CN106461458B - 用于光束扫描显微镜检查的设备和方法 - Google Patents

用于光束扫描显微镜检查的设备和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种光束扫描显微镜检查设备，包括适配于发射光束(2)的光源和适配于将所述光束(2)聚焦在物平面(11)中的显微镜物镜(1)。根据本发明，所述显微镜检查设备包括：串联设置在所述光源和所述显微镜物镜(1)之间的所述光束(2)的光路上的第一和第二反射光学装置(M‑X1，M‑X2)，适配于根据第一预定旋转角度(RX1)倾斜所述第一反射光学装置(M‑X1，M‑XY1)的第一角度倾斜装置(21，25)，以及适配于根据第二旋转角度(RX2)倾斜所述第二反射光学装置(M‑X2，M‑XY2)的第二角度倾斜装置(22，26)，以如此方式通过围绕所述显微镜物镜(1)的光瞳的中心(O)枢转而成角度地倾斜所述光束(2)的轴(12)。

Description

用于光束扫描显微镜检查的设备和方法
技术领域
本发明一般涉及用于光束扫描或光束角位移显微镜检查(microscopy)的设备和方法的领域。
更具体地，它涉及一种用于扫描激光束拉曼显微光谱测量(micro-spectrometry)的设备和方法。
本发明还适用于其他形式的光束扫描光学显微镜检查，例如光致发光、荧光或阴极发光显微镜检查。在这些用于扫描光学显微镜检查的设备中，光学扫描光束可以是激光束或由发光二极管(LED)发射的光束，例如在TCSPC(时间相关单光子计数)型的分光荧光计中。
背景技术
尤其在专利文献EP1983332A中已知一种光谱成像的方法和样本表面扫描探测系统。文献EP1983332A描述了一种光谱成像设备，其包括扫描装置，也称为扫描仪，以经由根据正交方向的激发激光束的角位移探测固定样本的表面。更准确地说，文献EP1983332A描述了一种扫描装置，所述扫描装置以一种方式放置在共焦显微镜的管中以便被插入在显微镜物镜和拉曼光谱仪的注入拒波滤波器(injection-rejection filter)之间。扫描装置包括在激光束的光路上串联设置的两个振镜反射镜(galvanometric mirror)。该两个振镜反射镜具有相互垂直的旋转轴，以便在样本表面上根据正交方向成角度地移动激光束。具有两个反射镜的光学系统在一个方向上操作，以使激发激光束以将它定位在样本表面的不同点处的方式成角度地移动。通过光的反向返回，具有两个反射镜的该光学系统在相反方向上操作，以便收集拉曼后向散射光束并在检测系统例如拉曼光谱仪的方向上传输它。该系统的优点是激光源和检测系统保持固定。该设备使得可以以约十分钟内约50×50点的分辨率通过样品表面的一部分的拉曼光谱测定来获取图像。
其他专利文献描述了用于束扫描显微镜检查的设备(参见例如WO 2010/069987、US 2005/128476或JP 2001 091848)。
在样本上扫描区域的尺寸尤其取决于所使用的显微镜物镜的放大率。对于反射镜的相同旋转幅度，显微镜物镜的放大率的变化使得可以修改在样本上的扫描表面的范围。
所使用的显微镜物镜可以是不同类型的：标准的、具有长工作距离(Long WorkingDistance或LWD)的、适用于可见光的和/或紫外光范围的。
然而，不管显微镜物镜的放大率如何，在实践中观察到，可以通过激光束在样本表面上的角位移接近的表面的范围明显小于显微镜物镜的光场。在本文献中，物场指的是显微镜物镜的焦平面中的光场。
因此，通过示例方式，使用了不同显微镜物镜，例如放大物镜100X、50X和10X。每个显微镜物镜由数值孔径(或NA)、焦距、场数(或FN)和直径限定。
根据对应于在物镜的前面和样本之间的距离的前面距离来计算光场的最大宽度。
在实践中，显微镜物镜的光场的最大宽度通过以下公式计算：
场的宽度＝场数/放大率。
下表分别表示Mplan N 100X、50X和10X型OLYMPUS品牌的不同物镜的参数的值：
表1：不同显微镜物镜的光学特性
在上表中指示的光场的最大宽度对应于用于通过显微镜物镜成像的光场的长度。
然而，在实践中，通过这些显微镜物镜中的每一个扫描或成角度地位移激光束可接近的场宽实际上明显小于所考虑的物镜的场的最大宽度。
因此，对于Olympus MPLAN N 50X物镜，实验测量出可有效接近的双轴激光扫描显微镜检查设备(也被称为DuoScan)的场的宽度为约±27微米，而该物镜的光场的最大宽度为440微米。同样，对于Olympus MPLAN N 10X物镜，Duoscan的激光扫描场为约200微米，而该物镜的光场的最大宽度为2200微米。
在可以由激光扫描接近的场的宽度方面的这种限制是由于激光束在光学部件的孔径上的渐晕导致的。为了限制该效应，需要减少激光束的直径，这对于减少空间分辨率(lambda/NA)是有害的，因为显微镜物镜的有效数值孔径通过子覆盖(sub-cover)光瞳来减少。
为了扩展在样本上的激光扫描光束的空间探测区，已经提出了各种解决方案。第一种解决方案在于改变显微镜物镜以便减少放大率。改变放大率的缺点是测量的空间分辨率与物镜的放大率成比例。另一种解决方案在于将通过激光束的轴的角度倾斜的扫描与样本相对于显微镜物镜的相对位移组合。
然而，改变显微镜物镜或样本架的位移需要时间。此外，这些操作引起对由显微镜检查设备成像的场的不连续修改。通常获得一系列连续图像，其难以重组以便形成具有良好空间分辨率的在扩展区上的样本的完整图像。
另一个限制是通过扫描获得的拉曼光谱测量的质量。实际上观察到，对于相同的测量采集参数，扫描拉曼显微光谱测量的测量质量小于没有扫描的测量的质量。
此外，不可能在照相机的图像上直接观察扫描光束在样本上的位置。因此，难以控制激光束的位置，例如在用于测量生物芯片的应用中。
发明内容
本发明的目的之一是增加可以由在扫描显微镜检查设备中的光束扫描接近的场宽，以便接近该显微镜检查设备的光场的最大宽度。
本发明的目的之一是增加测量场的空间扩展，而不改变测量的空间分辨率或测量的质量。
本发明的另一目的是改进扫描拉曼显微光谱测量的测量质量，同时仍然减少用于测量的采集时间。
本发明的另一目的是限制在入射激光束和拉曼散射束上的强度损失。
为了克服现有技术的上述缺点，本发明提出了一种用于光束扫描显微镜检查的设备，其包括适配于发射光束的至少一个光源；具有入射光瞳的显微镜物镜；以及用于根据在所述物平面中的至少一个空间方向(X，Y)将所述光束角位移的装置，所述显微镜物镜根据所述显微镜检查设备的纵向光轴来布置，所述光瞳具有在所述纵向光轴上的中心，并且所述显微镜物镜适配于将所述光束聚焦在横向于所述纵向光轴的物平面中。
更具体地，根据本发明，提出了一种用于光束扫描显微镜检查的设备，其中，用于将所述光束角位移的所述装置包括：
-第一反射光学装置和第二反射光学装置，其串联设置在所述激光源和所述显微镜物镜之间的所述激光束的光路上，
-第一角度倾斜装置，其适配于根据第一预定旋转角度倾斜所述第一反射光学装置，以及
-第二角度倾斜装置，其适配于根据基于所述第一旋转角度的第二预定旋转角度倾斜所述第二反射光学装置，以如此方式通过围绕所述显微镜物镜的所述光瞳的中心枢转来使所述光束的轴成角度地倾斜，所述光束在所述光束的轴相对于所述纵向光轴的倾斜角范围内保持居中在所述显微镜物镜的光瞳的中心上，以如此方式来根据所述物平面中的所述至少一个方向移动所述光束。
本发明有利地使得可以在用于光束扫描显微镜检查的设备中增加光束在显微镜物镜的焦平面中的位移幅度。
在特定实施例中，用于将所述光束角位移的所述装置进一步包括：
-第三反射光学装置和第四反射光学装置，其串联设置在所述激光源和所述显微镜物镜之间的激光束的光路上，
-第三角度倾斜装置，其适配于根据第三预定旋转角度倾斜所述第三反射光学装置，
