CN116547504A - 使用激光的反射使激光扫描细胞仪聚焦的设备和方法 - Google Patents

Abstract

使用激光扫描共焦显微镜自动分析液体样品中的颗粒。更具体地，本文描述的实施方式能够实现用于使用激光束从包含液体样品的容器的反射来使激光扫描显微镜聚焦的新方法和设备。

Description

使用激光的反射使激光扫描细胞仪聚焦的设备和方法

技术领域

本发明的至少一个实施方式总体上涉及使用激光扫描共焦显微镜自动分析液体样品中的颗粒。更具体地，本文描述的实施方式能够实现用于使用激光束从包含液体样品的容器的反射来使激光扫描显微镜聚焦的新方法和设备。

背景技术

微观颗粒的测量是临床和生命科学测试以及研究应用中许多应用的组成部分。对液体样品中的这种颗粒进行成像并测量颗粒的尺寸、形状、光吸收和荧光发射的激光扫描细胞仪是进行这种测量的一种手段。

激光扫描细胞仪(LSC)的一个可能的实施方式包括包含样品的光学透明容器、将来自激光器的激发光聚焦到样品上并收集样品发射的光的物镜、用于以二维模式扫描样品上的激光的反射镜或一组反射镜以及至少一个用于测量扫描中每一个点的样品发射的光量的检测器。

应用经常需要一次分析许多样品。非常需要自动化对样品的成像，以便可以分析大量样品，而不需要操作者的持续关注。为了促进这种自动化，LSC必须包括一种使每一个样品聚焦的手段。一些LSC系统的光学分辨率可能在1微米的数量级上，并且获得可接受的焦点可能需要相对于样品中包含颗粒的平面(样品平面)将物镜定位在到样品平面的最佳焦距的几微米内。

发明内容

这里描述了一种新颖的发明，其以快速、简单、稳健的方式实现了LSC中物镜的自动聚焦。

本发明的实施方式与包含液体样品的样品容器一起使用。样品可以包含诸如细胞的微观颗粒或诸如塑料微球的人造颗粒。样品容器具有光学透明的下表面，通过下表面可以观察、测量或成像样品中的颗粒。样品中的颗粒位于样品容器的下表面(样品平面)。应当理解，底表面具有靠近物镜的下表面和微观颗粒位于其上的上表面。

物镜将来自激光器的光聚焦到样品平面中的一点上，即样品容器的表面层，微观颗粒位于该表面层上。物镜响应于激光的照射收集从样品中的颗粒发出的光。本发明的其他实施方式包括光源，光源不是激光器，而是由物镜聚焦到小光斑(例如来自发光二极管的高度准直的光束)。

位于激光器和物镜之间的激光束路径中的扫描镜使激光束与样品平面相交的点穿过样品平面。

致动器升高或降低物镜以将透镜聚焦在样品平面上。一种可以用作致动器的装置是具有固定导螺杆(被配置为在步进电机旋转时升高或降低物镜)的步进电机。

本发明的实施方式利用实现本文描述的自动聚焦方法的算法。算法中的步骤包括以下：

将物镜定位在已知在物镜聚焦在样品容器下表面的点下方的位置，考虑到该位置估计的不确定性。

打开激光器，并开始在一个轴上振荡扫描镜。扫描镜应该以足够快的速度振荡，使得由激光照射的点在物镜的焦平面中移动一段距离(大于激光束反射的表观尺寸，并且理想地大于激光束反射的几个直径)。

开始使用CMOS相机捕获激光束从样品容器表面的反射的图像。反射最初将是一个相对低强度的大光斑，因为物镜没有聚焦在任何表面上。

开始升高物镜相对于样品平面的高度，同时使用CMOS相机以高度增量记录图像。高度增量可以限制为不大于LSC系统所需的聚焦准确度，这将根据被分析样品的类型和正在进行的分析的类型而变化。当物镜的焦平面接近样品容器的下表面时，反射的亮度将增加，且被照亮的光斑的尺寸将缩小到最小。然后反射的亮度将减小并且变得不那么锐利，直到物镜的焦平面接近样品容器的上表面，在这一点上反射将再次变得更明亮并且被照亮的光斑的尺寸将缩小到最小。当物镜继续向上移动时，当物镜的焦点移动经过样品容器的上表面并进入样品的液体中时，被照亮的光斑将再次变得不太亮和不太清晰。

