具体实施例中，嵌合受体的抗原结合区采用抗GPC3的抗体GC33，而应用其结合多肽(NSQQATPKDNEISTFH)作为封闭元件。
所述的可剪切元件是可以被病理性组织特异性表达或高表达的蛋白酶剪切、还原或分解的底物。可以根据所对应的适应症，来选择其中特异性表达或高表达的蛋白酶，其底物即可作为可剪切元件。所述的蛋白酶的表达特异性越高，则越是优选的。在本发明的优选方式中，适应症为肿瘤，肿瘤组织的微环境与正常组织的微环境存在不同，其中的蛋白水解酶如uPA，MT-sp1，Legumain protease等在肿瘤组织中高表达，而在正常组织不表达或低表达，因此本发明人利用这些水解酶的特异性，来改造嵌合受体修饰的免疫细胞，该免疫细胞只有在这些水解酶作用后才能更有效地发挥抗肿瘤功能，从而有效地提高CAR修饰的免疫细胞的安全性。在本发明的具体实施例中，采用uPA和MT-SP1蛋白酶的底物多肽LSGRSDNH作为可剪切元件。
所述的嵌合受体、封闭元件、可剪切元件之间，还可包括连接肽。所述的连接肽没有特别的限制，可以是任何能够提供所述的嵌合受体、封闭元件、可剪切元件之间柔性连接，不影响各元件自身的功能的任何多肽。较佳地，所述的连接子包括2-40个氨基酸；较佳地为3-30个氨基酸，如5、8、10、15、20、25个氨基酸。
本发明也包括编码所述可活化的嵌合受体的核酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。
本发明还提供了包含上述可活化的嵌合受体的核酸的载体。在一个具体实施方案中，本发明使用的载体是一种慢病毒质粒载体pWPT。应理解，其它表达载体也是可用的。
本发明还包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其它可用于将外源基因转导入免疫效应细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。
本发明还提供了基因修饰的免疫效应细胞，其被转导有编码所述的可活化的嵌合受体的核酸或被转导有上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。近期Amaxa公司研发的Nucleofector核转染仪能够直接将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子(Sleeping Beauty system)或PiggyBac转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提高，将nucleofector转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道[Davies JK.，et al.Combining CD19redirection and alloanergization to generate tumor-specifichuman T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.Cancer Res，2010，70(10):OF1-10.]，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合受体(本发明中为可活化的嵌合受体)基因修饰的免疫效应细胞的转导方法是基于病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养免疫效应细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因免疫效应细胞表面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明，本发明的免疫效应细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果(亦称细胞毒性)。因此本发明的编码嵌合受体蛋白的核酸，包含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因免疫效应细胞可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。
本发明所述的免疫细胞还可以携带外源的细胞因子的编码序列；所述的细胞因子包括但不限于：IL-12，IL-15或IL-21等。这些细胞因子具有免疫调节或抗肿瘤的活性，能增强效应T细胞及活化的NK细胞的功能，或直接发挥抗肿瘤作用。因此，本领域技术人员可以理解，这些细胞因子的运用有助于所述的免疫细胞更好地发挥作用。