-第四角度倾斜装置，其适配于根据基于所述第三旋转角度的第四预定旋转角度倾斜所述第四反射光学装置，以如此方式通过围绕所述显微镜物镜的所述光瞳的中心枢转来使所述光束的轴成角度地倾斜，所述光束在所述光束的轴相对于所述纵向光轴的倾斜角范围内保持居中在所述显微镜物镜的光瞳的中心上，以如此方式来根据在所述物平面中的另一方向移动所述光束。
根据本发明的用于光束扫描显微镜检查的设备的其它非限制性和有利特征如下：
-所述第一反射光学装置和所述第三反射光学装置由相同的第一反射镜形成；
-所述第二反射光学装置和所述第四反射光学装置由相同的第二反射镜形成；
-所述第一反射镜安装在具有两个旋转轴的致动器上，例如压电型或音圈型的，和/或所述第二平面反射镜安装在具有两个旋转轴的致动器上，例如压电型或音圈型的；
-所述第一反射光学装置由第一反射镜形成，并且所述第二反射光学装置由第二反射镜形成；
-所述第三反射光学装置由第三反射镜形成，并且所述第四反射光学装置由第四反射镜形成；
-所述第一反射镜安装在具有一个旋转轴的致动器上，例如振镜型的，所述第二反射镜安装在具有一个旋转轴的致动器上，所述第三反射镜安装在具有一个旋转轴的致动器上，和/或所述第四反射镜安装在具有一个旋转轴的致动器上；
-所述第一反射镜的致动器包括提供位置信号的位置传感器，并且所述第二反射镜的致动器包括位置传感器，其中所述设备包括适配于基于所述第一反射镜的致动器的位置信号驱动所述第二反射镜的致动器的控制信号的锁相环系统，和/或所述第三反射镜的致动器包括提供另一位置信号的另一位置传感器，并且所述第四反射镜的致动器包括另一位置传感器，其中所述设备包括适配于基于所述第三反射镜的制动器的位置信号驱动所述第四反射镜的致动器的控制信号的锁相环系统；
-所述第二旋转角度是所述第一旋转角度、在所述第一反射光学装置和所述第二反射光学装置之间的距离B、在所述第二反射光学装置与所述显微镜物镜的入射光瞳的中心之间的距离A的函数；
-所述显微镜检查设备包括具有不同放大率的多个显微镜物镜；
-所述至少一个光源包括激光源和/或发光二极管类型中的一个或多个源。
在根据本发明的用于光束扫描显微镜检查的设备的特定实施例中，所述设备还包括：
-设置在所述至少一个光源和所述显微镜物镜之间的扩束器，所述扩束器具有固定的和/或可变的放大率；
-观察相机，其适配于形成所述显微镜物镜的所述物平面的图像和/或观察通过光束扫描的扫描样本的区域；
-适配于照射在所述物平面中的样本的白光源；
-设置在与所述物平面光学共轭的平面中的共焦孔和设置在所述至少一个光源和所述显微镜物镜之间的用于准直所述光束的装置，以便形成准直光束，所述第一反射光学装置和所述第二反射光学装置串联设置在所述准直光束的光路上。
在特定的和有利的实施例中，所述用于光束扫描显微镜检查的设备与拉曼光谱仪、相干反斯托克斯(anti-Stokes)拉曼光谱仪(CARS)、荧光光谱仪、光致发光光谱仪或阴极发光光谱仪组合，这些光谱仪适配于测量和分析在激光束的角位移期间通过激光束在样本上的反射、透射和/或散射的信号。
本发明还提出了一种用于光束扫描显微镜检查的方法，包括以下步骤：
-借助于至少一个光源发射光束；
-在第一反射光学装置上然后在第二反射光学装置上光学反射所述光束，所述第一反射光学装置和所述第二反射光学装置串联设置在所述至少一个光源和显微镜物镜之间的光束的光路上，
-根据第一预定旋转角度倾斜所述第一反射光学装置，
-根据基于第一旋转角度的第二预定旋转角度倾斜所述第二反射光学装置，以如此方式在所述光束的轴相对于纵向光轴的倾斜角度的范围内通过围绕所述显微镜物镜的光瞳的中心枢转来成角度地倾斜所述光束的轴；以及
-借助于所述显微镜物镜将所述光束聚焦在物平面中，以如此方式来根据在所述物平面中的至少一个空间方向移动所述光束。
因此，本发明的方法使得可以将光学扫描光束的位置控制在显微镜物镜的光瞳的中心上，而不管光束相对于显微镜物镜的光轴如何倾斜。
在特定实施例中，用于光束扫描显微镜检查的方法还包括以下步骤：
-在第三反射光学装置上然后在第四反射光学装置上光学反射所述光束，所述第三反射光学装置和所述第四反射光学装置串联设置在所述至少一个光源和所述显微镜物镜之间的所述光束的光路上；
-根据第三预定旋转角度倾斜所述第三反射光学装置，
-根据基于所述第三旋转角度的第四预定旋转角度倾斜所述第四反射光学装置，以如此方式在所述光束的轴相对于纵向光轴的倾斜角度的范围内通过围绕所述显微镜物镜的光瞳的中心枢转来成角度地倾斜所述光束的轴；以及
-借助于所述显微镜物镜将所述光束聚焦在所述物平面中，以如此方式来根据在所述物平面中的至少一个其它空间方向移动所述光束。
本发明在通过激光束角位移显微术的成像中具有特别有利的应用，以如此方式来扫描样本的表面以形成样本的图像，例如拉曼显微光谱测量、光致发光、CARS(相干反斯托克斯拉曼散射)型的拉曼显微光谱测量、微CARS、拉曼探针或双光子显微光谱测量。
本发明还在显微镜检查中具有特别有利的应用，其中光束的位移，例如激光束的位移，通过离散步骤进行，以便将激光束指向表面的预定点处，例如在分析生物芯片的应用中。不连续的激光束扫描(步阶式)使得可以在同一表面上每100微米探测样本，例如生物样本(生物芯片)，然后进行测量和一次性分析(例如拉曼光谱法)或通过微样本的局部扫描。在这些应用中，本发明使得可以在生物芯片没有位移的情况下探测更大的场，并且因此探测更大数量的所测量的微样本，在激光束的位移步骤中具有更大的精度。
本发明还应用于通过光束的连续扫描的显微镜检查中。
在特定和有利的实施例中，例如，光束的连续扫描通过例如CCD类型的检测器同步，以便快速地将扫描线的记录传送到电子存储器，以如此方式快速形成扫描样本的表面的图像。
在称为宏点(macrospot)的另一实施例中，光束的连续扫描与例如光电倍增管(PMT)类型的检测器上检测的信号的集成相组合，以如此方式来平均在待分析样本的预定区域上的测量，并且可能更精确地分析特定信号被检测的样本的区域。
本发明的用于光束扫描显微镜检查的系统和方法与根据线、正方形、圆形等在样本上的所有形式的扫描兼容。
本发明还涉及将出现在以下描述中并且必须独立地或根据其任何技允许的组合来考虑的特性。
附图说明
通过非限制性示例的方式给出的该描述将参考附图提供对如何执行本发明的更好理解，其中：
-图1-2示意性地示出了根据现有技术扫描激光束以便移动在样本上的激光束的位置或扫描样本的原理；
-图3和图4示出了根据现有技术激光扫描光束在具有两个扫描轴的用于激光束扫描显微镜检查的设备中的渐晕现象；
-图5示意性地示出了根据本发明的在用于扫描显微镜检查的设备的物镜上的激光束的扫描；
-图6示出了根据本发明第一实施例的激光束扫描系统；
-图7示意性地示出了根据本发明第二实施例的用于拉曼显微光谱测量的设备，其包括具有两个扫描轴的装置；
-图8示出了在本发明第二实施例中的反射镜的替代配置；
-图9示出了在具有图8的反射镜的系统的两个扫描轴的系统中的光线的绘图；
-图10-15示出了根据本发明第二实施例的在具有两个激光束扫描轴的系统中的反射镜的各种替代配置；
-图16-18示出了根据本发明第三实施例的根据两个扫描轴的激光束扫描系统；
-图19-22示出了通过根据本发明的用于激光扫描显微镜检查的设备获得的各种测量。
具体实施方式
图1-2示意性地示出了扫描激光束以便移动在样本上的激光束的位置或扫描样本的原理；
显微镜物镜1设置在显微镜检查设备的光轴10上。将样本4放置在距离显微镜物镜1距离为d处的样本架3上。激光源发射准直的激光束2.平面镜(未示出)在显微镜物镜1的方向上反射激光束。显微镜物镜1将激光束聚焦在显微镜物镜1的焦平面11中。
根据在本文献中的惯例，显微镜物镜1的光轴10平行于在正交系统XYZ中的轴Z，并且显微镜物镜1的焦平面11在XY平面中。
激光束的轴被定义为光束的传播的纵向光轴。对于高斯空间分布的激光束，激光束的轴12位于激光束的中心。