在已知焦点位于样品平面上方的位置停止移动物镜，考虑该位置估计的不确定性。

对于在物镜的每一个高度收集的图像，通过将数学函数应用于每一个图像中的像素值来计算聚焦分数，聚焦分数随着激光束反射的图像变得更强烈(像素值更高)和更小(占用更少数量的像素)而增加。

识别样品容器的下表面。通过找到当物镜从起始位置升高时遇到的聚焦分数的第一最大值来识别下表面。

通过在物镜升高至下表面上方后找到最大聚焦分数来识别样品容器的上表面。平滑或过滤聚焦分数数据可能是必要的，以避免错误地将聚焦分数中的小的局部变化识别为最大聚焦分数。

通过在样品容器上表面的高度上增加大约是样品中颗粒厚度一半的距离来识别样品平面，使得物镜的焦平面横切位于样品容器表面上的颗粒的中点。

将物镜移动到上一步中确定的位置。在一个实施方式中，操作者可以关闭激光器并停止扫描镜。

在样品容器的下表面和上表面的位置不能事先高度准确地知道的情况下，该算法是有用的。因为在样品容器的下表面下方没有激光可以反射的表面，所以该方法将通过在足够低的点启动物镜来非常可靠地找到该表面，使得已知物镜的焦点在样品容器下方。

在上述步骤中描述的过程之后，可以将仅搜索样品容器的上表面的替代算法用于其他样品，这将聚焦于多个样品所需的时间最小化。假设颗粒比样品液体密度大并且在重力作用下沉降，样品容器的上表面是颗粒可以定位的表面。该算法比上述步骤中描述的算法更快，因为它搜索物镜位置的范围更小。因为样品的液体和样品上方的空气之间的界面可能与其他表面之一相混淆，所以该方法需要对样品容器的高度进行初始估计，使得已知物镜的焦点从样品容器的上表面上方开始，但在样品的液体内。操作者事先知道样品容器高度的初始估计，并作为输入提供给算法。

附图说明

图1示出了LSC系统，包括激光扫描共焦分析系统、物镜、调节物镜位置的致动器、容纳样品的容器以及用于控制LSC系统并记录来自LSC系统的数据的计算机。

图2示出了包括用于自动聚焦的CMOS相机的LSC系统的一个可能的实施方式。

图3示出了包括用于自动聚焦的CMOS相机的LSC系统的第二可能的实施方式。

图4a显示了在物镜的几个聚焦位置处激光从样品容器表面反射的图像。

图4b显示了作为物镜与样品平面的距离的函数的聚焦分数。

图5显示了使用该设备和方法使LSC自动聚焦的一种可能的算法。

图6显示了图5所示算法的简化版本，其中以更高的准确度知道样品容器的近似高度。

图7a显示了在图5所示算法开始时物镜和焦平面的初始位置。

图7b显示了在图5所示算法结束时物镜和焦平面的最终位置。

图7c显示了在图6所示算法开始时物镜和焦平面的初始位置。

图7d显示了在图6所示算法结束时在最后物镜和焦平面的最终位置。

具体实施方式

图1示出了本发明中描述的激光扫描共焦系统。样品容器(103)包含液体样品。样品可以包含诸如细胞的微观颗粒或诸如塑料微球的人造颗粒。样品容器具有光学透明的下表面，通过其可以观察、测量或成像样品中的颗粒。样品中的颗粒位于样品容器的下表面(样品平面)。应当理解，底表面具有靠近物镜的下表面和位于其上的微观颗粒的上表面。

