CN106496352A - 一种褐藻多糖硫酸酯提取方法 - Google Patents
一种褐藻多糖硫酸酯提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种植物原料药的提取新方法,即一种褐藻多糖硫酸酯提取方法。制剂商品名称:海昆肾喜胶囊。其主要提取步骤如下:(1)干海带加10倍量水浸泡8小时,控制室温8‑32℃;取浸泡液浓缩至原有体积1/5备用;采用本步骤,使得海洋生物表面的褐藻多糖分离出来。(2)浸泡后的海带取出切碎,用AH高压匀浆机匀浆。(3)匀浆液加氢氧化钠调节pH值12,搅拌30分钟,静止12小时,用盐酸调节pH值1.5‑2,搅拌8小时,静止12小时。(4)过滤。(5)滤液与步骤(1)中的浓缩液合并采用特型500电渗析脱盐。(6)药液浓缩、脱色。(7)离心,滤饼用95%乙醇洗涤。(8)干燥、粉碎干燥物。提高收率,降低成本。经检测,本方法比原有的工艺收率提高40%以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物原料药的提取新方法,即一种褐藻多糖硫酸酯提取方法。制剂商品名称:海昆肾喜胶囊。
背景技术
在现有技术中,慢性肾功能衰竭,是慢性肾脏疾病或累计肾脏系统性疾病所引起的慢性肾功能减退,以及由此产生的各种临床症状和代谢紊乱所组成的综合症。该病属于疑难病症,现国际、国内西医界尚无特效方法,中医药在延缓慢性肾衰竭病程进展方面有一定的疗效,现有中药治疗慢性肾衰的药物中少有二类中药。褐藻多糖硫酸酯原料药(制剂商品名称;海昆肾喜胶囊)作为海洋植物海带中提取的二类药物(国家药品标准YBZ00902003-2008),具有原材料成本低,来源容易,功效显著的特点。褐藻多糖硫酸酯是从海洋藻类海带中提取的有效成分,是自然界中少有的硫酸酯离子型多糖。经过中国科学院海洋研究所和吉林长龙药业公司的协力合作,褐藻多糖硫酸酯原料药和海昆肾喜胶囊获得国家新药证书,实现产业化,为广大慢性肾病患者开辟了一条新的治疗途径,取得了一定得经济和社会效益。功能与主治:化浊排毒,用于慢性肾功能衰竭(代偿期、失代偿期和尿毒症早期)湿浊症。症见恶心,呕吐,纳差,腹胀,身重困倦,尿少,浮肿,苔厚腻。湿浊证是慢性肾衰的最常见的中医证型,针对慢性肾衰湿浊证的药物在临床应用范围广,适用病员众多,并且海昆肾喜胶囊服用量小,无增加胃肠道负担和水负荷过多之忧,同时对慢性肾衰湿浊证主要症状及症候积分也有明显的改善作用,无常见的治疗肾衰竭药物胃肠道反应大及腹泻等副作用,故该药有其优势及独特性。褐藻多糖硫酸酯原料药制法:将8000kg海带切段于溶解池中加140000kg水,室温浸泡4时,浸泡液加氢氧化钠,调pH值至12,得到碱凝聚物,取凝聚物一次板框滤布过滤,滤饼加酸溶解,调节pH值3.5,溶液二次板框滤布过滤,取滤液,弃去滤饼残渣,溶液调pH值4-5,三次板框滤布过滤,取滤液加乙醇调至乙醇浓度70%,形成沉淀,取沉淀物干燥得干固物,将干固物粉碎得海带提取物。在搪瓷反应釜中加饮用水900kg,然后投入本批海带提取物,搅拌30分钟,缓缓加入盐酸476kg,调节PH值2-3,加酸完毕继续搅拌8小时,将溶解液转入沉降罐静置12小时,取上清液用49kg硅藻土真空转鼓滤过。滤液电渗析脱盐,脱盐液加浓氨水中和至中性。料液用单效蒸发器减压浓缩至420L,浓缩液转移至醇析罐,加1.4L10%的氯化钾溶液,加乙醇使醇量达70%,搅拌30分钟,静置,12小时,沉淀物离心,滤饼用95%乙醇洗涤一次,滤饼用真空减压干燥箱于60℃真空干燥,干燥膏粉碎,得褐藻多糖硫酸酯17kg。粉碎,密闭保存。本品以干燥品计,含褐藻糖不得少于25%,含水解硫酸基不得少于22%。其缺点是:采用常规海带浸泡加碱处理,3次板框滤布过滤,规模生产效率低,耗时长,对海洋生物特有的褐藻胶不易分离去除,产品收率低。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足而提供一种改进的方法,保证有效成分析出,提取效果更好的褐藻多糖硫酸酯提取方法。