在图1中，激光束2的轴12平行于并且居中在显微镜物镜1的轴10上。激光束被聚焦在显微镜物镜的焦点X0上。
图2中，例如借助布置在激光束2的路径上的平面反射镜通过该反射镜可旋转地移动来成角度地倾斜激光束2的轴12，以这种方式使得激光束聚焦在焦平面11的第二点X1处。在扫描激光束期间，激光源(未示出)和显微镜物镜通常是固定的，只有反射镜可旋转地移动。反射镜的旋转轴例如平行于Y轴并且通常靠近反射镜的反射表面。反射镜的旋转导致激光束2的角位移。激光束2相对于显微镜物镜1的光轴10的这种角位移因此使得可以以连续或步阶式方式扫描点X0和X1之间的样本4的表面。然而，由于反射镜的旋转引起的这种角位移导致激光束的轴12相对于显微镜物镜1的光瞳的中心O的偏心。
对于激光束2的大于第一阈值的倾斜角度，观察到渐晕现象，其中激光束的一部分被显微镜物镜的光瞳的边缘遮挡。渐晕现象随着激光束的倾斜角度而增加，直到对于倾斜角度的第二阈值完全遮挡激光束。激光束的部分和完全遮挡阈值取决于物镜的光瞳和激光束的扩展的孔径。观察到光束的部分关闭，这逐渐降低激发激光束的强度，和通过光的反向返回，检测到的拉曼光束的强度。因此观察到渐晕现象限制了通过在样本上光束的角位移接近的区域。
为了限制在具有一个轴的扫描系统中的渐晕，一种可能性是减少激发激光束的直径。然而，激光束直径的减少导致在焦点处光束直径的增加，这导致光束扫描显微镜检查设备的空间分辨率的降低。
在具有一个扫描轴的系统中，例如在图1-2中示出的，可以通过使反射镜旋转移动更靠近显微镜物镜1减少渐晕效应。
然而，束扫描显微镜检查设备通常不限于单个扫描轴。
因此，大多数束扫描显微镜检查设备将光束围绕两个正交旋转轴的倾斜相组合，以便根据两个横向方向在样本的表面上成角度地移动光束。
图3-4示意性地示出了包括具有两个轴的扫描系统的显微镜检查设备的侧视图，以便说明原理并且分析通过两个轴的光束扫描的限制。相同的附图标记表示与图1-2中相同的元件。扫描系统包括在激光束2的光路上串联设置的第一平面反射镜M-X和第二平面反射镜M-Y。例如设置有振镜电动机15的第一反射镜M-X可围绕第一轴旋转移动，例如平行于Y轴，从而在焦平面11中引起激光束2根据X轴的角位移。设置有振镜电动机16的第二反射镜M-Y可到围绕第二轴旋转移动，例如平行于X轴，从而在焦平面11中引起激光束2根据Y轴的角位移。电机15和16被控制以便执行预定的旋转并且执行在样本的表面上具有限定形状的路径。
在拉曼显微镜检查中，激光扫描光束也是通过样本诱发拉曼发射的激发光束。在后向散射配置中，在入射激发光束的方向上收集拉曼散射光束，其中该发射接收方向是固定的。拉曼光束通常借助拒波滤波器、陷波滤波器、边缘滤波器或布拉格体光栅(或VBG)型的器件与拉曼散射光束分离。已知相对于瑞利散射，拉曼信号的非常低的强度需要优异的信噪比。因此，必须用具有足够照明强度的光束照射样本，并收集拉曼散射光束的最大部分。
然而，在拉曼扫描显微光谱测量中的信噪比似乎有限，这导致增加获取时间以获得完整的图像。此外，样本上的物场还限于比显微镜物镜的标称场减少得多的场。
在本发明的框架中，如下分析在信噪比和扫描场中的限制。
如图3-4所示，第一反射镜M-X和第二反射镜M-Y串联设置在激光源(未示出)和显微镜物镜1之间的激光束2的光路上。显微镜物镜的轴在这里与显微镜的光轴10混同。假设在静止时(即具有零倾斜角度时)第一和第二反射镜M-X、M-Y以这样的方式布置，使得激光束的轴12与显微镜物镜1的光轴10混同，即，激光束的光轴居中并且平行于显微镜物镜1的光轴10。
寻求将样本上的激光束沿着X轴从位于光轴10与显微镜物镜1的焦平面11的交点处的点X0移动到点X2。为了移动激光束2，控制振镜电动机15，使得它引起第一反射镜M-X围绕Y轴的角度倾斜DELTA-X。来自源的入射光束保持不动。在反射镜M-X的表面上反射的光束经受围绕Y轴等于2×DELTA-X的角度的旋转。由第一反射镜M-X反射的光束因此在第二反射镜M-Y的表面上被移动。第二反射镜M-Y再次在显微镜物镜的方向上反射激光束。由第二反射镜M-Y反射的光束在显微镜物镜1的光瞳上成角度地和横向地被移动。在显微镜物镜上的入射激光束的轴相对于显微镜物镜1的光轴10以等于2×DELTA-X的角度被倾斜。因此显微镜物镜1将激光束聚焦在点X2处，点X2位于显微镜物镜1的焦平面和通过物镜的光瞳中心O并且平行于物镜上的入射准直激光束的轴12的直线22的交点处。
类似地，第二反射镜M-Y围绕平行于X轴的轴以旋转角度RY的旋转产生激光束的等于2×DELTA-Y的角位移。因此，第二反射镜M-Y的旋转产生激光束在物镜1的光瞳上的角位移和在Y方向上聚焦的光束的位移。
然而，对于大于阈值的倾斜角度DELTA-X，在图3中观察到位于物镜的光瞳外部的激光束的光线13不在点X2处聚焦。因此，减少了入射激光束在样本上的强度。渐晕现象可以解释在场的边缘上测量的点的信噪比的下降，其对应于大于特定阈值的倾斜角度。对于大于另一个阈值的第一反射镜M-X的倾斜角度，激光束被显微镜物镜的光瞳完全遮挡。
类似的限制来自在显微镜物镜1上的由第二反射镜M-Y对激光束以角度DELTA-Y的倾斜。
类似于单轴扫描系统，具有两个轴的扫描系统因此会受限于在显微镜物镜的光瞳上的由于第一轴和/或第二轴的角位移而引起的渐晕现象。
另一方面，图4示出了激光束在具有两个扫描轴的系统中的另一渐晕效应。图4示出了借助于第一反射镜M-X和第一振镜电动机15以角度DELTA-X倾斜的激光束。在第二反射镜M-Y的表面上激光束的位移使得激光束的光线14位于第二反射镜M-Y的光瞳之外。因此，第二反射镜M-Y不能将光线14反射在显微镜物镜的方向上。因此，该射线14不聚焦在样本上的点X3上。通过外推图4的激光束的倾斜，观察到当倾斜角度DELTA-X大于倾斜角度的第二阈值时，激光束被第二反射镜M-Y的光瞳完全遮挡。
因此，根据第二反射镜M-Y的尺寸，具有两个轴的扫描系统也受限于由于光束相对于第二反射镜M-Y的光瞳的角位移引起的渐晕现象。
类似地，当激光束的直径大于第一反射镜M-X的光瞳的表观直径时，第一反射镜M-X相对于激发激光束的角倾斜可产生渐晕现象。
该分析的结果是，在根据两个轴的扫描显微镜检查设备中，激光束在焦平面中沿着X轴和/或Y轴的位移因此受限于由于第一反射镜M-X的光瞳、第二反射镜M-Y的光瞳、和/或显微镜物镜的光瞳引起的渐晕效应。
更一般地，通过在显微镜检查设备中扫描的激光束的位移在横向场和强度上受限于渐晕现象，所述渐晕现象由于由在激光束的光路上串联布置的不同光学部件形成的光学系统引起，。这些渐晕现象看起来特别是由于扫描反射镜M-X、M-Y和/或显微镜物镜1引起。
然而，在具有两个扫描轴的系统中，在激光束的光路上串联布置的两个反射镜M-X、M-Y的阻碍(encumbrance)使得不可能将第一反射镜和显微镜物镜之间的距离有效地减少到使渐晕效应保持可观的程度。
根据该分析，在使用具有两个光束扫描轴的拉曼显微镜检查设备期间，主要问题是在显微镜物镜1的入口处的光瞳，如关于图3和图4所示的。到达显微镜物镜的光瞳上的光束的一部分13不通过物镜的孔径，因为光束的该部分13被移动超过光瞳的物理限制(图3)。因此，激发激光束的一部分损失。在用于测量拉曼后向散射的配置中，通过光的反向返回的应用，后向散射光束的一部分也被显微镜物镜的光瞳遮挡。激发激光束和拉曼散射光束的强度的降低引起检测到的拉曼散射信号的强度的降低。此外，被第一反射镜M-X反射的光束的另一部分14被偏离到第二反射镜的光瞳之外，并且不被反射到显微镜物镜的方向。同样地，拉曼后向散射光束的一部分被第二反射镜M-Y的边缘遮挡。激发激光束14和对应后向散射光束的该其它部分也引起检测到的拉曼散射信号的减少。此外，在样本的方向上没有反射的光束13和14可以在其它表面上反射，并且因此是寄生光束的源，所述寄生光束也促使降低检测到的拉曼散射信号的信噪比。