本发明所述的免疫细胞还可以表达除了上述嵌合受体以外的另一种嵌合受体，该受体不含有CD3ζ，但含有CD28的胞内信号结构域、CD137的胞内信号结构域或者这两者的组合。
本发明所述的免疫细胞还可以表达趋化因子受体；所述的趋化因子受体包括但不限于CCR2。本领域技术人员可以理解，所述的CCR2趋化因子受体可以使得体内的CCR2与之竞争性结合，对于阻断肿瘤的转移是有利的。
本发明所述的免疫细胞还可以表达能降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白。本领域技术人员可以理解，竞争性阻断PD-L1与其受体PD-1的相互作用，有利于恢复抗肿瘤T细胞反应，从而抑制肿瘤生长。
本发明所述的免疫细胞还可以表达安全开关；较佳地，所述的安全开关包括：iCaspase-9，Truancated EGFR或RQR8。
本发明的嵌合受体免疫效应细胞可以应用于制备药物组合物或诊断试剂。所述的组合物除了包括有效量的所述免疫细胞，还可包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等。
本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、抗GPC3第三代嵌合抗原受体的构建
利用之前构建的抗磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)第三代嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，该CAR中所用的单链抗体源自GC33抗体，该CAR T的构建参见申请号为CN201310164725.X中，其GPC3-28BBZ被应用于本实施例中，也称为GC33-28BBZ。
本发明人将GC33抗体的结合多肽(NSQQATPKDNEISTFH(SEQ ID NO:1))作为BE元件，而uPA和MT-SP1蛋白酶的底物多肽LSGRSDNH(SEQ IDNO:2)作为CE元件。另外通过由来自口蹄疫病毒(food-and-mouth diseasevirus，FMDV)的核糖体跳跃序列(ribosomal skipping sequence 2A)(简称F2A)将eGFP连接于ACR的C端，实现eGFP与ACR的共表达，从而通过eGFP的表达情况来间接说明ACR的表达。
(1)Sp+BE+LP1+CE+LP2的片段的获得
设计如表1的引物。
表1
其中Sp+BE+LP1+CE+LP2的片段采用如表1的引物，通过Overlap PCR获得，扩增条件为：
预变性：94℃，4min；
如下25个循环：变性：94℃，30s，
退火：50℃，30s，
延伸：68℃，20s；
然后，68℃再延伸10min。
随后采用常规方法对PCR扩增产物进行胶回收，获得Sp+BE+LP1+CE+LP2相互连接的DNA片段。
(2)LP2-GC33-28BBZ片段的获得
设计如2的引物。
表2
取GC33-28BBZ质粒(该质粒参见CN201310164725.X专利)1微升(100ng)为模板，分别将GPC3scfv-F、3z-F2A-R作为上下游引物，50微升体系，进行PCR扩增，获得的PCR产物进行切胶回收，从而获得LP2-GC33-28BBZ片段。
(3)F2A-EGFP的获得
设计如3的引物。
表3
取GC33-28BBZ质粒1微升(100ng)为模板，分别将F2A-EGFP-F、pwpt-EGFP-R作为上下游引物，进行PCR扩增，获得的PCR产物进行切胶回收，从而得到F2A-EGFP。
(4)慢病毒质粒pWPT-GC33-28BBZ-ACR的获得
将上述(1)～(3)制备获得的三段片段进行overlap PCR，具体地讲三段片段，按照等摩尔比进行混合，按上述步骤(1)所述进行overlap PCR，上下游引物是CD8sp-F与EGFP-R。获得的PCR产物进行切胶回收。
采用限制性内切酶对MluI及SalI双酶切后连入慢病毒质粒pWPT载体的相应位点内。
获得的重组质粒转化大肠杆菌Top10感受态细胞，培养12h左右进行挑克隆验证。选择包含有重组质粒的克隆送测序。选择序列正确的克隆进行病毒制备和包装。
获得的载体命名为pWPT-GC33-28BBZ-ACR。
实施例3、CAR-T的制备
1、GC33-28BBZ-ACR的慢病毒的包装
以6×106的密度接种培养至第6～10代的HEK-293T细胞(ATCC：CRL-11268)于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜准备用于转染。培养基为含10％胎牛血清(购自gibco公司)的DMEM(购自gibco公司)。
