CN106501337B - 一种金黄色葡萄球菌的电化学检测方法 - Google Patents

一种金黄色葡萄球菌的电化学检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌的电化学检测方法。具体步骤如下：利用模板法制备有序介孔碳纳米材料CMK‑3，并将其进行表面羧基功能化修饰，得到一种羧基功能化的介孔碳纳米材料O‑CMK‑3；利用化学共价结合技术将蛋白分选酶A(Srt A)固定于上述羧基功能化介孔碳纳米材料O‑CMK‑3表面，得到固定化分选酶纳米复合材料O‑CMK‑3‑M；将上述固定化酶纳米复合材料与石墨、石蜡等材料制成碳糊电极，没入不同浓度的金黄色葡萄球菌菌液，采用三电极检测系统检测金黄色葡萄球菌。较现有检测技术方法具有检测时间短、操作方便、可重复利用等优点，具有良好的应用前景。

Description

一种金黄色葡萄球菌的电化学检测方法
技术领域：
本发明设计一种金黄色葡萄球菌的电化学检测方法，属于微生物检测领域。
背景技术：
金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，是人类的一种重要病原菌，能够引起许多严重感染。典型的金黄色葡萄球菌为球形，直径0.8um左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。其营养要求不高，在普通培养基上都生长良好，最适生长温度37℃，最适生长pH7.4且有较高的耐盐性，是一种不利于人体的细菌。
金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受其污染的机会很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大则高达45％，在我国每年由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也屡有报道。
金黄色葡萄球菌的表面蛋白A(Spa)能与免疫球蛋白的Fc部分相连，可使金黄色葡萄球菌进入人体宿主后，不被调理吞噬。菌体中的分选酶A(SrtA)是表面蛋白锚定到菌体细胞壁这一过程的关键酶，它是一种膜结合巯基转肽酶，由206个氨基酸组成，具有催化活性的Cys184位于分选酶特征基序LXTC上。SrtA通过识别革兰氏阳性菌表面蛋白的C-末端分选信号中的LPXTG基序(Leu-Pro-X-Thr-Cly)，使LPXTG结构在苏氨酸和甘氨酸之间的肽键断裂，并且有苏氨酸(T)的羧基基团与细胞壁五甘氨酸交联桥的氨基基团之间形成一个酰胺键，从而使其被锚定到细胞壁的肽聚糖上。
目前，国标中对金葡菌的检测方法包括微生物法和ELISA法。微生物法耗时长，操作繁琐。ELISA方法所耗时间相对较短，但其操作技巧性强，关键点的控制对结果影响大，检出限高达106CFU/mL。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)为国标法之外研究的最成熟的金葡菌检测方法，但是PCR法所需的试剂昂贵，整个检测过程步骤复杂。由于该方法极其敏感，外源性DNA、试验条件控制不当、引物的设计及靶序列的选择等均会影响实验结果。这些技术比传统微生物法快速，比PCR法简单，但是需要贵重仪器，且检出限高，一般为105～106CFU/ml。快速、高灵敏、高特异性的检测技术研究意义重大。
发明内容：
为了解决上述中现有的技术问题，本发明提供了一种金黄色葡萄球菌的检测方法。利用分选酶A(SrtA)能够识别革兰氏阳性菌表面蛋白C-末端分选信号中的LPXTG序列的特点，将分选酶A从菌液中提取、纯化出来，采用共价结合的方法将其固定到羧基功能化的介孔碳纳米材料O-CMK-3表面，制成碳糊电极，利用三电极检测系统检测金葡菌，采用差分脉冲伏安法(DPV)引起电信号发生变化进而推知金黄色葡萄球菌的存在。该电化学检测技术检测金葡菌较现有技术的检测方法具有无需标记、实时检测、检测时间短、操作方便等优点，具有良好的应用前景。
本发明的技术方案由以下部分组成。
1)有序介孔碳材料CMK-3的制备：1.25g蔗糖和0.14g浓硫酸溶解在5.0g水中，往该溶液中加入1g的SBA-15，使混合物在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升温至160℃加热6h；0.75g蔗糖，0.08g浓硫酸溶解在5.0g水中，把上述材料浸入该混合物，使其在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升温至160℃加热6h；将得到的产品在氮气氛中900℃煅烧6h，升温速度2.5℃/min，最后将产品在氢氟酸中浸泡，洗涤、干燥。最终得到有序介孔碳材料CMK-3。
2)羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3的制备：将300mg CMK-3纳米材料浸入到15mL1.75mol/L的过硫酸铵溶液和15mL 2mol/L的硫酸溶液中，40℃下水浴搅拌24h，洗涤、干燥，制得羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3。
3)固定化分选酶介孔碳纳米复合材料O-CMK-3-M的制备：5mg EDC和6mg NHS加入30mL Tris-HCL缓冲液中，取30mg羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3加入Tris-HCL缓冲液中，室温下超声分散30min，取1mL 11.486mg/mL分选酶A加入Tris-HCL缓冲液中，37℃条件下150rpm震荡培养8h，离心取沉淀，制得固定化分选酶介孔碳纳米复合材料。
4)取0.015g固定化分选酶介孔碳纳米复合材料，0.065g石墨，与24uL的液体石蜡研磨均匀，制成碳糊电极，没入金黄色葡萄球菌菌液中检测。检测方法为差分脉冲伏安法(DPV)，条件为：起始点位0.2V，最高点位1.3V，电位增幅0.004V，脉冲宽度为0.06s，脉冲周期为0.02s，静止时间0.5s，灵敏度1.0e-003A/V，检测时间间隔为20min。
本发明采用的羧基功能化CMK-3具有纳米尺度结构，比表面积高、孔体积大等优点；固定化分选酶A制成碳糊电极能够实现金黄色葡萄球菌的快速且准确的检测。与现有技术相比无需标记、实时检测、检测稳定性良好、检测简单快速等优点。