现在将结合图5描述在本发明的框架中提出的解决方案的原理。在该图中，激光束的角倾斜是通过围绕显微镜物镜1的入射光瞳的中心O枢转激光束的轴来执行的。因此，在光束的扫描期间，激光束保持居中在显微镜物镜的光瞳上。这种角倾斜使得可以减少渐晕现象，以便限制在入射激光束上的强度损失并且以便增加可以由光束扫描接近的场区。
通过对于每个扫描轴实施两个反射镜获得这种位移，其中两个反射镜串联地设置在光束2的光路上。例如，第一反射镜M-X1以如此方式成角度地倾斜，以便引起在焦平面中跟随X轴的扫描，并且第二反射镜M-X2跟随相同扫描轴X以如此方式成角度地倾斜，以将光束重新置于显微镜物镜1的光瞳的中心。
对于光束的轴12相对于显微镜物镜的光轴10的倾斜角度θ，光束在样本上的焦平面中的位移X通过以下公式计算：
X＝f.tan(θ) (I)
在下表中，对于不同显微镜物镜，光束的位移X根据倾斜角度被从中推导：
Θ(度) 100X 50X 10X
1 31μm 62μm 314μm
1.5 47μm 94μm 471μm
2 63μm 125μm 628μm
2.5 78μm 157μm 785μm
3 94μm 189μm 943μm
表2：根据在物镜上光束的倾斜角度的位移
场景1指示：对于物镜10X，2.2mm的最大光场宽，其对应于场半宽或1.1mm的光束的横向位移X。在表2中，可以观察到，在该物镜10X的轴上居中的光束轴的3度倾斜角度θ使得可以覆盖2×943微米(即约1886微米)的场宽，即，实际上达到光学场宽的极限。然而，通过在反射镜上的反射和该反射镜的1.5度角度的旋转可以获得3度的光束轴的倾斜角度。
图6至18示出了不同的实施例，其使得可以通过围绕显微镜物镜的入射光瞳的中心O枢转激光束而获得跟随一个或两个轴的扫描光束，同时仍保持激光束的中心在显微镜物镜的入射光瞳的中心O上。
图6示出了根据本发明第一实施例的具有一个扫描激光束轴的系统。扫描系统包括第一平面反射镜M-X1和第二平面反射镜M-X2。第一反射镜M-X1和第二反射镜M-X2串联设置在激光束源和显微镜物镜1之间的激光束2的光路上，例如在共焦显微镜的共焦管中。第一反射镜M-X1可围绕例如平行于Y轴的轴旋转移动。第二反射镜M-X2可围绕更优选地平行于第一反射镜M-X1的轴并因此平行于Y轴的轴旋转移动。有利地，第一电动机21控制第一反射镜M-X1的旋转，并且第二电动机22控制第二反射镜M-X2的旋转。电动机21、22例如是振镜电动机或步阶式电动机。优选地，控制系统(未示出)驱动第一反射镜M-X1和第二反射镜M-X2的组合角位移。
以说明性而非限制性的方式，图6示出了第一反射镜M-X1和第二反射镜M-X2的不同倾斜角度。
在扫描系统的反射镜的第一取向中，第一反射镜M-X1具有倾斜角度RX1-0，第二反射镜M-X2具有倾斜角度RX2-0。在反射镜的该第一取向中，入射激光束2在第一反射镜M-X1上以方向120上被反射，然后在第二反射镜M-X2上以方向200上被反射。第一反射镜M-X1的倾斜角度RX1-0和第二反射镜的RX2-0使得在方向200上的激光束在显微镜物镜1的光轴10上对准并且居中在显微镜物镜1的入射光瞳的中心O上。在这个第一配置中，显微镜物镜将激光束聚焦在焦点X0-0。通过反向返回，由点X00后向散射的光束沿着轴200传播，由第二反射镜M-X2反射，然后在入射激光束2的方向上被第一反射镜M-X1反射。
在图6所示的反射镜的第二取向中，第一反射镜M-X1具有倾斜角度RX1-1，而第二反射镜M-X2具有倾斜角度RX2-1。在反射镜的该第二取向中，轴12的入射激光束在第一反射镜M-X1上以方向121被反射，然后在第二反射镜M-X2上以方向211被反射。第一反射镜M-X1的倾斜角度RX1-1和第二反射镜的倾斜角度RX2-1使得在方向211上的激光束相对于显微镜物镜1的光轴被倾斜，同时仍然保持居中在显微镜物镜1的入射光瞳的中心O上。有利地，第一反射镜M-X1产生光束的轴的倾斜，并且第二反射镜M-X2将光束211的倾斜轴重新定位在物镜的光瞳的中心上。在该第二配置中，显微镜物镜1将激光束聚焦在点X11处。因此获得从样本上的点X00到点X11的光束的轴的角位移。通过反向返回，由点X11后向散射的在方向211上传播的光束依次在方向121上被反射镜M-X2，然后在入射光束2的方向上被反射镜M-X1反射。
类似地，在图6所示的反射镜的第三取向中，第一反射镜M-X1具有旋转角度RX1-2，第二反射镜M-X2具有旋转角度RX2-2。在反射镜的该第三取向中，入射激光束2在第一反射镜M-X1上以方向122被反射，然后在第二反射镜M-X2上以方向222被反射。第一反射镜M-X1的倾斜角度RX1-2和第二反射镜的RX2-2使得在方向222上的激光束相对于显微镜物镜1的光轴被倾斜，同时仍然保持居中在显微镜物镜1的入射光瞳的中心O上。因此，第一反射镜M-X1产生光束的轴的倾斜，并且第二反射镜M-X2将光束222的倾斜轴重新定位在物镜的光瞳的中心上。在该第三配置中，显微镜物镜1将激光束聚焦在点X22。因此获得了光束的轴到样本上的点X22的角位移。通过反向返回，由点X22后向散射的在方向222上传播的光束依次在方向122上被反射镜M-X2，然后在入射光束2的方向上被反射镜M-X1反射。
因此，第一反射镜M-X1的旋转角度和第二反射镜M-X2的旋转角度的组合使得可以获得保持居中在显微镜物镜的光瞳的中心O上的光束的角偏移。
光束的轴211相对于光轴10的倾斜角度θ等于第二反射镜M-X2的旋转角度RX2的两倍。
为了根据反射镜M-X1的倾斜计算反射镜M-X2的旋转角度，使用以下等式：
RX2＝((ArcSIN(-B x SIN(2x RX1)/A)–2x RX1+π/2)/2–π/4 (II)
其中：RX1表示反射镜M-X1的旋转角度(以弧度表示)，
RX2表示反射镜M-X2的旋转角度(以弧度表示)；
A是光线的会聚距离(以mm表示)或物镜1的焦距；以及
B是反射镜M-X1和M-X2之间的距离(以mm表示)。
在角度RX1、RX2很小(在实践中小于几度)的特定情况下，可以显示出在两个反射镜的移动之间存在线性关系。在这种情况下，反射镜的旋转的电子控制系统也是线性系统，并且因此是简单的。
最后，在B等于A的特定情况下，反射镜M-X1和反射镜M-X2之间的旋转角度的比率等于2，并且这与倾斜角度θ无关。
电子系统可以被配置为共同地驱动第一反射镜M-X1的旋转角RX1和第二反射镜M-X2的旋转角RX2，以便获得在显微镜物镜1的轴上倾斜的光束的轴的中心。电子系统根据反射镜M-X1和M-X2的配置以及距离A和B来适配。
如在表2中所表示的，限于几度的扫描激光束的轴12的倾斜角度θ足以在最常见物镜的所有光场上成角度地移动光束。然而，如上所述，第二反射镜的旋转角度RX2等于光束的倾斜角度θ的一半。并且第一反射镜的旋转角度RX1在绝对值上等于旋转角度RX2的两倍(应用上述近似公式(III))。因此，第一和第二反射镜的旋转角度被限制为几度，以便覆盖显微镜物镜的整个光场，同时仍保持居中在显微镜物镜的光瞳上。然而，第一反射镜的低旋转角度使得可以限制光束在第二反射镜的面上的位移振幅，并从而限制渐晕效应。
可以观察到，反射镜M-X1和M-X2的尺寸可以不同。优选地，第二反射镜M-X2具有比第一反射镜M-X1更大的尺寸。实际上，第一反射镜M-X1居中于保持固定方向的入射激光束，而第二反射镜M-X2在第一反射镜M-X1旋转期间抵消激光束在其表面上的位移。
图6中详细描述的对于光束的角位移(X)的轴的原理被推广到根据两个轴(XY)的扫描系统。为此，例如，在光束的光路上串联地具有第一光学系统和第二类似光学系统，该第一光学系统具有例如围绕轴Y旋转移动的两个反射镜，以便产生根据第一方向X的位移(如在图6中详述的)，该第二类似光学系统具有例如围绕轴X旋转移动的两个反射镜，以便产生根据横向方向Y的位移。四个反射镜以这样的方式布置，使得由第一两个反射镜对光束的角位移保持居中在具有两个反射镜的第二光学系统的入射光瞳上，并且以这样的方式布置，使得根据一个、另一个或两个横向轴的角位移保持居中在显微镜物镜的入射光瞳的中心O上。