本发明的技术解决方案是:一种褐藻多糖硫酸酯提取方法,其步骤如下:
(1)干海带加10倍量水浸泡8小时,控制室温8-32℃;取浸泡液浓缩至原有体积1/5备用;采用本步骤,使得海洋生物表面的褐藻多糖分离出来。
(2)浸泡后的海带取出切碎,用高压匀浆机匀浆(AH高压匀浆机匀浆,ATS工业系统有限公司商售产品,上海);产量1000kg/小时,物料细度80目。
(3)匀浆液加氢氧化钠调节pH值12,搅拌30分钟,静止12小时(碱性溶液可改变海带细胞壁中多糖和蛋白质的空间结构,使原本结构紧密的细胞壁变疏松,再经浸泡,细胞结构补破坏,胞内物质析出),用盐酸调节pH值1.5-2,搅拌8小时,静止12小时(溶解褐藻多糖,使其从细胞内分离出来);采用本步骤,使得海洋生物内部特有的褐藻多糖容易分离去除,具有分离效果好,大批量生产耗时短,效率高,产品处理量大,收率高,可连续工业大生产的优势。
(4)硅藻土真空转鼓吸附过滤;转鼓转速为每转0.1至10分钟。操作真空的绝对压力为(0.25~0.8)×10帕。
(5)滤液与步骤(1)中的浓缩液合并采用特型500电渗析脱盐(淡、浓水压力达到0.05-0.1Mpa),脱盐液加浓氨水中和至中性。特型500是指:额定产量为5立方米/小时。
(6)药液浓缩,加活性炭脱色。
(7)浓缩液加10%氯化钾,二次加乙醇使含醇量达70%,静止得沉淀物,离心,滤饼用95%乙醇洗涤。
(8)滤饼在60℃下真空减压干燥4小时。
(9)粉碎干燥物,制得乳白色或浅黄色粉末的褐藻多糖硫酸酯。
糖尿病肾病是与代谢异常(如多元醇代谢异常、非酶糖基化)、细胞因子及血管活性因子等有关。早起多无症状血压可正常或偏高。用放射免疫法测定尿微量白蛋白排出量>200微克/分钟,此期叫做隐匿性肾病,或早期肾病。如能积极控制高血压及高血糖,病变可望好转。
因此研究毒副作用小,药效确切,剂量小的糖尿病肾病新药是当务之急,也是人类之急需。在临床试验中,通过对慢性肾衰同时并发糖尿病肾病患者服用海昆肾喜胶囊的临床试验结果分析,我们发现病人的蛋白尿、浮肿、高血压等同时明显改善。针对这一现象,我们针对褐藻多糖硫酸酯具有良好的调理血糖、血压作用,褐藻多糖硫酸酯通过多途径多靶点调节脂质代谢紊乱,可通过抑制外源性脂质吸收、促进内源性脂质代谢激活脂质代谢酶和增加胆汁酸排泄三个方面调节脂质代谢,并通过抗脂质过氧化及减少脂质在组织中的沉积来抑制动脉粥样硬化的发展。作为多糖类天然海洋毒副作用小,药效确切,容易被病人接受,因此增加其糖尿病肾病作用的适应症,能够满足部分糖尿病肾病人的临床需要,也有利于扩大褐藻多糖硫酸酯的销售规模。
本发明的优点是:1、海昆肾喜胶囊原料药褐藻多糖硫酸酯是一种具有独特结构和功能的硫酸酯离子型多糖。本发明对提取工艺进行了改进,工艺路线采用海带浸泡、酸碱提取路线,大大缩短生产周期,有效地解决了海洋植物中褐藻多糖不宜分离的难题,提高收率,降低成本,减少污染,有利于实现规模化生产。并进行海昆肾喜胶囊的药效学试验研究及临床试验。2、经检测,本方法带来的显著效果是提高了褐藻糖的含量,≥27mg/粒。提高了水解硫酸基含量,≥25mg/粒。比原有的工艺收率提高40%以上。
下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。
具体实施方式
实施例1
