CN106459952A - 突变的蛋白质、制备所述突变的蛋白质的方法、编码所述突变的蛋白质的基因 - Google Patents

突变的蛋白质、制备所述突变的蛋白质的方法、编码所述突变的蛋白质的基因 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种通过突变HMGR的特定氨基酸残基获得的突变的蛋白质，其为类萜生物合成通路中异戊二烯单体生物合成的限速酶。本发明涉及一种突变的蛋白质，其中在3‑羟基‑3‑甲基戊二酰‑辅酶A还原酶中，选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥3‑羟基‑3‑甲基戊二酰‑辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被其它氨基酸残基取代。

Description

突变的蛋白质、制备所述突变的蛋白质的方法、编码所述突变 的蛋白质的基因
技术领域
本发明涉及一种突变的蛋白质，一种制备所述突变的蛋白质的方法，编码所述突变的蛋白质的基因，携带所述基因的重组载体和植物，控制甲羟戊酸产量和类异戊二烯产量的方法，以及控制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的方法。
背景技术
在类萜生物合成通路中，3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(以下也称之为HMGR或HMG-CoA还原酶)是异戊二烯单体(异戊烯基二磷酸)生物合成的限速酶。已知HMGR的酶活性受可逆的翻译后磷酸化控制，具体而言，众所周知，通过C端丝氨酸磷酸化灭活酶活性是动物中HMGR的翻译后调控机制。这在植物中也得到了确认，特别是在非专利文献1中，C端丝氨酸对应的第577位丝氨酸残基的磷酸化导致的酶活性降低在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中得到了确认。
也存在增加类萜产量而无需基因重组的方法，例如通过使用胆固醇生物合成抑制剂来增加类萜产量的方法，但仍然存在改善增加类萜产量及其类似物的方法的空间，并存在进一步研发这些技术的需求。
引用列表
非专利文献
非专利文献1:Dale S.等，欧洲生物化学期刊233(2),506-513(1995)
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是解决这些问题，并提供一种通过突变HMGR的特定氨基酸残基而获得的突变的蛋白质，其为类萜生物合成通路中异戊二烯单体生物合成的限速酶。本发明的另一目的在于提供一种制备该突变的蛋白质的方法，编码该突变的蛋白质的基因，以及携带该基因的重组载体和植物，以及提供一种控制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的方法。另一个目的是提供一种控制甲羟戊酸产量和类异戊二烯产量的方法。
问题的解决方案
本发明涉及一种突变的蛋白质，其中在3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶中，选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被其它氨基酸残基取代。
与拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基位置相当的氨基酸残基优选分别是SEQ ID NO：10所示的橡胶树(Hevea brasiliensis)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第70位、214位、246位、276位、400位、459位、498位和563位氨基酸残基。
与拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第411位、470位、509位和574位氨基酸残基位置相当的氨基酸残基优选分别是SEQ ID NO：70所示的橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第35位、94位、133位和198位氨基酸残基。
与拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基位置相当的氨基酸残基优选分别是SEQ ID NO：71所示的橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第81位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基。
与拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基位置相当的氨基酸残基优选分别是SEQ ID NO：72所示的橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第243位、275位、305位、357位、429位、488位、527位和592位氨基酸残基。
与拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、287位、339位、411位、和470位氨基酸残基位置相当的氨基酸残基优选分别是SEQ ID NO：73所示的橡胶树3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第73位、243位、305位、357位、429位和488位氨基酸残基。
选自于由SEQ ID NO:1的第91位和第339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。
选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失，或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。
选自于由SEQ ID NO：1的第91位和第339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失，或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。
选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。
本发明也涉及一种通过使用所述突变的蛋白质控制类异戊二烯产量的方法。
本发明也涉及一种通过使用所述突变的蛋白质控制甲羟戊酸产量的方法。
本发明涉及一种基因，其编码所述突变的蛋白质。
本发明还涉及一种使用所述基因控制类异戊二烯产量的方法。
本发明还涉及一种使用所述基因控制甲羟戊酸产量的方法。
本发明还涉及一种携带所述基因的重组载体。
本发明涉及一种携带所述基因的植物。
本发明还涉及一种使用所述植物控制类异戊二烯产量的方法。
本发明还涉及一种使用所述植物控制甲羟戊酸产量的方法。
本发明还涉及一种产类异戊二烯的植物，其携带所述基因。
本发明还涉及一种使用所述产类异戊二烯的植物控制类异戊二烯产量的方法。
本发明还涉及一种使用所述产类异戊二烯的植物控制甲羟戊酸产量的方法。
本发明还涉及一种控制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的方法，其中在3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶中，选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被其它氨基酸残基取代