优选地，显微镜是共焦型的，并且光束扫描系统有利地布置在共同激光-检测路径上，并且更精确地布置在注入拒波滤波器18和显微镜物镜1之间。
替代地，在不太有利的非共焦显微镜中，光束扫描系统仅布置在激光路径上。
图7示出了根据本发明第二实施例的包括沿着两个扫描轴的扫描激光束装置的显微镜检查设备的侧视图。激光束扫描显微镜检查设备包括激光源20、滤波轮30、具有在激光束的路径上的反射镜32的光学系统、扩束器31、注入拒波滤波器18。源激光器2发射包括一个或多个波长的激光束2。有利地，滤波轮30使得可以对于激发光束选择特定的波长。显微镜检查设备还包括具有中心O的入射光瞳的显微镜物镜1。样本保持器3支撑布置在物镜1的焦平面中的样本4。有利地，显微镜检查设备包括在与显微镜物镜1的焦平面光学共轭的平面中布置的聚焦透镜33和共焦孔34。图7的设备包括光谱仪35、检测器36和具有在拉曼散射光束的路径上的反射镜38的另一光学系统。最后，图7的设备包括光学系统19和观察相机9。图7的设备特别适用于拉曼显微光谱测量。
更具体地，显微镜检查设备包括用于激光束的角位移或扫描的光学装置29。用于光束扫描的光学装置29设置在注入拒波滤波器18和显微镜物镜1之间。
具有两个扫描轴(X，Y)的用于光束扫描的光学系统29包括在激光束2的光学路径上串联设置的平面反射镜M-Y1、平面反射镜M-X1、平面反射镜M-Y2和平面反射镜M-X2。反射镜M-X1、M-X2、M-Y1和M-Y2分别由致动器21、22、23和24致动。如上面详细描述的，反射镜M-X1和M-X2围绕平行于Y轴的轴的组合旋转运动使得可以将激光束的轴通过围绕平行于Y轴的轴的旋转并穿过物镜光瞳中心O而以角度移动。类似地，反射镜M-Y1和M-Y2围绕平行于X轴的轴的组合旋转运动使得可以将激光束的轴通过围绕平行于X轴的轴的旋转并且传过显微镜物镜的光瞳的中心O而以角度移动。因此，具有反射镜M-X1、M-X2、M-Y1、M-Y2的光学系统使得可以根据样本的较大表面上的一个或两个横向方向成角度地移动激光束，而没有激光束的渐晕，同时仍保持居中在显微镜物镜的光瞳上。
在图7中，通过示例的方式，使用扩束器31。扩束器是使得可以倍增光束的大小的光学系统。扩束器例如由放大率大于1的无焦光学系统形成。也可以使用在光学扫描29的上游在源光束的光路上串联布置的两个扩束器。
回顾光学的以下概念：
1)根据以下公式，例如显微镜的物镜的数值孔径(NA)取决于它的透镜的直径和到焦点的距离：
2)当激光进入显微镜物镜1时，它聚焦在距离焦点的距离处的一个点处。该点的大小可以取决于三个因素：激光束的大小、物镜的透镜直径及它的数值孔径(NA)。
在激光束可以覆盖透镜的所有孔径的情况下，即，当光束的直径大于或等于透镜直径时，焦点处的光束的大小仅取决于透镜的直径和它的数值孔径(NA)。在这种情况下，焦斑的最小直径由艾利(Airy)公式定义为等于：
(0.51*λ)/NA (IV)
通过应用公式(IV)，在激光束的直径大于或等于透镜直径的情况下，透镜的直径越大，焦斑越小。
在激光束的直径小于透镜直径的情况下，激光束的直径越大，焦斑越小，具有作为公式(IV)的极限。也可以通过考虑透镜的有效直径由激光束的直径限定来应用公式(IV)。
扩束器31的效果是增大激光束在物镜的入射光瞳上的直径。通过应用衍射极限来确定在物镜的焦平面中的光束的大小。因此，准直激光束的直径在物镜的入射光瞳上越大，在焦平面中光束的尺寸越小。因此，使用扩束器使得可以增加显微镜检查设备的空间分辨率和对于共焦显微镜的拉曼信号的信噪比。事实上，Airy斑越小，在小的共焦孔中可以耦合的光越多。在具有显微分辨率的成像应用中，因此可以更快地进行成像。
选择扩束器的放大率以便以如此方式增加激光束的直径，即使得在激光束的1/e2处的直径达到所使用的显微镜物镜的光瞳的直径，这对应于在空间分辨率和信噪比之间的折衷。
有利地，使用不同类型的扩束器：具有固定放大率的扩束器和具有可变放大率的扩束器。例如，两个扩束器串联设置在入射光束2的路径上，第一扩束器具有等于x2的固定放大率，具有可变放大率的第二扩束器具有x1至x4.5的可变放大率。
例如，物镜10X具有9mm的直径，物镜50X具有5.4mm的直径，物镜100X具有3.24mm的直径。
具有可变放大率的扩束器使得可以在具有几个显微镜物镜的显微镜检查设备中根据所使用的显微镜物镜的光瞳的直径来调整激光束的直径。
有利地，具有可变放大率的扩束器是在可见光范围(400-700nm)中的消色差类型的。优选地，具有可变放大率的扩束器31是机动的。有利地，紧接在扩束器之后的光路上布置的自动对准镜，使得可以校正具有可变放大率的扩束器的指向误差。
由激光源发射的激光束的直径可以例如借助于Gentec品牌“激光束成像器(LaserBeam Image)”的照相机并借助于它的处理软件来测量。激光束的横向尺寸通过使用所谓的4Sigma方法测量，没有扩束器：根据X轴为1183μm，根据Y轴为1261μm。
然后通过与激光束的直径相同的方法在具有可变放大率的扩束器的输出处进行测量，其中放大率根据制造商的数据被设置为最大(X4.5)。激光束的横向尺寸在扩束器的输出处测量：根据X轴为5494μm，根据Y轴为5346μm。这些测量对应于4.44倍的平均增加，其与制造商所指示的值(其为4.5)相一致。
在共焦型显微镜检查设备中，扩束器的使用特别容易，其中扩束器31可以直接插入到显微镜的共焦管中，而不用任何其他光学适应，其中扩束器仅被布置在激光路径上或在共同的拉曼激光信号路径上。
扩束器31和光束扫描系统29的组合通过围绕显微镜物镜的光瞳的中心枢转使得可以从共轭优点中获益，以便增加光束在样本上的角位移区域的宽度同时仍然增加激光束在焦点处的空间分辨率。这种组合因此使得可以解决现有技术的扫描激光束系统的两个主要限制。
根据任何实施例的用于扫描激光束显微镜检查的设备有利地用于拉曼显微光谱测量的应用中。在该应用中，用于成角度地移动光束的系统被设置在激发激光束的光路上，更优选地设置在注入拒波滤波器和显微镜物镜之间。在激发光束上，注入拒波滤波器18将入射激光束2引导到在显微镜物镜1的方向上的具有反射镜的扫描系统29。具有例如M-X1、M-Y1、M-X2、M-Y2的反射镜29的扫描系统使得可以根据一个或两个扫描轴在样本4上成角度地移动激光束。在后向散射配置中，显微镜物镜1收集包括在入射激光束的波长处的瑞利散射的后向散射光束和在波长上偏移的拉曼散射光束。由显微镜物镜1收集的光束被传送到具有反射镜(M-X1、M-Y1、M-X2、M-Y2)的扫描系统29，然后到注入拒波滤波器18。通过构造，后向散射光束遵循入射激光束的反向光路，并因此精确地在入射激光束的方向上离开具有反射镜的扫描系统，该方向保持固定而与扫描光束在显微镜物镜上的倾斜角无关。有利地，注入拒波滤波器18在空间上将瑞利散射光束与拉曼散射光束分离。具有反射镜38的光学系统然后将拉曼散射光束引导到拉曼光谱仪35，该拉曼光谱仪35在检测器36的方向上光谱分离拉曼散射光束，以便检测和分析拉曼后向散射信号。
该拉曼显微光谱测量设备使得可以分析样本的更大表面，同时仍然提高在样本上的激发激光束的信噪比和空间分辨率。
在图7的包括(陷波、边缘、分束器或落射荧光滤波器类型的)注入拒波滤波器18和共焦孔34的设备中，扫描反射镜被布置在共焦路径上，使得可以保持在共焦显微镜的配置中。另一扩束器可以插入在共焦路径上，以便正确地覆盖物镜的光瞳。