转染的步骤如下：
(1)将10μg目的基因质粒pWPT-GC33-28BBZ-ACR，分别与6.5μg包装质粒PAX2：和3.5μg包膜质粒pMD2.G，溶入800μL的无血清DMEM培养液中，混匀。
(2)将60μl PEI(聚乙烯亚胺，购自Polysciences公司，配成1μg/μL浓度的工作液)，加入上述带有质粒的800μL的无血清DMEM培养液中，涡旋混匀，室温静置孵育25min。
(3)将转染复合物800μL加入待转染HEK-293T细胞中，6-8h小时后，用10％FBS的DMEM培基给转染的293T细胞换液。
(4)在转染后约24h，观察转染效率(即呈绿色荧光的细胞比例)。在转染72h后，使用0.45μm滤器(购自Millipore公司)过滤收集病毒，超速离心(Beckman Optima L-100XP超速离心机28000rpm，4℃离心2小时)，浓缩病毒。离心所得沉淀用1/30原液体积的AIM-V培养液(购自Gibco公司)进行重悬，以100μL/管分装冻存于-80℃，用以感染T淋巴细胞。同时，将获得的浓缩病毒进行滴定。
2、GC33-28BBZ-ACR的感染
由健康人外周血通过密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞(上海市血液中心提供)。外周血单个核细胞通过CD4+/CD8+细胞磁珠(购自Stem CellTechnologies)负性分选方法获得CD4+与CD8+阳性的原代人T淋巴细胞。分选后的T细胞进行流式细胞术检测其纯度，以目标细胞的阳性率≥95％为宜进行下一步操作。以1×106/mL密度加入AIM-V淋巴细胞培养基液(购自Gibco公司，含有2％人AB serum)培养并以细胞：磁珠比例为1:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠(Invitrogen公司)和终浓度300U/mL的重组人IL-2(购自上海华新生物高技术有限公司)刺激培养24h。感染前，将CD4+CD8+T淋巴细胞按照1:1的比例混合，然后以MOI≈5-10将上述病毒浓缩液与待感染T细胞混合，同时加入终浓度为6μg/mL的polybrene。感染后的细胞，隔天换液，换不含有病毒的培基。每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度300U/mL的重组人IL-2。
感染后的原代T细胞在第9-11天(即第一轮扩增周期结束)时，通过流式细胞术检测嵌合抗原受体GC33-28BBZ-ACR的表达，由于eGFP与GC33-28BBZ-ACR共表达，检测eGFP的阳性细胞即为表达嵌合抗原受体的阳性细胞，并以未感染的T淋巴细胞作为阴性对照。
结果如图3，通过GFP的阳性率作为指示慢病毒感染后T细胞的GC33-28BBZ-ACR阳性率，可见阳性率为61.0％。
实施例4、外源重组uPA促进BE-GPC3-CAR T的活化
体外毒性实验使用的材料如下：
将肝癌细胞系Huh-7作为靶细胞，效应细胞为体外培养11天的表达了GC33-28BBZ-ACR的T细胞(阳性率61％)，效靶比分别为3:1，1:1和1:3，靶细胞数量为10000个/孔，根据不同效靶比对应效应细胞。分别加入uPA与MTSP1，各设置一个低剂量组(uPA：0.08μg/mL；MT-SP1：0.04μg/mL)，一个高剂量组(uPA：0.4μg/mL；MT-SP1：0.2μg/mL)及空白组(uPA：0μg/mL；MT-SP1：0μg/mL)。各组均设5个复孔，取5个复孔的平均值。检测时间为第18h。
其中各实验组和各对照组如下：
实验组(空白组)：靶细胞Huh-7+GC33-28BBZ-ACR T细胞+不同浓度的酶，
对照组1：靶细胞最大释放LDH+不同浓度的酶，
对照组2：靶细胞自发释放LDH+不同浓度的酶，
对照组3：效应细胞自发释放LDH+不同浓度的酶。
检测方法：采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行检测。
细胞毒性计算公式为：
从图4可以看出，GC33-28BBZ-ACR T细胞(感染了GC33-28BBZ-ACR的T细胞)的抗肿瘤活性较低，但在uPA或者MT-SP1的作用下均能够有效地活化，从而杀伤肿瘤细胞。