将2000kg海带于溶解池中加20000kg水,室温浸泡8时,浸泡液浓缩至4000kg备用。浸泡后的海带切碎,用匀浆机进行匀浆,匀浆液加氢氧化钠调节pH值12,搅拌30分钟,静止12小时,加盐酸960kg调节pH值1.5-2,加酸完毕继续搅拌8小时,将溶解液转入沉降罐静置不少于12小时,取上清液与海带浸泡后的浓缩液合并用60kg硅藻土真空转鼓滤过。滤液采用特型500电渗析脱盐,脱盐液加浓氨水中和至中性。料液用单效蒸发器减压浓缩至300L,浓缩液转移至醇析罐,加1L10%的氯化钾溶液,加乙醇使醇量达70%,搅拌30分钟,静置不少于12小时,沉淀物用三足式离心机离心,滤饼用95%乙醇洗涤一次,滤饼用真空减压干燥箱于60℃真空干燥,干燥膏用ZKF-3X型自控粉碎机组粉碎,筛网规格100目,得褐藻多糖硫酸酯6.1kg。经含量测定(具体方法符合褐藻多糖硫酸酯原料药国家药品标准YBZ00902003-2008规定),褐藻糖的含量达到了28%以上,水解硫酸基含量达到26%以上(见表1),既符合标准要求,又明显提高了褐藻糖、水解硫酸基的含量及收率。
表1 褐藻多糖硫酸酯新旧工艺结果对比
实验例
新工艺得到的海昆肾喜胶囊的药效学试验研究
一、试验材料
1、药品
褐藻多糖硫酸酯由吉林省辉南长龙药业股份有限公司提供,批号:20131101,给药时用蒸馏溶解配制成不同浓度的溶液,醋酸地塞米松,山西亨瑞达制药有限公司,批号:110801,2、4二硝基氯苯,上海化学试剂有限公司试剂一厂产,氢氯噻嗪片,山东利丰华瑞制药有限责任公司,批号:20130105。
2、动物
雄性Wistar大鼠,体重220~260g,昆明种小鼠,雌雄各半,体重18-22g,由山东省新药药理研究中心提供。杂种家犬,体重12-15kg,购自家家村,雌雄兼用。
3、仪器
RM-6000型多导生理记录仪,MFV-3200型电磁流量仪,日本光电公司产,大鼠代谢笼,江苏苏州吴桥笼具厂制造。电子分析天平,梅特勒-托利多有限公司产。Backman ICSⅡ型速率散射比浊仪:美国Backman公司产。
二、试验方法
1、对2,4二硝基氯苯所致小鼠迟发型超敏反应的影响
选体重18-24g的健康昆明种小鼠,雌雄兼用。用1.25%的2,4二硝基氯苯丙酮液背部皮下注射0.02ml/只小鼠致敏。致敏后一天,动物随机分为5组,即受药物低、中、高剂量组,醋酸地塞米松,模型组。分别灌胃给予褐藻多糖硫酸酯75、150、300mg/kg,醋酸地塞米松0.1mg/kg,模型组给予等容积生理盐水不,连续灌胃9天,第10天以0.25%2,4二硝基氯苯丙酮液皮下注射小鼠右足垫中间,剂量为0.02ml/只,对侧足注射等容积丙酮液作对照,38小时后从踝关节剪下二足,电子天平称重,按下式计算肿胀度及抑制率,并进行统计学处理。
肿胀度=右足重量(mg)-左足重量(mg)
处死动物前取内眦静脉血离心,速率散射比浊法测定血清C3、C4、IgG、IgM含量。
另取10只昆明种小鼠作为正常组,同样饲养10天后,内眦静脉取血离心,同上测定测血清C3、C4、IgG、IgM含量。
2、对正常动物利尿作用
体重150~200g的雄性健康Wistar大鼠,置于代谢笼中预适应1日,接取6小时尿液,观察自由饮水条件下的尿量,选尿量稳定的动物入选试验。
按6小时排尿量将动物随机分为5组,即受试药物高、中、低剂量组,氢氯噻嗪组,正常组,给药组剂量分别为褐藻多糖硫酸酯50、10、200mg/kg,氢氯噻嗪4mg/kg,给药容积为1ml\100g,正常组给予等容积溶媒。
试验前动物禁食18小时。给药后动物迅速放入给予充足饮水的代谢笼中,每代谢笼中放置大鼠1只,放入前轻压动物下腹,排尽余尿,药后每小时接尿一次,连续观察6小时,观察各组一定时间内尿量的差异。
3、对水负荷动物利尿作用
体重150~200g的雄性健康Wistar大鼠,置于代谢笼中预适应1日,接取6小时尿液,观察自由饮水条件下的尿量是否稳定,再按2.5ml/100g灌胃生理盐水,2小时内收集的尿量达到灌入量40%的动物入选试验。
按6小时排尿量将动物随机分为6组,即受试药物低、中、高剂量组,氢氯噻嗪组,模型组,正常组。给药组剂量分别为褐藻多糖硫酸酯50、100、200mg/kg,氢氯噻嗪4mg/kg,模型组给予等容积生理盐水,正常组不做处理。