图7的设备还包括设置有聚焦透镜19的照相机9。分束器8，例如立方体分束器，被布置在具有反射镜的光学系统29和显微镜物镜1之间的激光束的光路上。该分束器8使得可以将通过在样本4上的反射和/或散射形成的光束7引导到照相机，以如此方式来形成样本的表面和/或激光束的图像。有利地，该设备还包括白光源(未示出)，其中白光束插入在显微镜的光轴上，例如在分束器8和显微镜物镜1之间，以如此方式来通过白光照明样本4的物场。通过白光的这种照亮使得可以通过反射和/或散射经由照相机9更好地观测样本4。以这种方式，照相机9使得可以在照相机的光场中在激光束的角位移期间同时观察样本和激光束的位置。有利地，照相机的物镜的放大率以如此方式被选择，以允许激光束的角位移的整个区域和/或显微镜物镜的整个光场的可视化。在替代方案中，照相机的物镜是可变焦物镜。
图8示出了根据本发明第二实施例的第一替代方案的具有两个轴的光束扫描系统的顶视图。在该替代方案中，入射激光束2被第一反射镜M-X1、第二反射镜M-X2、第三反射镜M-Y1、然后第四反射镜M-Y2依次引导和反射，其中被第四反射镜M-Y2反射后的光束的轴垂直于图8的平面。图9经由光线跟踪图示出了图8的具有两个扫描轴的光学系统。反射镜的这种布置使得可以使用水平激光束源来形成具有接近显微镜物镜1的轴10的轴12的扫描激光束，该光轴10大体上是垂直的。该替代方案的优点是非常紧凑并且避免必须添加额外的平面反射镜。
图10和11分别示出了根据本发明的第二实施例的在具有激光束的两个扫描轴的系统中反射镜的配置的第二替代方案的顶视图和侧视图。在该替代方案中，入射激光束2被平面反射镜M-X1、平面反射镜M-Y1、平面反射镜M-X2和平面反射镜M-Y2依次反射。激光束2在第一反射镜M-X1上的入射角被以如此方式选择，即相对于反射镜M-X1的表面的法线小于约45度、并且更优选地小于22.5度。有利地，在其它反射镜M-Y1、M-X2和M-Y2上的入射角也被选择为尽可能低，以如此方式来增加反射镜的表观表面。另外，限制入射角使得可以减少激光束在反射镜M-X1、M-Y1、M-X2和M-Y2中的每一个上的表观直径或扩展。因此，该替代方案使得可以使用具有更宽直径的入射激光束2，这使得可以特别地提高扫描显微镜的空间分辨率。具有闭合角度的该替代方案还使得可以减少由于反射镜的倾斜引起的畸形的效应。实际上，根据两个轴成角度对称地扫描的45度倾斜的反射镜在两个轴之间产生具有作为2的平方根的比率的矩形图形。这可以特别地应用于具有两个轴的反射镜，其具有音圈型致动器。
图12和13分别示出了根据本发明的第二实施例的在具有激光束的两个扫描轴的系统中的反射镜的配置的第三替代方案的顶视图和侧视图。在该替代方案中，入射激光束2被平面反射镜M-X1、平面反射镜M-Y1、平面反射镜M-X2和平面反射镜M-Y2依次反射，扫描光束的轴12位于在总体上平行于入射光束2的方向的方向上。这种替代方案使得可以折回激光扫描光束，并且因此减少光束扫描光学系统的阻碍。
图14和15分别示出了根据本发明的第二实施例的在具有两个扫描激光束轴的系统中的反射镜的配置的第四替代方案的顶视图和侧视图。在该替代方案中，入射激光束2被平面反射镜M-X1、平面反射镜M-Y1、平面反射镜M-X2，平面反射镜M-Y2和平面反射镜5依次反射，以便将该光束引导到显微镜物镜1。该替代方案允许通过折回扫描激光束节省空间并且减少反射镜上光束的入射角，这使得可以减少扩散和/或增加激光束的直径。
图16至18示出了根据本发明第三实施例的根据两个扫描轴的激光束扫描系统。图16是第三实施例的第一替代方案的顶视图，图17是侧视图。图18示出了第三实施例的第二替代方案的透视图。
在本实施例中，使用第一平面反射镜M-XY1和第二平面反射镜M-XY2。第一反射镜M-XY1安装在具有两个旋转轴的致动器25上，例如压电型或音圈(移动线圈或音圈)的。因此，第一致动器25使得可以围绕轴X和/或围绕轴Y执行旋转。优选地，第一致动器25围绕X轴的旋转轴和该第一致动器25围绕Y轴的旋转轴在位于第一反射镜M-XY1的表面附近的点处交叉。同样，第二平面反射镜M-XY2安装在具有两个旋转轴的致动器26上，例如压电型或音圈的，致动器26使得可以围绕轴X和/或围绕Y轴执行旋转。优选地，第二致动器26围绕X轴的旋转轴和该第二致动器26围绕Y轴的旋转轴在位于第二反射镜M-XY2的表面附近的另一点处交叉。围绕每个轴的旋转运动在第一致动器和第二致动器之间以这样的方式组合，使得在两个反射镜M-XY1和M-XY2上反射的光束围绕在显微镜物镜的光瞳的中心O上对准的点枢转。这种配置使得可以将反射镜的数量减少到仅两个反射镜，而不是如上述实施例中的四个。反射镜数量的减少使得可以将更多的激光带到在样本上并且收集更多的拉曼散射光，因此更快地获得图像。此外，该第三实施例使得可以使用更大尺寸的反射镜，其允许在更大振幅的激光束的角位移和X、Y和/或Z中更好的空间分辨率。最后，该第三实施例使得可以使用更厚的反射镜，例如具有更好效率的介电反射镜。
相比之下，在称为duoscan的现有光束扫描系统中，其中反射镜具有小尺寸，并且以可移动的方式安装，以使得可以收集更多的拉曼流并且不会使观察相机的场渐晕。相反，通过本发明的系统，反射镜不限制拉曼信号的收集或观察相机的图像的场，并且不需要安装在可移动的支撑件上。因此简化了安装。
在图16-17所示的第一替代方案中，入射激光束2的轴总体上平行于在具有反射镜的光学系统的输出处的扫描激光束的轴12。
在图18所示的第二替代方案中，入射激光束2的轴总体上横向于在具有反射镜的光学系统的输出处的扫描激光束的轴12。
该第三实施例的优点是将所使用的反射镜的数量减少到两个，而不是在前述实施例中的四个，这减少了在激光扫描光束方面和所收集的信号方面的强度损失。由此，阻止使用比在关于图8-15描述的实施例中使用的反射镜M-X1、M-X2、M-Y1和M-Y2更大的反射镜M-XY1和M-XY2的可能性。
该第三实施例的另一个优点是具有极度减少的阻碍。
特别有利地，反射镜M-X1、M-Y1、M-X2、M-Y2、M-XY1和M-XY2是介电类型的，其中介电处理适于增加反射效率。优选地，介电反射镜具有宽的光谱带宽(例如325nm-1100nm、或325-1700或325-2200nm)，这使得可以对从紫外(UV)到近红外(NIR)的整个光谱使用相同反射镜。
用于扫描激光束的系统和方法可以与不同的部件组合以提供附加优点。
然而，以高扫描速度(对于音圈类型的致动器或扫描器约30Hz)，各种扫描器可能受到不受控制的相移，在物镜的光瞳的中心O上的重新定位不再起作用，然后激光扫描是不规则的并且渐晕。用于校正该缺陷并且同时仍以较高扫描速度(即高达几百Hz)操作的手段是通过使用来自于通常设置有每个扫描器的第一反射镜(例如M-X1或M-XY1)的位置传感器的信号来设置锁相环，以便控制第二反射镜(M-X2或M-XY2)的控制信号的相位，并且这用于每个扫描轴。
特别有利地，在光束的角位移期间，拉曼散射信号在几个测量点上被集成，以如此方式来记录在几个点上的平均拉曼信号，如在专利文献WO002008128971A2中所描述的。根据本发明的实施例的一个或两个轴的扫描的使用使得可以扩展样本上的扫描区域和/或增加拉曼显微光谱测量的空间分辨率和/或增加拉曼光谱测量的信噪比。
在扫描激光束拉曼显微光谱测量设备中使用扩束器的情况下，扩束器被布置在激发激光束的路径上，但是在拉曼散射光束的光路之外。有利地，扩束器布置在激光源和分束滤波器之间，例如注入拒波滤波器或陷波滤波器类型。
扫描光束系统与不同显微镜物镜兼容。特别地，可以使用具有反射镜的显微镜物镜，例如Cassegrain或Schwartzfield类型的物镜。具有反射镜的物镜具有消色差的优点，其允许具有更好精度的光谱测量。因此更容易分离激发激光束和拉曼散射光束。另一方面，在显微镜检查中，显微镜物镜的消色差在与激发激光器相同的点处提供轴向检测，这在透明样本的情况下特别重要。
具有两个轴的扫描使得可以更好地将激光与Cassegrain型的物镜耦合，因为可以照射主反射镜的边缘而不是中心。实际上，穿过主反射镜中心的激光光线被回射，并且不到达待分析的样本，导致相当大的损失。因此，本发明有利地使得可以通过使用Cassegrain或Schwartzfield型的物镜将更多的激光传送到样本。
