CN106511402A - 一种三氧化二砷的生物转化方法 - Google Patents

Abstract

一种三氧化二砷的生物转化方法，涉及三氧化二砷领域，特别是涉及大型药用真菌对三氧化二砷的富集转化的发酵领域。本发明是将三氧化二砷按一定的比例添加到一种新型基质配方之中，采用药用真菌灵芝、冬虫夏草单菌株或多菌株进行固体培养发酵，将化学品三氧化二砷富集转化为与灵芝和冬虫夏草菌絲体蛋白合成的有机三氧化二砷。经提取、浓缩、制粒、包装等工序制成灵芝或冬虫夏草三氧化二砷颗粒冲剂或灵芝、冬虫夏草复合型三氧化二砷颗粒冲剂。其产品为降低三氧化二砷巨大的毒性，扩大临床应用范围，治疗白血病，肝癌及肺癌等多种癌症，为广大病患者提供方便新的治疗药物。

Description

一种三氧化二砷的生物转化方法

技术领域v

本发明涉及三氧化二砷领域，特别涉及大型药用真菌对三氧化二砷的富集转化的发酵领域。

背景技术

砒霜性状：该品为白色粉末，无臭，无味，能溶于水、乙醇、酸类及碱类。加热则升散而发蒜臭。中文名称三氧化二砷；亚砷酐；砒霜；白砒；亚砷酸酐。

砒霜的毒性很强，进入人体后能破坏某些细胞呼吸酶，使组织细胞不能获得氧气而死亡；还能强烈刺激胃肠粘膜，使粘膜溃烂、出血；亦可破坏血管，发生出血，破坏肝脏，严重的会因呼吸和循环衰竭而死。急性砷中毒症状表现为两种：胃肠型，最为常见。发作时间随量的大小及胃内充盈程度而不同，快的15-30分钟，慢的可4-5小时，一般为1小时左右。开始咽头有灼热感、口渴、恶心，接着出现剧烈腹疼与呕吐，最初吐食物，继之吐黄水，同时剧烈腹泻，初为普通粪便，随后呈米汤样。尿量减少，体温、血压下降，虚脱、昏迷，最后因循环衰竭而死亡。神经型，较为少见。如一次服用大量砷，可引起重度循环衰竭、血压下降、脉搏快弱、呼吸浅表、中枢神经麻痹。其症状为头晕、头疼，肌肉疼痛性痉挛，迅速不省人事，继而呼吸麻痹，1小时内可死亡。三氧化二砷中毒量为0.005-0.05g，致死量为0.1-0.2g。

随着中医理论得到了越来越广泛的共识，中医药中使用砒霜治疗一些肿瘤疾病，特别是急性脊髓白血病的实践也得到了证实。这种血液疾病的患者，由于体内遗传因子突变而产生畸 形蛋白质，白血球的正常产生与死亡就会受到干扰。经美国食品和药物管理局证实，砷的三氧化合物能够使得畸形蛋白质产生自我消灭的能力，从而使白血球的生长恢复正常。一些医生还认为，砷的三氧化合物对病人的副作用小于常规的化学疗法。砷的三氧化合物已经越来越多地被用于治疗诸如淋巴癌、前列腺癌或子宫癌的临床实践。

三氧化二砷是传统中药砒霜中的主要成分。上世纪70年代，哈医大一院中医科和血液科的医生创造性地将三氧化二砷应用于急性早幼粒细胞白血病(M3型)的患者，之后又拓展到经维甲酸治疗复发的M3型病例上，其完全缓解率突破90％以上。在此临床报告的基础上，上海陈竺、王振义等学者首次从分子生物学及基因水平揭示了三氧化二砷诱导早幼粒白血病细胞凋亡的机理。此后，全世界的学者开始将三氧化二砷引入肝癌、淋巴瘤等多种肿瘤的研究领域，取得了一项又一项科学成果。