选自于由SEQ ID NO：1所示的第91位和第339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。
选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失、或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。
选自于由SEQ ID NO：1的第91位和第339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失、或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。
选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。
本发明还涉及一种生产突变的蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：在3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶中，选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失、或被其它氨基酸残基取代。
选自于由SEQ ID NO：1的第91位和第339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。
选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失，或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。
选自于由SEQ ID NO：1的第91位和第339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失，或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。
选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。
本发明的有益效果
本发明的突变的蛋白质是通过将HMGR的特定氨基酸残基缺失，或被其它氨基酸残基取代而获得的突变的蛋白质，所述HMGR是类萜生物合成通路中异戊二烯单体生物合成的限速酶。结果，可以通过制备该突变的蛋白质或其内引入了编码该突变的蛋白质的基因的转化体来控制HMGR酶活性、以及甲羟戊酸和类异戊二烯产量。
附图说明
图1显示了类萜生物合成通路的一部分。
具体实施方式
本申请发明人进行了各种研究以增加类萜生物合成通路中生物合成的类萜的量。类萜生物合成通路的一部分如图1所示。如图1所示，类萜生物合成通路中涉及多种不同的酶，但是本申请发明人专注于3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMGR)，其为异戊二烯单体生物合成的限速酶，所述异戊二烯构成了类萜的基本骨架。
众所周知，HMGR的C端丝氨酸，例如拟南芥HMGR的第577位丝氨酸，涉及调控它的活性。具体而言，当C端丝氨酸被磷酸化后，HMGR的活性丧失。基于该原因，将丝氨酸取代为丙氨酸以防止丝氨酸磷酸化的突变体(参见例如非专利文献1)是众所周知的。本领域广泛认为，上述突变体的活性将不被磷酸化控制。因此，在本申请之日，本领域普遍认为，当C端丝氨酸被丙氨酸取代时，HMRG的活性不再受磷酸化控制。
尽管存在这种技术常识，但本申请发明人对HMGR氨基酸残基磷酸化的进一步研究结果发现，除了已知的丝氨酸残基，还有新的氨基酸残基涉及控制酶活性。
具体而言，已经发现在表达根据非专利文献1已知的突变的HMGR的拟南芥植物转化体中，突变的HMGR的酶活性通过进一步磷酸酶处理而增加，其中所述HMGR的C端丝氨酸已被丙氨酸取代以使HMGR的酶活性不因丝氨酸的磷酸化而灭活。这表明，除了已知的丝氨酸残基，还有其它氨基酸残基作为磷酸化位点涉及控制HMGR酶活性。这是一个非常显著的发现，其与上述普通技术知识相反，而本领域技术人员不能预料到该发现。在活的拟南芥中，根据需要通过磷酸化酶(激酶)来进行磷酸化。
基于该启示，本申请发明人接下来找到了用于控制HMGR酶活性的新的磷酸化位点。具体而言，我们筛选了除已知的丝氨酸残基(相当于如上所述的第577位丝氨酸)以外的涉及控制HMGR酶活性的氨基酸残基，我们从不同类型的HMGR的高度保守的序列或换言之其保守区域中包含的氨基酸残基中，识别了9种可以控制HMGR活性的氨基酸残基。然后，我们通过制备突变的蛋白质来证明可以升高、降低或维持HMGR酶活性，或换言之控制HMGR酶活性；其中，所述突变的蛋白质中，9个所识别的具体氨基酸残基被缺失或被替换。
能够用作磷酸化位点的氨基酸残基的例子包括丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸。
因此，通过制备具有导入的编码如上所述的本发明中制备的突变的蛋白质的基因的转化体，可以控制转化体的HMGR酶活性，并因此控制甲羟戊酸产量和类异戊二烯产量。
具体而言，通过将相当于SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR第91位的苏氨酸残基和第339位的丝氨酸残基取代为其它氨基酸残基，以及优选地取代为天冬氨酸或谷氨酸而制备的突变的HMGR具有增强的酶活性。
而且，通过将相当于SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR第225位的酪氨酸残基、第257位的酪氨酸残基、第287位的丝氨酸残基、第411位的丝氨酸残基、第470位的苏氨酸残基、第509位的苏氨酸残基以及第574位的酪氨酸残基取代为其它氨基酸残基，以及优选地取代为丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸而制备的突变的HMGR也具有增强的酶活性。
因此，在导入了编码这些突变的HMGR的基因的植物中，酶活性增强以及下游代谢物含量增加。结果，通过将编码这种突变的HMGR的基因导入到例如橡胶树中，可以增强橡胶树中的酶活性以及增加作为下游代谢物生物合成的天然橡胶的量。
另一方面，通过将相当于SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位的苏氨酸残基和第339位的丝氨酸残基取代为其它氨基酸残基或优选地取代为丙氨酸或苯丙氨酸而制备的突变的HMGR具有降低的酶活性。
而且，通过将相当于SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第225位的酪氨酸残基、第257位的酪氨酸残基、第287位的丝氨酸残基、第411位的丝氨酸残基、第470位的苏氨酸残基、第509位的苏氨酸残基以及第574位的酪氨酸残基取代为其它氨基酸残基，以及优选地取代为天冬氨酸或谷氨酸而制备的突变的HMGR具有降低的酶活性。
因此，在导入了编码这些突变的HMGR的基因的植物中，酶活性下降并且下游代谢物含量也下降。结果，通过将编码这种突变的HMGR的基因导入到植物中，可降低植物中可食用部分中的HMGR酶活性，并降低作为下游代谢物的有害的甾体生物碱或类倍半萜烯的量；其中，所述植物在例如马铃薯(茄碱)、番茄(番茄苷)、莴苣(山莴苣素)或大豆(A组大豆皂苷)等植物的可食用部分中积累有害的物质或更苦的物质。