本发明的扫描装置还可以有利地与诸如例如在专利文献WO/2013/014379A中所描述的圆锥透镜系统组合，以形成圆锥或圆柱形激光束。优选地，圆锥或圆柱形光束的孔径足以覆盖物镜的光瞳，从而使得可以增加输出光束的强度。该装置还可以替换圆锥透镜系统，例如在文献FR1156687中所描述的，以便使用快速扫描形成中空圆柱形激光束，所述中空圆柱形激光束具有在圆柱体的轴上不具有或具有非常少的光的任何部分(例如环形或其它)。这特别地具有抑制中心射线和仅利用在轴外部倾斜的光线照射样本的优点。这种类型的照明使得可以基本减少衬底对共焦拉曼信号的贡献。这种类型的照明还使得可以基本减少被称为纵向球面像差的光学像差，其在指数环境中的折射期间出现并且导致共焦显微镜的空间分辨率的降低。
图19-22示出了通过根据关于图7描述的实施例的激光扫描显微镜检查设备获得的扫描宽度的各种测量。
代替样本4，根据NIST(国家标准和技术研究所)的要求，布置由UKAS(英国认证服务)认证的校准图案。该测试图案包括具有间隔每0.01mm的刻度(graduation)的20mm长的标度(scale)。该图案使得可以在根据平行于图案的轴的轴的扫描期间测量在显微镜物镜的焦平面中的光束的最大位移。
为了在扫描显微镜检查设备中根据两个轴测量位移的区域，通过根据X轴然后根据Y轴取向图案来对最大位移进行连续测量。
图19示出了在根据平行于X轴的轴的扫描期间，在设置有显微镜物镜10X的扫描光束显微镜检查设备上标定的图案的测量，其中图案被取向为平行于X轴。更准确地，曲线50表示根据光束沿X轴在图案上的角位移，对在激光的波长处反射的信号的强度的测量。图19中圈出的局部最大值40、41、...49对应于激光在图案的标度条上的反射。观察到，最大值40、41、...49间隔50μm。根据X轴在图案上光束的扫描宽度对应于第一最大值40和最后最大值49之间的距离，即约450微米。此外，曲线50的平均水平表示光学系统的均匀性。平均水平越高越恒定，测量越好。
图20示出在根据平行于Y轴的轴的扫描期间，在具有相同显微镜物镜10X的相同显微镜检查设备上对相同图案的测量，其中图案被取向为平行于Y轴。曲线150表示根据光束沿Y轴在图案上的角位移，对在激光的波长处反射的信号的强度的测量。图20中圈出的局部最大值140、141、...149对应于激光在图案标度条上的反射。检查到最大值140、141、...149间隔50μm。光束根据Y轴在图案上的扫描宽度对应于第一最大值140和最后最大值149之间的距离，即，约450微米。
在观察相机上的屏幕捕获使得可以确认根据X轴的扫描宽度为大约460μm，根据Y轴的扫描宽度为大约470μm。
与通过现有技术的设置有物镜10X的Duoscan设备获得的约200微米的扫描宽度相比，本发明的扫描系统因此使得可以在每个方向X、Y上将场宽增加约2.2倍，并因此将扫描的表面增加约4.9倍。
图21示出了在根据平行于X轴的轴的扫描期间，在设置有显微镜物镜50X的扫描光束显微镜检查设备上标定的相同图案的测量，其中图案被取向为平行于X轴。在图21的曲线250上圈出的局部最大值240、241、...248对应于激光在图案的标度条上的反射。观察到，最大值241、...248间隔约10μm。光束根据X轴在图案上的扫描宽度对应于第一最大值241和最后最大值248之间的距离，即约70微米。
图22示出了在根据平行于Y轴的轴的扫描期间，在具有相同显微镜物镜50X的相同显微镜检查设备上对相同图案的测量，其中图案被取向为平行于Y轴。在图22的曲线350上圈出的局部最大值341、342、...348对应于激光在图案的标度条上的反射。观察到，最大值341、342...348间隔约10μm。光束根据Y轴在图案上的扫描宽度对应于第一最大值341和最后最大值348之间的距离，即约70微米。
在观察相机上的屏幕捕获使得可以确认采用物镜50X根据X轴的扫描宽度为约70μm，根据Y轴的扫描宽度为约70μm。
与通过现有技术的设置有物镜50X的Duoscan设备获得的扫描宽度相比，本发明的扫描系统因此使得可以将场宽在每个方向X、Y上增加约2.7倍，并因此将扫描的表面增加约7.6倍。
替代地，代替使用具有一维标度的测试图案，使用由0.5*0.5mm的正方形组成的二维平面测试图案，所述0.5*0.5mm的正方形本身包括0.01*0.01mm的正方形。该正方形图案用于形成通过反射扫描的表面的图像。该图像使得可以观察图案的正方形并观察激光束在图案上的扫描。有利地，用白光照射正方形图案以便允许成像，无论激光束的位置如何。
采用物镜10X，估计光束的位移的程度为约440μm*450μm。在扫描边缘上的图像变暗是由于安装在扫描器上的反射镜边缘上的渐晕，其中当光束到达反射镜的边缘或物镜的光瞳的边缘时，光束的强度减少。
对于物镜50X，观察到采用正方形图案，可以使用的扫描区域为约80*75μm。

Claims (15)

1.一种用于光束扫描显微镜检查的设备，包括：
-适配于发射光束(2)的至少一个光源(20)；
-具有入射光瞳的显微镜物镜(1)，所述显微镜物镜(1)根据所述显微镜检查设备的纵向光轴(10)来布置，所述光瞳具有在所述纵向光轴(10)上的中心(O)，并且所述显微镜物镜(1)适配于将所述光束(2)聚焦在横向于所述纵向光轴(10)的物平面(11)中；
-用于根据在所述物平面(11)中的至少一个空间方向(X，Y)将所述光束(2)角位移的装置；
其特征在于，用于将所述光束(2)角位移的所述装置包括：
-第一反射光学装置(M-X1，M-XY1)和第二反射光学装置(M-X2，M-XY2)，其串联设置在所述光源(20)和所述显微镜物镜(1)之间的所述光束(2)的光路上，
-第一角度倾斜装置(21，25)，其适配于根据第一预定旋转角度(RX1)倾斜所述第一反射光学装置(M-X1，M-XY1)，
-第二角度倾斜装置(22，26)，其适配于根据基于所述第一预定旋转角度(RX1)的第二预定旋转角度(RX2)倾斜所述第二反射光学装置(M-X2，M-XY2)，以如此方式通过围绕所述显微镜物镜(1)的所述光瞳的中心(O)枢转来使所述光束(2)的轴(12)成角度地倾斜，所述光束(2)在所述光束的轴(12)相对于所述纵向光轴(10)的倾斜角范围内保持居中在所述显微镜物镜(1)的光瞳的中心(O)上，以如此方式来根据在所述物平面(11)中的所述至少一个方向(X)移动所述光束，
-第三反射光学装置(M-Y1，M-XY1)和第四反射光学装置(M-Y2，M-XY2)，其串联设置在所述光源和所述显微镜物镜(1)之间的所述光束(2)的光路上，
-第三角度倾斜装置(23，25)，其适配于根据第三预定旋转角度(RY3)倾斜所述第三反射光学装置(M-Y1，M-XY1)，以及
-第四角度倾斜装置(24，26)，其适配于根据基于所述第三预定旋转角度(RY3)的第四预定旋转角度(RY4)倾斜所述第四反射光学装置(M-Y2，M-XY2)，以如此方式通过围绕所述显微镜物镜(1)的所述光瞳的中心(O)枢转来使所述光束(2)的轴(12)成角度地倾斜，所述光束(2)在所述光束(2)的轴(12)相对于所述纵向光轴(10)的倾斜角范围内保持居中在所述显微镜物镜(1)的光瞳的中心(O)上，以如此方式来根据在所述物平面(11)中的另一方向(Y)移动所述光束，
其中，所述第一反射光学装置(M-XY1)和所述第三反射光学装置(M-XY1)由同一第一反射镜(M-XY1)形成，和/或其中所述第二反射光学装置(M-XY2)和所述第四反射光学装置(M-XY2)由同一第二反射镜(M-XY2)形成，其中，所述第一反射镜(M-XY1)安装在具有两个旋转轴的致动器(25)上，和/或其中所述第二反射镜(M-XY2)安装在具有两个旋转轴的致动器(26)上。