在本公开中描述的示例中，物镜垂直定位在包含样品平面的容器下方，并且样品平面水平定向。将物镜相对于样品平面移动得更高相当于将物镜定位得更靠近样品平面。其他实施方式可以采用样品平面和物镜的不同定向。应当理解，本发明可以同样地应用于其他定向。为了简单起见，本公开使用样品平面总是位于物镜上方的惯例。

物镜(102)将来自激光器的光聚焦到样品平面中的一点上，即样品容器的表面层，微观颗粒位于该表面层上。物镜响应于激光的照射收集从样品中的颗粒发出的光。本发明的其他实施方式包括光源，光源不是激光器，而是由物镜聚焦到小光斑(例如来自发光二极管的高度准直的光束)。

致动器(104)升高或降低物镜以将透镜聚焦在样品平面上。一种可以用作致动器的装置是具有固定导螺杆(被配置为在步进电机旋转时升高或降低物镜)的步进电机。

图1中所示的系统可以包括自动装载用于分析的样品的装置。装载样品超出了本发明的范围，因此未示出。定位用于分析的样品的示例装置可以在现有技术中找到。

激光扫描细胞仪(LSC)系统由计算机(101)控制，计算机(101)具有实现本发明公开中描述的方法的软件。

图2示出了LSC系统的一个可能的实施方式。

激光器(203)用于照射样品中的(例如位于样品平面上的)颗粒。使用二向色分束器(202)将激光组合到光路中，二向色分束器(202)反射激光波长的光并传输其它波长的光。

由计算机控制的X-Y扫描镜(204)将激光对准样品平面内的不同点。X-Y扫描镜(204)可以包括一对定位在检流计上的反射镜，定向成在彼此正交的方向上旋转；或者包括安装在正交万向节上的单个反射镜，能够独立地围绕两个轴旋转。在另一个实施方式中，具有多边形面的旋转反射镜可用于将激光对准样品平面内的不同点。物镜(102)将来自激光器的光聚焦到位于样品平面中的点。通过在物镜的整个视野中光栅扫描激光，该系统能够对样品平面中的颗粒成像。

物镜收集从样品中的颗粒发出的光，并将光聚焦到像平面上。物镜的像平面与共焦针孔孔径(212)的前表面重合并对准，使得被激光照射的点的图像与针孔孔径重合。一个或多个检测器(此处示出一个；210)在样品平面中测量的每一个点处测量来自颗粒的荧光，从而形成样品的图像。应当理解，物镜、扫描透镜(205)和聚焦透镜(201)组合工作以在针孔孔径的前表面上产生样品平面的图像。对于那些熟悉光学系统(如显微镜)设计的人来说，这些透镜的合适选择是显而易见的。

分束器(213)将由物镜收集的少量光反射到CMOS相机(200)。在该实施方式中，分束器将大约10％的光从光路朝向CMOS相机反射，并将大约90％的光传输到荧光检测器(210)。

聚焦透镜(201)用于在CMOS相机内部的检测器表面上产生样品平面的图像。CMOS相机创建数字图像，并将这些图像传送到计算机进行分析。

在图2的实施方式中，通过CMOS相机观察到的激光反射的位置在空间上看起来是恒定的，因为当扫描镜移动以将激光对准样品中的不同点时，投射到CMOS相机检测器表面上的区域与激光束同步移动。因此，当激光扫描穿过样品平面时，由CMOS相机成像的激光反射似乎是空间中静止的点。尽管二向色分束器(202)反射大部分激光，但1％至10％的激光将透过二向色并随后被分束器(213)导向CMOS相机。这个光量足以让CMOS相机测量。

图3示出了实现本发明的LSC系统的另一个实施方式。在图3中，分束器和CMOS相机的位置已经移动。在图3中，CMOS相机对物镜的视场进行成像，该视场在激光扫描样品时保持不变。当激光扫描样品时，由CMOS相机成像的激光的反射也将改变，如图3所示。