上述结果表明，本发明的设计是合理的，那就是通过封闭元件的作用确实能使T细胞的杀伤作用减弱；但是在肿瘤局部环境中如果有足够量的uPA或者MT-SP1等相应蛋白酶的作用ACR可得到激活并杀伤肿瘤细胞，从而起到局部抗肿瘤活性，减少对正常组织的损伤。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (22)
1.一种可活化的嵌合受体其包括：
嵌合受体，其在活化状态下能靶向病理性组织高表达的抗原；
封闭元件，其能抑制嵌合受体与所述病理性组织高表达的抗原结合；和
可剪切元件，其位于嵌合受体与封闭元件之间。
2.如权利要求1所述的可活化的嵌合受体，其特征在于，所述的嵌合受体包含顺序连接的：胞外的抗原结合区、跨膜区和胞内信号区；所述的胞内信号区选自：CD3ζ，FcεRIγ，CD27，CD28，CD137，CD134，CD40的胞内信号区序列或Myd88，或其组合。
3.如权利要求2所述的可活化的嵌合受体，其特征在于，所述的胞外的抗原结合区是特异性结合所述病理性组织高表达的抗原的抗体。
4.如权利要求3所述的可活化的嵌合受体，其特征在于，所述的特异性结合所述病理性组织高表达的抗原的抗体选自：单链抗体或单结构域抗体。
5.如权利要求1所述的可活化的嵌合受体，其特征在于，所述的可活化的嵌合受体按照从氨基端到羧基端的顺序，依次包括：封闭元件，可剪切元件，嵌合受体。
6.如权利要求1所述的可活化的嵌合受体，其特征在于，所述的嵌合受体、封闭元件、可剪切元件之间，还包括连接肽。
7.如权利要求1所述的可活化的嵌合受体，其特征在于，所述的封闭元件选自：
直接与所述的嵌合受体结合的多肽；或
从空间上阻碍所述的嵌合受体与抗原结合的多肽。
8.如权利要求1所述的可活化的嵌合受体，其特征在于，所述的可剪切元件是能被病理性组织特异性表达或高表达的蛋白酶所剪切、还原或分解的元件，所述蛋白酶与所述病理性组织高表达的抗原共定位于同一病理性组织。
9.如权利要求8所述的可活化的嵌合受体，其特征在于，所述的病理性组织包括：肿瘤，自身免疫性疾病组织，受病毒感染的组织。
10.如权利要求9所述的可活化的嵌合受体，其特征在于，所述的病理性组织是肿瘤，所述的病理性组织特异性表达或高表达的蛋白酶包括：尿激酶型纤溶酶原激活物，legumain蛋白酶或matriptase。
11.如权利要求10所述的可活化的嵌合受体，其特征在于，所述的病理性组织特异性表达或高表达的蛋白酶是尿激酶型纤溶酶原激活物或matriptase，所述的可剪切元件是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。
12.如权利要求9所述的可活化的嵌合受体，其特征在于，所述的病理性组织高表达的抗原包括：GPC3，EGFR，HER2，EphA2，Claudin18.1，Claudin18.2，Claudin 6，GD2，EpCAM，mesothelin，CD19，CD20或ASGPR1。
13.如权利要求12所述的可活化的嵌合受体，其特征在于，所述的病理性组织高表达的抗原是GPC3，所述的封闭元件是GC33抗体的结合多肽；较佳地，所述的封闭元件是SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。
14.一种多核苷酸，其编码权利要求1-13任一所述的可活化的嵌合受体。
15.一种表达载体，其包含编码权利要求14所述的可活化的嵌合受体的核酸。
16.一种病毒，其特征在于，所述的病毒包含权利要求15所述载体。
17.权利要求1-13任一所述的可活化的嵌合受体、或编码其的核酸、或包含该核酸的表达载体或病毒的用途，用于制备靶向病理性组织的嵌合受体免疫效应细胞。
18.一种嵌合受体免疫效应细胞，其转导有编码权利要求1-13任一所述的可活化的嵌合受体的核酸，或权利要求15所述的表达载体或权利要求16所述的病毒；或其表面表达权利要求1-13任一所述的可活化的嵌合受体。
19.如权利要求18所述的嵌合受体免疫效应细胞，其特征在于，所述的免疫效应细胞包括：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞，Treg细胞。
20.权利要求18或19所述的嵌合受体免疫效应细胞的用途，用于制备靶向病理性组织的药物，该病理性组织高表达所述嵌合受体能结合的抗原。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述的病理性组织是肿瘤，所述的靶向病理性组织的药物是抑制肿瘤的药物。
22.一种药物组合物，其特征在于，其包括：权利要求18或19所述的嵌合受体免疫效应细胞。
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