试验前动物禁食18小时,试验时给药组动物药物混于负荷水(即按2.5ml/100g灌胃给予38℃生理盐水)中给予。模型组用等容积的生理盐水代替药液。给药后动物迅速放入给予充足饮水的代谢笼中,每代谢笼中放置大鼠1只,放入前轻压动物下腹,排尽余尿。药后每小时接尿一次,连续观察6小时,观察各组一定时间内尿量的差异。
4、对麻醉犬肾血流量的影响
家犬用3%戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉,颈部正中切开,气管插管,腹卧位固定于手术台上,从左侧膈胁角处纵行切开皮肤,分离肌肉,从腹膜后暴露肾脏,打开肾脂肪囊,仔细分离肾动脉,套入直径为2~4㎜电磁流量计控头,测定肾血流量,手术结束后30分钟,等肾血流量恢复且稳定后,分别按20、60mg/kg静脉注射褐藻多糖硫酸酯溶液,给药容积为1ml/kg,药物在1分钟内给完。记录药前,药后0.5、1、3、5、10、20、30分钟肾血流量。
三、试验结果
1、对2、4二硝基氯苯所致小鼠迟发型超敏反应的影响
结果见表2、3。
表2 褐藻多糖硫酸酯对二硝基氯苯所致小鼠迟发型超敏反应的影响
由表2可见,褐藻多糖硫酸酯ig给药9天对2,4二硝基氯苯所致小鼠迟发型超敏反应有抑制作用,100、200mg/kg组肿胀度与模型组比较p<0.01。醋酸地塞米松组也有类似作用。
表3 褐藻多糖硫酸酯对血清C3、免疫球蛋白、总补体含量的影响
·正常组·p<0.05 ··p<0.01*vs模型组 *p<0.05 **<0.01
由表3可见,小鼠皮下注射2,4二硝基氯苯后体液免疫指标均升高。给予药物ig9天后,褐藻多糖硫酸酯150mg/kg组对小鼠体液免疫部分指标有抑制作用;褐藻多糖硫酸酯300mg/kg组及醋酸地塞米松组对小鼠体液免疫各项指标均有显著抑制作用,与模型组比较p<0.05或p<0.01。褐藻多糖硫酸酯75mg/kg组仅有作用趋势。
2、对正常大鼠利尿作用
结果见表4
表4 褐藻多糖硫酸酯对水负荷大鼠单位时间内尿量(单位:ml)的影响
·vs正常组·p<0.05 ··p<0.01 *vs模型组 *p<0.05 **<0.01
由表4可见,模型组给予水负荷后动物尿量明显增加,0~3小时期间与正常组比较有统计学差异(p<0.01或0.05)。褐藻多糖硫酸酯各组在给药后6小时内尿量与模型组比较均有增加,其中100mg/kg组在给药后3~4小时期间尿量有统计学差异(p<0.05);200mg/kg组在给药后1~6小时期间尿量有统计学差异(p<0.01或0.05)。褐藻多糖硫酸酯50mg/kg组也有作用趋势。各剂量组作用具有剂量依赖性。褐藻多糖硫酸酯各组在给药后2~4小时利尿作用最强。氢氯噻嗪组在给药后6小时内尿量与模型组比较均有统计学差异(p<0.01或0.05)。
3、对水负荷大鼠利尿作用
_结果见表5
表; 褐藻多糖硫酸酯对正常大鼠单位时间内尿量(单位:ml)的影响
*vs模型组 *p<0.05 **<0.01
由表5可见褐藻多糖硫酸酯各组在给药后尿量与正常组比较均有增加,其中200mg/kg组在给药后0~5小时期间尿量与正常组比较有统计学差异(p<0.01或0.05);50、100mg/kg组在给药后部分时间内尿量也有统计学差异(p<0.01或0.05)。各剂量组作用具有剂量依赖性。褐藻多糖硫酸酯各组在给药后2~4小时利尿作用最强。氢氯噻嗪组在给药后6小时内尿量与正常组比较均有统计学差异(p<0.01或0.05)。
4、对麻醉犬肾血流量的影响
结果见表6
表6 褐藻多糖硫酸酯对麻醉犬肾血流量的影响
X±SD,n=4,*p<0.05,**p<0.01