图2和图3所示的实施方式中的任何一个都将是本发明的可接受的实现。

图4a显示了当图2中物镜的位置相对于样品容器(其在空间中保持固定)的位置改变时，激光从样品容器的上表面(微观颗粒所在的表面)反射的图像。当物镜接近具有最佳焦点的位置时，激光束的图像变窄到一个点。因为物镜聚焦激光束，同时也聚焦从焦平面中的点发出的光，所以激光束聚焦到最小点的位置与物镜聚焦在反射光的样品容器表面的平面(可以是样品容器的上表面或下表面)上的位置重合。

可以在物镜的每一个改变的位置处为从CMOS相机获得的图像计算聚焦分数。当物镜焦平面与样品容器的表面重合时，计算呈现最大值的聚焦分数的一种可能方法在此说明：

1.对于图像中的每一个像素，确定像素强度是否超过阈值。

阈值可以设置为CMOS相机测量的最大可能强度的10％。

2.如果像素超过阈值：

a.将像素强度值加到被称为聚合强度的量上；以及

b.增加超过阈值的像素数。

3.在以步骤1和2中描述的方式处理每一个像素之后，将聚合强度除以图像中超过阈值的像素数。

这个商是图像的聚焦分数。

图4b显示了当物镜相对于样品平面定位在不同高度时通过该方法确定的聚焦分数。当物镜聚焦在样品容器的下表面时，聚焦分数达到最大值。与样品容器和样品中的液体(主要是水)之间的界面相比，样品容器(玻璃或透明塑料)和空气之间的界面具有高反射性。应当理解，对于可见光谱中的光，这种现象是由空气和玻璃(或塑料)的折射率差异较大而玻璃(或塑料)和水之间的折射率差异较小引起的。

作为参考，与本发明相关的材料的典型折射率列于表1中。这些指数的精确值对于理解本发明并不重要。

表1选定光学材料在600nm处的折射率

图5显示了实现本发明公开中描述的自动聚焦方法的算法。算法中的步骤包括：

5a：将物镜定位在已知在物镜聚焦在样品容器下表面的点下方的位置，考虑到该位置估计的不确定性。该位置如图7a所示。

5b：打开激光器，并开始在一个轴上振荡扫描镜。扫描镜应该以足够快的速度振荡，使得在物镜的焦平面中被激光照射的点移动一段距离(大于激光束反射的表观尺寸，并且理想地大于激光束反射的几个直径)。应当理解，用于CMOS相机的曝光时间和扫描镜穿过的角度的幅度将成为满足这些标准所必需的振荡速度的因素。

5c：开始使用CMOS相机捕获从样品容器表面激光束反射的图像。反射最初将是一个相对低强度的大光斑，因为物镜没有聚焦在任何表面上。

5d：开始升高物镜相对于样品平面的高度，同时使用CMOS相机以高度增量记录图像。高度增量可以限制为不大于LSC系统所需的聚焦准确度，这将根据被分析样品的类型和正在进行的分析的类型而变化。当物镜的焦平面接近样品容器的下表面时，反射的亮度将增加，且被照亮的光斑的尺寸将缩小到最小。然后反射的亮度将减小并且变得不那么锐利，直到物镜的焦平面接近样品容器的上表面，在这一点上反射将再次变得更亮并且被照亮的光斑的尺寸将缩小到最小。当物镜继续向上移动时，当物镜的焦点移动经过样品容器的上表面并进入样品的液体中时，被照亮的光斑将再次变得不太亮和不太清晰。

5e：在已知焦点位于样品平面上方的位置停止移动物镜(如图7a所示)，考虑该位置估计的不确定性。

5f：对于在物镜的每一个高度收集的图像，如上所述计算聚焦分数。

5g：识别样品容器的下表面。通过找到当物镜从5c的起始位置升高时遇到的聚焦分数的第一最大值来识别下表面。应当理解，可以使用移动平均或其他滤波方法来平滑图像的聚焦分数，使得聚焦分数中的小变化不被计为最大值。

5h.通过在物镜升高至下表面上方后找到最大聚焦分数来识别样品容器的上表面。与5g一样，平滑或过滤聚焦分数数据可能是必要的，以避免错误地将聚焦分数中的小的局部变化识别为最大聚焦分数。