2.根据权利要求1所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，其中，所述第一反射镜(M-XY1，M-X1)的致动器(21，25)包括提供位置信号的位置传感器，并且其中，所述第二反射镜(M-XY2，M-X2)的致动器(22，26)包括位置传感器，其中所述设备包括适配于基于所述第一反射镜(M-XY1)的致动器(21，25)的位置信号驱动所述第二反射镜(M-XY2)的致动器(22，26)的控制信号的锁相环系统，和/或其中，所述第三反射镜(M-Y1)的致动器(23)包括提供另一位置信号的另一位置传感器，并且其中所述第四反射镜(M-Y2)的致动器(24)包括另一位置传感器，其中所述设备包括适配于基于所述第三反射镜(M-Y1)的致动器(23)的位置信号驱动所述第四反射镜(M-Y2)的致动器(24)的控制信号的锁相环系统。
3.根据权利要求1所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，其中，所述第二预定旋转角度(RX2)是所述第一预定旋转角度(RX1)、在所述第一反射光学装置(M-X1，M-XY1)和所述第二反射光学装置(M-X2，M-XY2)之间的距离B和在所述第二反射光学装置(M-X2，M-XY2)与所述显微镜物镜(1)的入射光瞳的中心之间的距离A的函数。
4.根据权利要求1所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，其中，所述至少一个光源(20)包括激光源和/或发光二极管类型中的一个或多个源。
5.根据权利要求1所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，进一步包括设置在所述光源(20)和所述显微镜物镜(1)之间的扩束器(31)，其中，所述扩束器(31)具有固定的和/或可变的放大率。
6.根据权利要求1所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，其进一步包括观察相机(9)，所述观察相机适配于形成所述显微镜物镜的所述物平面(11)的图像和/或观察通过光束扫描的扫描样本的区域。
7.根据权利要求1所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，其中，所述显微镜检查设备包括设置在与所述物平面(11)光学共轭的平面中的共焦孔(34)，并且包括设置在所述至少一个光源和所述显微镜物镜之间的用于准直所述光束(2)以便形成准直光束的装置，所述第一反射光学装置(M-X1，M-XY1)和所述第二反射光学装置(M-X2，M-XY2)串联设置在所述准直光束的光路上。
8.根据权利要求1所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，其中，所述显微镜检查设备与拉曼光谱仪、相干反斯托克斯拉曼光谱仪、荧光光谱仪、光致发光光谱仪或阴极发光光谱仪组合，所述拉曼光谱仪、所述相干反斯托克斯拉曼光谱仪、所述荧光光谱仪、所述光致发光光谱仪或所述阴极发光光谱仪适配于测量和分析基于所述光束的角位移的通过所述光束(2)在样本上的反射、透射和/或散射的信号。
9.一种用于光束扫描显微镜检查的方法，包括以下步骤：
-借助于光源发射光束(2)；
-在第一反射光学装置(M-X1，M-XY1)上然后在第二反射光学装置(M-X2，M-XY2)上光学反射所述光束(2)，所述第一反射光学装置(M-X1，M-XY1)和所述第二反射光学装置(M-X2，M-XY2)串联设置在所述光源和显微镜物镜(1)之间的所述光束(2)的光路上，
-根据第一预定旋转角度(RX1)倾斜所述第一反射光学装置(M-X1，M-XY1)，
-根据基于所述第一预定旋转角度(RX1)的第二预定旋转角度(RX2)倾斜所述第二反射光学装置(M-X2，M-XY2)，以如此方式在所述光束(2)的轴(12)相对于纵向光轴(10)的倾斜角的范围内通过围绕所述显微镜物镜(1)的光瞳的中心(O)枢转来成角度地倾斜所述光束(2)的轴(12)；
-借助于所述显微镜物镜(1)将所述光束(2)聚焦在物平面(11)中，以如此方式来根据在所述物平面(11)中的至少一个空间方向(X)移动所述光束(2)，
-在第三反射光学装置(M-Y1，M-XY1)上然后在第四反射光学装置(M-Y2，M-XY2)上光学反射所述光束(2)，所述第三反射光学装置(M-Y1，M-XY1)和所述第四反射光学装置(M-Y2，M-XY2)串联设置在所述光源和所述显微镜物镜(1)之间的所述光束(2)的光路上；
-根据第三预定旋转角度(RY1)倾斜所述第三反射光学装置(M-Y1，M-XY1)，
-根据基于所述第三预定旋转角度(RY1)的第四预定旋转角度(RY2)倾斜所述第四反射光学装置(M-Y2，M-XY2)，以如此方式在所述光束(2)的轴(12)相对于纵向光轴(10)的倾斜角的范围内通过围绕所述显微镜物镜(1)的光瞳的中心(O)枢转来成角度地倾斜所述光束(2)的轴(12)；以及
-借助于所述显微镜物镜(1)将所述光束(2)聚焦在所述物平面(11)中，以如此方式来根据在所述物平面(11)中的至少一个其它空间方向(Y)移动所述光束(2)，
-其中，所述第一反射光学装置(M-XY1)和所述第三反射光学装置(M-XY1)由同一第一反射镜(M-XY1)形成，和/或其中所述第二反射光学装置(M-XY2)和所述第四反射光学装置(M-XY2)由同一第二反射镜(M-XY2)形成，其中，所述第一反射镜(M-XY1)安装在具有两个旋转轴的致动器(25)上，和/或其中所述第二反射镜(M-XY2)安装在具有两个旋转轴的致动器(26)上。
10.根据权利要求2所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，其中，所述第二预定旋转角度(RX2)是所述第一预定旋转角度(RX1)、在所述第一反射光学装置(M-X1，M-XY1)和所述第二反射光学装置(M-X2，M-XY2)之间的距离B和在所述第二反射光学装置(M-X2，M-XY2)与所述显微镜物镜的入射光瞳的中心之间的距离A的函数。
11.根据权利要求2所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，其中，所述至少一个光源包括激光源和/或发光二极管类型中的一个或多个源。
12.根据权利要求2所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，进一步包括设置在所述光源和所述显微镜物镜之间的扩束器，其中，所述扩束器具有固定的和/或可变的放大率。
13.根据权利要求2所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，其中，所述显微镜检查设备包括设置在与所述物平面光学共轭的平面中的共焦孔(34)，并且包括设置在所述至少一个光源和所述显微镜物镜之间的用于准直所述光束以便形成准直光束的装置，所述第一反射光学装置(M-X1，M-XY1)和所述第二反射光学装置(M-X2，M-XY2)串联设置在所述准直光束的光路上。
14.根据权利要求2至5中任一项所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，其进一步包括观察相机(9)，所述观察相机适配于形成所述显微镜物镜的所述物平面(11)的图像和/或观察通过光束扫描的扫描样本的区域。
15.根据权利要求1所述的用于光束扫描显微镜检查的设备，其中，具有两个旋转轴的所述致动器(25,26)是压电型或音圈型的。
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