由表6可见,NS对照组肾血流量无显著性变化;褐藻多糖硫酸酯高剂量组药后肾血流量明显增加,药后3、5和20分钟与药前比较有显著性差异,药后10分钟与药前比较有极显著性差异;低剂量组药后肾血流量也出现升高作用,药后0.5、1分钟与药前比有显著性差异。高剂量组药后10分钟肾血流量增高作用达最大,可持续至药后20分钟。
六、试验结论
1、褐藻多糖硫酸酯150、300mg/kgig给药9天对2、4二硝基氯苯所致小鼠迟发型超敏反应有明显抑制作用,且具有剂量依赖性。同时可明显抑制超敏反应小鼠体液免疫。
2、褐藻多糖硫酸酯50、200mg/kg单次灌胃给药对正常及水负荷大鼠均有利尿作用,在给药后2~4小时药物利尿作用最强,各剂量组作用差异明显,具有一定剂量依赖关系。
3、褐藻多糖硫酸酯60mg/kg静脉注射给药可增加麻醉犬肾血流量,药后3分钟起效,10分钟达最大作用(15.52%),可持续至药后20分钟。
新工艺得到的海昆肾喜胶囊临床试验报告
1、疗效评估
本试验采用海昆肾喜胶囊Ⅰ号(治疗组)与海昆肾喜胶囊Ⅱ号(对照组)分别治疗慢性肾功能衰竭湿浊证患者40例,试验结果显示:治疗组40例患者中,显效9例,有效8例,稳定12例,有效率为42.5%,对照组40例患者中,显效8例,有效8例,稳定15例,有效率为40.0%,两组有效率无显著性差别,略有提主,P<0.05;治疗组有效稳定率为72.5%;对照组有效稳定率为60.0%,治疗组与对照组总体疗效差异无显著性,P>0.05。此外,海昆肾喜胶囊具有降低血尿素、肌酐、血尿酸,升高内生肌酐清除率,改善肾功能,增加血红蛋白及血浆白蛋白水平等作用。海昆肾喜胶囊对慢性肾衰湿浊证主要症状及症候积分具有明显的改善作用,故海昆肾喜胶囊适用于慢性肾衰湿浊证患者。
2、安全性评估
本组临床试验中未发现明显不良反应,对治疗前后临床症状、白细胞、肝功能、血糖、大便隐血、心、肺等指标检测,均未发现异常,提示该药安全,无明显副作用。
实验病例
李先生,男,58岁,工人,住院。
患者主诉为乏力3个月,浮肿,恶心14天。患者于3个月前出现乏力,到当地医院查血压为200/120mmHg,尿蛋白+++,BUN19.8mmol/L,诊为“慢性肾炎”,给予“保肾康”、“心痛定”、“潘生丁”治疗无明显好转,近7天出现眼睑及双下肢浮肿,恶心,食欲不振。查体:血压200/120mmHg,营养稍差,慢性肾病容,眼睑稍浮肿,双下肢轻度浮肿。诊断:中医:虚劳;西医:①慢性肾功能不全(肾功衰竭期)②慢性肾小球肾炎。治疗前检查血尿素22.5mmol/L、肌酐612.4umol/L、Ccr14.8ml/min,24小时尿蛋白定量3.56g,湿浊证积分值24分,患者存在恶心、呕吐、纳差、腹胀、身重困倦、浮肿、舌苔厚腻,经海昆肾喜胶囊Ⅰ号治疗后,4周时湿浊证症状积分值为12分,血肌酐降至389.1umol/L,8周时积分为8分,血肌酐为389.7umol/L,乏力明显减轻,恶心消失,眼睑及双下肢浮肿消退,治疗效果为明显。
上面描述,只是本发明的具体实施方式,各种举例说明不对本发明的实质内容构成限制。
Claims (1)
1.一种褐藻多糖硫酸酯提取方法,其特征在于步骤如下:
(1)干海带加10倍量水浸泡8小时,控制室温8-32℃;取浸泡液浓缩至原有体积1/5备用;
(2)浸泡后的海带取出切碎,用高压匀浆机匀浆;
(3)匀浆液加氢氧化钠调节pH值12,搅拌30分钟,静止12小时,用盐酸调节pH值1.5-2,搅拌8小时,静止12小时;
(4)硅藻土真空转鼓吸附过滤;
(5)滤液与步骤(1)中的浓缩液合并采用特型500电渗析脱盐,脱盐液加浓氨水中和至中性;
(6)药液浓缩,加活性炭脱色;
(7)浓缩液加10%氯化钾,二次加乙醇使含醇量达70%,静止得沉淀物,离心,滤饼用95%乙醇洗涤;
(8)滤饼在60℃下真空减压干燥4小时;
(9)粉碎干燥物,制得乳白色或浅黄色粉末的褐藻多糖硫酸酯。
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