5i：通过在样品容器上表面的高度上增加大约是样品中颗粒厚度一半的距离来识别样品平面，使得物镜的焦平面横切位于样品容器表面上的颗粒的中点。对于小颗粒尺寸，这一步骤可以省略，且样品平面可以定义为与样品容器的上表面相同。颗粒的近似厚度由用户事先知道。

5j：将物镜移动到步骤5i中确定的位置。在一个实施方式中，操作者可以关闭激光器并停止扫描镜。

图5所示的算法在样品容器的下表面和上表面的位置无法以高准确度事先知道的情况下是有用的。因为在样品容器的下表面下方没有激光可以反射的表面，所以该方法将通过在足够低的点启动物镜来非常可靠地找到该表面，使得已知物镜的焦点在样品容器之下。

图6示出了体现本发明方法的替代算法，仅搜索样品容器的上表面。假设颗粒比样品液体密度大并且在重力作用下沉降，样品容器的上表面是颗粒可以定位的表面。该算法比图5所示的算法更快，因为它搜索的物镜位置范围更小。因为样品的液体和样品上方的空气之间的界面可能与其他表面之一相混淆，所以该方法需要对样品容器的高度进行初始估计，使得已知物镜的焦点从样品容器的上表面上方开始，但在样品的液体内。操作者事先知道样品容器高度的初始估计，并作为输入提供给算法。

在一个或多个实施方式中，在执行图5的粗聚焦步骤之后，可以利用图6的步骤更快地聚焦后续样品，例如通过对每一个附加样品执行：

将物镜定位在样品平面上方；

打开光源并开始在一个所述轴上振荡扫描镜；

使用CMOS相机捕获光源从样品容器的表面反射的图像；

在使用CMOS相机以高度增量记录图像的同时，使物镜更靠近样品平面移动；

在已知焦平面在样品平面下方但在样品容器的下表面上方的位置处停止物镜的移动；

使用在物镜的每一个高度处收集的图像来计算聚焦分数；

通过找到当物镜从起始位置移动时遇到的聚焦分数的第一最大值来识别样品容器的上表面；

通过将样品容器的上表面的高度增加大约是样品中颗粒的厚度一半的距离来识别样品平面位置；

将物镜移动到样品平面位置。

图7a显示了在图5中指定的算法过程中物镜和物镜的焦平面相对于样品容器的初始位置。图7b显示了物镜和焦平面的最终位置。在过程开始时，焦平面位于样品容器下方的空气中。在过程结束时，焦平面位于样品容器的上表面上方的样品液体中。

图7c显示了在图6中指定的算法过程中物镜和物镜的焦平面相对于样品容器的初始位置。图7d显示了物镜和焦平面的最终位置。在过程开始时，焦平面位于样品容器的上表面上方的样品液体中。在过程结束时，焦平面位于靠近样品容器的下表面的材料(玻璃或透明塑料)内。在具有薄膜塑料底面的微量滴定板的情况下，样品容器的下表面可以薄至约100微米，或者在玻璃显微镜载玻片的情况下厚至大于1毫米，或者在具有注射模制塑料底面的微量滴定板的情况下厚至大于1毫米。

应当理解，样品容器可以采取多种形式。图中所示的样品容器代表多孔微量滴定板的单个孔。可选地，样品容器可以是显微镜载玻片，其中样品定位在载玻片的顶部(具有或不具有盖玻片)。其他配置也是可能的。

应当理解，就本发明而言，相对于物镜移动样品容器将基本上等同于相对于样品移动物镜，并且移动样品容器或物镜是本发明的有效实施方式。

本发明的优点

该方法和装置提供了下面列出的多种优点。

1.在自动聚焦过程中，由于激光从表面反射的点在与物镜运动方向正交的方向上不断移动(扫描)，所以由样品容器表面中的缺陷引起的不准确度被平均化。

2.如果样品中的颗粒与激光束反射重合，使用静态激光反射的自动聚焦方法将导致不精确的性能，因为颗粒会产生额外的意想不到的表面。本发明不会受到与激光束重合的颗粒的干涉，因为激光束在聚焦过程中扫描相对于样品中颗粒尺寸的大路径，并且平均了位于激光束路径中的一个或多个颗粒的影响。