下面结合实例对本发明内容进行描述。
附图说明
图1、2为本发明制得的有序介孔碳材料CMK-3的SEM照片；
图3为本发明制得的羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3的红外光谱图；
图4为本发明制得的固定化分选酶纳米复合材料O-CMK-3-M的红外光谱图；
图5为本发明制得的羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3的X射线光电子能谱图；
图6、7为本发明制得的固定化分选酶纳米复合材料O-CMK-3-M的X射线光电子能谱图；
图8为本发明固定化分选酶纳米复合材料O-CMK-3-M检测金黄色葡萄球菌的标准曲线图；
具体实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
将1.25g蔗糖和0.14g浓硫酸溶解在5.0g水中，往该溶液中加入1g的SBA-15，使混合物在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升温至160℃加热6h；0.75g蔗糖，0.08g浓硫酸溶解在5.0g水中，把上述材料浸入该混合物，使其在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升温至160℃加热6h；将得到的产品在氮气氛中900℃煅烧6h，升温速度2.5℃/min，最后将产品在氢氟酸中浸泡，洗涤、干燥。最终得到有序介孔碳材料CMK-3。
将300mg CMK-3纳米材料浸入到15mL 1.75mol/L的过硫酸铵溶液和15mL 2mol/L的硫酸溶液中，40℃下水浴搅拌24h，洗涤、干燥，制得制得羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3。
5mg EDC和6mg NHS加入30mL Tris-HCL缓冲液中，取30mg羧基功能化CMK-3加入溶液中，室温下超声分散30min，取1mL 11.486mg/mL分选酶加入Tris-HCL缓冲液中，37℃条件下150rpm震荡培养8h，离心取沉淀，制得固定化分选酶介孔碳纳米复合材料O-CMK-3-M。
取0.015g固定化分选酶介孔碳纳米复合材料，0.065g石墨，与24uL的液体石蜡研磨均匀，制成碳糊电极，没入金黄色葡萄球菌菌液中检测。检测方法为差分脉冲伏安法(DPV)，条件为：起始点位0.2V，最高点位1.3V，电位增幅0.004V，脉冲宽度为0.06s，脉冲周期为0.02s，静止时间0.5s，灵敏度1.0e-003A/V。
经上述方法测的结果有明显的且规律的峰电流值。
实施例2
将1.25g蔗糖和0.14g浓硫酸溶解在5.0g水中，往该溶液中加入1g的SBA-15，使混合物在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升温至160℃加热6h；0.75g蔗糖，0.08g浓硫酸溶解在5.0g水中，把上述材料浸入该混合物，使其在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升温至160℃加热6h；将得到的产品在氮气氛中900℃煅烧6h，升温速度2.5℃/min，最后将产品在氢氟酸中浸泡，洗涤、干燥。最终得到有序介孔碳材料CMK-3。
将300mg CMK-3纳米材料浸入到15mL 1.75mol/L的过硫酸铵溶液和15mL 2mol/L的硫酸溶液中，40℃下水浴搅拌24h，洗涤、干燥，制得制得羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3。
5mg EDC和6mg NHS加入30mL Tris-HCL缓冲液中，取30mg羧基功能化CMK-3加入溶液中，室温下超声分散30min，取1mL 11.486mg/mL分选酶加入Tris-HCL缓冲液中，37℃条件下120rpm震荡培养8h，离心取沉淀，制得固定化分选酶介孔碳纳米复合材料O-CMK-3-M。
取0.015g固定化分选酶介孔碳纳米复合材料，0.065g石墨，与24uL的液体石蜡研磨均匀，制成碳糊电极，没入金黄色葡萄球菌菌液中检测。检测方法为差分脉冲伏安法(DPV)，条件为：起始点位0.2V，最高点位1.3V，电位增幅0.004V，脉冲宽度为0.06s，脉冲周期为0.02s，静止时间0.5s，灵敏度1.0e-003A/V。
经上述方法测的结果未见有明显的且规律的峰电流值。
实施例3
将1.25g蔗糖和0.14g浓硫酸溶解在5.0g水中，往该溶液中加入1g的SBA-15，使混合物在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升温至160℃加热6h；0.75g蔗糖，0.08g浓硫酸溶解在5.0g水中，把上述材料浸入该混合物，使其在烘箱中100℃干燥6h，再把烘箱升温至160℃加热6h；将得到的产品在氮气氛中900℃煅烧6h，升温速度2.5℃/min，最后将产品在氢氟酸中浸泡，洗涤、干燥。最终得到有序介孔碳材料CMK-3。
将300mg CMK-3纳米材料浸入到15mL 1.75mol/L的过硫酸铵溶液和15mL 2mol/L的硫酸溶液中，40℃下水浴搅拌24h，洗涤、干燥，制得制得羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3。
5mg EDC和6mg NHS加入30mL Tris-HCL缓冲液中，取30mg羧基功能化CMK-3加入溶液中，室温下超声分散30min，取1mL 11.486mg/mL分选酶加入Tris-HCL缓冲液中，37℃条件下180rpm震荡培养8h，离心取沉淀，制得固定化分选酶介孔碳纳米复合材料O-CMK-3-M。
取0.015g固定化分选酶介孔碳纳米复合材料，0.065g石墨，与24uL的液体石蜡研磨均匀，制成碳糊电极，没入金黄色葡萄球菌菌液中检测。检测方法为差分脉冲伏安法(DPV)，条件为：起始点位0.2V，最高点位1.3V，电位增幅0.004V，脉冲宽度为0.06s，脉冲周期为0.02s，静止时间0.5s，灵敏度1.0e-003A/V。
经上述方法测的结果未见有明显的且规律的峰电流值。