两年前，武汉市普爱医院肿瘤科冯觉平、孔庆志教授等专家受到三氧化二砷治疗血液病的启发，用肺腺癌耐药细胞系在体外进行对照试验，发现三氧化二砷可改善其耐药状况。课题组还从分子水平上探讨了三氧化二砷对肺腺癌耐药细胞的调节机制，这为扩大三氧化二砷临床应用范围，寻找高放低毒的多药耐药逆转剂，临床合理治疗肺癌，提高疗效提供了新思路、新方法。

三氧化二砷（As203)被血液肿瘤学界公认为20世纪最重要的里程碑式的药物之一。第11届全国血液学会议上，我国学者再次赋予此药物以新的内涵——首次证实二氧化二砷对肿瘤干细胞有击杀和消除作用。这一结果说明，在肿瘤干细胞研究领域，三氧化二砷已成为受关注程度最高的药物，也是目前证据最为充分的能够靶向诱导肿瘤干细胞凋亡的药物。

专利三氧化二砷口服液及其生产方法，申请(专利)号CN200310118274.2，提供了一种三氧化二砷口服液的生产方法，它包括以下步骤：称取三氧化二砷，置于无菌容器中，加入适量无菌注射用水，制成悬浮液；将悬浮液加热搅拌至溶解，再加入适量单糖浆，制得溶液；用枸缘酸调溶液的pH值至3～5，分装灭菌。提供了三氧化二砷口服液。

目前临床用三氧化二砷静脉注射用针剂及上述专利产品口服液，均限于将化学品二氧化二砷药用，其巨大的毒性无法克服而缺乏安全性，用药范围小，使用条件受到限制，无法惠及广大病患人群。

发明内容

本发明是将三氧化二砷按一定的比例添加到一种新型基质配方之中，采用药用真菌灵芝、冬虫夏草单菌株或多菌株进行固体培养发酵，将化学品三氧化二砷富集转化为与灵芝和冬虫夏草菌絲体蛋白合成的有机三氧化二砷。经提取，浓缩，制粒，包装等工序制成灵芝或冬虫夏草三氧化二砷颗粒冲剂或灵芝、冬虫夏草复合型三氧化二砷颗粒冲剂。其产品为降低三氧化二砷巨大的毒性，扩大临床应用范围，治疗白血病，肝癌及肺癌等多种癌症，为广大病患者提供方便新的治疗药物。

本发明的目的是这样实现的：

1.0三氧化二砷药用真菌基质发酵：

1.1药用菌株品种及来源：

品种：灵芝，川紫6号，冬虫夏草，北虫草。

引种来源：四川省农科院土肥所菌种室。

1.2基质配方：

骨粉30kg，麦粒20kg，谷壳48kg，石膏2kg，三氧化二砷10g，水100kg。

1.3发酵培养：

1.3.1配料，按上述基质配方，充分搅拌均匀，待用。

1.3.2装袋：使用耐高温的聚乙烯袋，其规格为350*200，装料松紧适度。

1.3.3灭菌：常规灭菌锅灭菌，时间6小时，温度100℃。

1.3.4无菌接种：采用自制接种箱接种。接种量：采用固体生产种按1∶20的比例，抽出接种棒，填上灵芝菌种或冬虫夏草菌种或这两种菌种的混合菌种，盖上专用泡沫盖。

1.3.5温室培养：培养温度，灵芝菌株，25-30℃，.冬虫夏草22-25℃，培养时间22-28天，温室避光。温室空气流通。

1.3.6发酵基质自然后熟：待基质呈纯白色，置于常温20℃条件下，7至10天。

2.0培养物的提取：

2.1菌丝体自融，温水浸提：按后熟的菌丝体5倍无菌温水，浸泡2小时，过滤，滤渣待用。滤液浓缩，蒸汽压力0.09，真空度0.08，蒸发温度40-50℃，浓缩比重1.2，浸膏待用。

2.2热回流超声波抽提浓缩；将备用的滤渣提取，过滤，浓缩在热回流超声波提取浓缩器完成。工艺参数：罐内压力0.09MPa，夾层压力0.3MPa，压缩空气压力0.6MPa，提取温度50-60℃，提取时间5-6小时，所获得浓浸膏比为1.2.待用。