3.相干的激光束的衍射和干涉对表面的影响被最小化，因为衍射将随着激光扫描样品容器的表面而变化，并将在每一个图像的曝光时间内平均化。静态激光束的衍射和干涉图案会产生混淆自动聚焦算法的伪像。

4.该方法需要增加单色数码相机、聚焦透镜和分束器，这些都不昂贵。

5.该方法需要很少的激光功率。来自激光器的照明可以保持在不会光漂白敏感样品的荧光的水平。

6.这种方法的准确度来自激光束会聚到最小值的速率。这种会聚速率可以通过改变激光束的直径来调节，以使聚焦或多或少地对物镜的位置敏感。很容易理解，被物镜聚焦的大直径光束将会聚到比小直径光束更小的最小值(称为光束的腰部)。

7.通过选择具有足够高的帧速率和足够快的致动器的相机，可以使该方法任意快；以及

8.该方法仅要求样品容器中存在液体，但不要求样品中存在颗粒。许多聚焦方法，例如基于图像对比度的方法，需要在物镜的焦平面中最小量的物体。如果要聚焦的物体太少，或者焦平面上方或下方的物体在不同的物镜高度聚焦，这些方法就会失败。

Claims (3)

1.一种使自动显微镜成像系统聚焦的方法，所述自动显微镜成像系统使用数码相机来测量光源从包含液体样品的透明样品容器的反射的尺寸，所述方法包括：

将物镜定位在已知在所述物镜聚焦在样品容器的下表面上的点下方的位置处，并考虑位置估计中的不确定性；

打开所述光源并开始在一个轴上振荡扫描镜，其中，所述扫描镜以足够快的速度振荡，使得由所述光源照射的点在所述物镜的焦平面中移动大于所述光源的反射的表观尺寸的距离；

使用所述数码相机捕获所述光源从所述样品容器的下表面的反射的图像；

在使用所述数码相机以高度增量记录所述图像的同时，升高所述物镜相对于样品平面的高度；

在已知所述焦平面在所述样品平面上方的地点处停止所述物镜的移动，并考虑所述位置估计中的所述不确定性。

使用在所述物镜的每一个高度处收集的所述图像来计算聚焦分数；

通过找到当所述物镜从起始位置升高时遇到的所述聚焦分数的第一最大值来识别所述样品容器的下表面；

通过在所述物镜升高到所述下表面上方之后找到最大聚焦分数来识别所述样品容器的上表面；

通过在所述样品容器的上表面的高度上增加大约是样品中颗粒厚度的一半的第二距离来识别样品平面地点，使得所述物镜的焦平面横切位于所述样品容器的表面上的所述颗粒的中点；

将所述物镜移动到所述样品平面地点；

针对每一个附加样品执行：

将所述物镜定位在所述样品平面上方；

打开所述光源并开始在所述一个轴上振荡所述扫描镜；

使用所述数码相机捕获所述光源从所述样品容器的表面的反射的所述图像；

在使用所述数码相机以所述高度增量记录所述图像的同时，使所述物镜更靠近所述样品平面移动；

在已知所述焦平面在所述样品平面下方并在所述样品容器的下表面上方的定位处停止所述物镜的移动；

使用在所述物镜的每一个高度处收集的所述图像来计算所述聚焦分数；

通过找到当所述物镜从所述起始位置移动时遇到的所述聚焦分数的第一最大值来识别所述样品容器的上表面；

通过在所述样品容器的上表面的高度上增加大约是所述样品中所述颗粒的厚度的一半的距离来识别所述样品平面定位；

将所述物镜移动到所述样品平面定位。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述自动显微镜成像系统是激光扫描细胞仪。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，假设所述颗粒厚度是能够忽略的，并且所述样品平面与所述样品容器的上表面重合。