Claims (6)

1.一种金黄色葡萄球菌的电化学检测方法，包括步骤如下：
(1)制备羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3：300mg CMK-3浸入到15mL 1.75mol/L过硫酸铵溶液和15mL 2mol/L硫酸溶液中，40℃下水浴搅拌24h，利用湿氧化法得到有序的羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3；
(2)制备固定化分选酶介孔碳纳米复合材料O-CMK-3-M：5mg EDC和6mg NHS加入30mLTris-HCL缓冲液中，取30mg羧基功能化的介孔碳材料O-CMK-3加入Tris-HCL缓冲液中，室温下超声分散30min，取1mL 11.486mg/mL分选酶加入Tris-HCL缓冲液中，37℃条件下150rpm震荡培养8h，离心取沉淀，制得固定化分选酶介孔碳纳米复合材料；
(3)取0.015g固定化分选酶介孔碳纳米复合材料，0.065g石墨，与24uL的液体石蜡研磨均匀，制成碳糊电极，没入金黄色葡萄球菌菌液中检测。
2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的电化学检测方法，其特征是将分选酶固载化，利用分选酶与金葡菌表面蛋白特异性结合检测金葡菌。
3.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的电化学检测方法，其特征在于，步骤(2)中所采用的固定方法为共价结合法。
4.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的电化学检测方法，其特征在于，步骤(2)中所采用的离心方法为冷冻离心，13000rpm，4℃，20min。
5.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的电化学检测方法，其特征在于，步骤(3)中检测方法为差分脉冲伏安法(DPV)，条件为：起始点位0.2V，最高点位1.3V，电位增幅0.004V，脉冲宽度为0.06s，脉冲周期为0.02s，静止时间0.5s，灵敏度1.0e-003A/V。
6.根据权利要求5所述的金黄色葡萄球菌的电化学检测方法，其特征在于，差分脉冲伏安法(DPV)检测时间间隔为20min。
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