2.3醇沉、回收：将自融液、浓缩液一并加5倍75％乙醇浸提24小对，过滤，再浓缩至1.2浸膏，待用

2.4混合，制粒，干燥；该工艺采用系列沸腾一步制粒机完成，工艺参数是：蒸汽压力是0.4MPa，温度60℃，所制颗粒水份5％。

2.5包装：采用铝泊复合袋，10g/袋装小袋，10袋/盒规格装盒，得成品

2.7成品：为三氧化二砷灵芝颗粒冲剂，冬虫夏草三氧化二砷颗粒冲剂或灵芝、冬章夏草三氧化二砷复合型颗粒冲剂。

本发明与现有技术相比所具有的有益效果：

1本发明将中药真菌，微量元素科学与与生物发酵工程技术交叉结合，形成一门新的医药科学及技术，为发现和研制中药创药物提供出一条新的途径。

2经灵芝、虫草菌丝体富集转化的三氧化二砷菌蛋白，其产品为降低三氧化二砷巨大的毒性，扩大临床应用范围，治疗白血病，肝癌及肺癌等多种癌症，为广大病患者提供方便新的治疗药物。避免了常规的三氧化二砷静脉注射的药物风险及严格的施治条件。

3经灵芝、虫草菌丝体富集转化的三氧化二砷菌蛋白，不仅充分具有三氧化二砷所具有的药用功能，同时具有灵芝补气安神，冬虫夏草补肺益肾的多种功能，其产品为扩大三氧化二砷临床应用范围，更加合理有效地治疗白血病，肝癌及肺癌等多种癌症患者。

具体实施方式

实施例1灵芝三氧化二砷颗粒冲剂的生产方法

1.0灵芝三氧化二砷药用真菌基质发酵：

1.1药用菌株品种及来源：

品种：灵芝，川紫6号。

引种来源：四川省农科院土肥所菌种室。

1.2基质配方：

骨粉30kg，麦粒20kg，谷壳48kg，石膏2kg，三氧化二砷10g，水100kg。

1.3发酵培养：

1.3.1配料，按上述基质配方，充分搅拌均匀，待用。

1.3.2装袋：使用耐高温的聚乙烯袋，其规格为350*200，装料松紧适度。

1.3.3灭菌：常规灭菌锅灭菌，时间6小时，温度100℃。

1.3.4无菌接种：采用自制接种箱接种。接种量：采用灵芝固体生产种按1∶20的比例，抽出接种棒，填上灵芝菌种，盖上专用泡沫盖。

1.3.5温室培养：培养温度，25-30℃，培养时间22-28天，温室避光。温室空气流通。

1.3.6发酵基质自然后熟：待基质呈纯白色，置于常温20℃条件下，7至10天，完成基质的后熟。

2.0培养物的提取：

2.1菌丝体自融，温水浸提：按后熟的菌丝体5倍无菌温水，浸泡2小时，过滤，滤渣待用。滤液浓缩，蒸汽压力0.09，真空度-0.08.蒸发温度40-50℃，浓缩比重1.2，浸膏待用。

2.2热回流超声波抽提浓缩：将备用的滤渣提取，过滤，浓缩在热回流超声波提取浓缩器完成。工艺参数：罐内压力0.09MPa，夾层压力0.3MPa，压缩空气压力0.6MPa，提取温度50-60℃，提取时间5-6小时，所获得浓浸膏比为1.2，待用。工艺路线；将滤渣投入提取罐，加入5倍量的水。开启提取罐直通夾层蒸治阀门，提取液加热20-30分钟后，用抽滤管将1/3提取液投入浓缩器。关闭提取罐直通夾层蒸汽，开启加热器阀门使液料浓缩。浓缩产生二次蒸汽，通过蒸发上升管送入提取罐，二次蒸汽继续上升，经冷凝器冷凝成冷凝液，回落到提取罐内作新溶剂。提取液经投入浓缩器，浓缩产生的二次蒸汽又送到提取罐，作热原和新溶剂，这样形成的大回流提取，故滤渣的溶质密度与溶剂中溶质密度保持高梯度，滤渣中的溶液质高速度溶出，直到完全溶出。此时提取液停止抽入浓缩器，浓缩出的二次蒸汽转送冷却器，浓缩继续进行，直到浓缩至浸膏密度1.2，药渣从出渣门排出，开直通夾层蒸汽，回收溶剂后，将渣排出。

2.3醇沉，回收；将自融液、浓缩液一并加5倍75％乙醇浸提24小时，过滤，再浓缩至1.2浸膏，待用。

2.4混合，制粒，干燥：该工艺采用系列沸腾一步制粒机完成，工艺路线是：按浓缩浸膏和水溶淀粉，1.2∶1的比例，加进粘结剂水溶淀粉，在沸腾床内建立流态化过程，经持制喷枪雾化喷至流化界面，物料凝聚成粒并干燥，挥发水分由风机排出。工艺参数是：蒸汽压力是0.4MPa，温度60℃，所制颗粒水份5％

2.5包装：采用铝泊复合袋，10g/袋装小袋，40袋，盒规格装盒，得成品

2.7成品：为三氧化二砷灵芝颗粒冲剂

实施例2冬虫夏草三氧化二砷颗粒冲剂生产方法。

1.0冬虫夏草三氧化二砷药用真菌基质发酵：

1.1药用菌株品种及来源：

品种：冬虫夏草，北虫草。

引种来源：四川省农科院土肥所菌种室。

1.2基质配方：

按本发明基质配方配料。

1.3发酵培养：温室培养温度22-25℃。

1.3.1-1.3.3参照实施例1实行。

1.3.1无菌接种：采用自制接种箱接种。接种量：采用冬虫夏草固体生产种按1∶20的比例，抽出接种棒，填上冬虫夏草菌种盖上专用泡沫盖

1.3.5-1.3.6参照实施例1实行。

2.0培养物的提取：

2.1-2.6参照实施例1实行

2.7成品：为冬虫夏草三氧化二砷冬虫夏草颗粒冲剂。

实施例3灵芝、冬虫夏草二氧化二砷复合颗粒冲剂的生产方法

1.0灵芝、冬虫夏草三氧化二砷基质发酵：

1.1药用菌株品种及来源：

品种：灵芝，川紫6号，冬虫夏草，北虫草。

引种来源：四川省农科院土肥所菌种室。

1.2基质配方：

按本发明基质配方配料

1.3发酵培养：温室培养温度24-28℃。

1.3.1-1.3.3参照实施例1实行。

1.3.4无菌接种：采用自制接种箱接种。接种量：采用灵芝、冬虫夏草固体生产种各50％混合均匀后按1∶20的比例，抽出接种棒，填上两种混合菌种，盖上专用泡沫盖。

1.3.5-1.3.6参照实施例1实行。

2.0培养物的提取：

2.1-2.6参照实施例1实行。

2.7成品：为灵芝、冬虫夏草复合型三氧化二砷颗粒冲剂。

Claims (2)

1.一种三氧化二砷的生物转化方法，其特征在于，是将三氧化二砷按一定的比例添加到一种新型基质配方之中，采用药用真菌灵芝、冬虫夏草单菌株或多菌株进行固体培养发酵，将化学品三氧化二砷富集转化为与灵芝和冬虫夏草菌絲体蛋白合成的有机三氧化二砷，经提取，浓缩，制粒，包装等工序制成灵芝或冬虫夏草三氧化二砷颗粒冲剂或灵芝、冬虫夏草复合型三氧化二砷颗粒冲剂；其产品为降低三氧化二砷巨大的毒性，扩大临床应用范围，治疗白血病，肝癌及肺癌等多种癌症，为广大病患者提供方便新的治疗药物。

2.根据权利要求1所述一种三氧化二砷的生物转化方法，其特征在于：基质配方是，骨粉30kg，麦粒20kg，谷壳48kg，石膏2kg，三氧化二砷10g，水100kg。