提高植物中HMGR功能的传统方法主要是通过基因过表达，没有人想到该酶的多个氨基酸涉及其活性。基于基因重组，可以预测基因过表达，但是在本发明中，该活性可以通过氨基酸取代来控制。这意味着，没有重组的该修饰是可能的，允许获得比重组更容易的处理和更大的工业实用性。
在说明书中，HMGR涉及一种将羟甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)催化还原为甲羟戊酸(MVA)的酶，HMGR的酶活性代表了该还原反应的活性，不同的生物物种均含有该酶。而且，不同的HMGR类型可能存在于一个生物物种中。
磷酸化是通过生物体含有的激酶，根据需要在体内执行的反应；在体内用作酶等作用的蛋白质中，这些作用的存在与否、以及力度等受磷酸化和去磷酸化控制。
(突变的蛋白质)
在HMGR中，通过将选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失、或被其它氨基酸残基取代而获得本发明的突变的蛋白质。
SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位氨基酸残基以及与前述相当的位置的氨基酸残基是指，不论HMGR类型如何，HMGR中高度保守的序列中的氨基酸残基或换言之HMGR中保守区域中包含的氨基酸残基。保守区域是指具有类似的序列(结构)的位点；针对蛋白质，推测它是一种具有类似功能的位点。当SEQ ID NO：1所示的源于拟南芥的HMGR和另一种HMGR具有共同的保守区域时，可以推测后者同时拥有相当于SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位或574位氨基酸残基的氨基酸残基，以及保守区域中的氨基酸残基起到与SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR中的氨基酸残基类似作用。在本发明中，通过多序列比对事先选择HMGR的保守区域，以及从被确定为高度保守的那些中选择氨基酸残基的位置。
在说明书中，可以根据下述实施例进行多个序列比对。
包含与SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域没有特别地限定，只要它们是分别包含与SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域即可，但是它们与SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的保守区域序列的序列相似度为优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少88％、最优选至少90％、甚至最优选至少92％，最优选至少95％，特别是更优选至少98％，并且没有上限。
包含SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的特定氨基酸残基的保守区域如下所示：
包含第48位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：2的第48至58位氨基酸残基的序列；包含第91位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：3的第85至91位氨基酸残基的序列；包含第225位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：4的第222至235位氨基酸残基的序列；包含第257位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：5的第256至269位氨基酸残基的序列；包含第287位氨基酸的保守区域是SEQ ID NO：91的第282至299位氨基酸残基的序列；包含第339位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：6的第331位至339位氨基酸残基的序列；包含第411位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：7的第401位至416位氨基酸残基的序列；包含第470位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：8的第468至481位氨基酸残基的序列；包含第509位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：9的第497位至521位氨基酸残基的序列；以及包含第574位氨基酸残基的保守区域是SEQ ID NO：92的第570至578位氨基酸残基的序列。上述序列相似性是指相对于这些保守区域的序列的序列相似性。
与SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的每个保守区域的序列的序列相似度如上所述，但是更优选如下所述。
针对包含与第91位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第91位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：3)的序列相似度优选为至少71％，更优选至少85％，特别优选100％。
针对包含与第225位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第225位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：4)的序列相似度优选为至少64％，更优选至少71％，更优选至少78％，特别优选至少85％，最优选至少92％，最优选100％。
针对包含与第257位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第257位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：5)的序列相似度优选为至少64％，更优选至少71％，更优选至少78％，特别优选至少85％，最优选至少92％，最优选100％。
针对包含与第287位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第287位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：91)的序列相似度优选为至少60％，更优选至少71％，更优选至少78％，特别优选至少82％，最优选至少87％，最优选100％。
针对包含与第339位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第339位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：6)的序列相似度优选为至少66％，更优选至少77％，还更优选至少88％，特别优选100％。
针对包含与第411位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第411位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：7)的序列相似度优选为至少62％，更优选至少68％，还更优选至少75％，特别优选至少81％，进一步特别优选至少87％，最优选至少93％，甚至最优选100％。
针对包含与第470位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第470位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：8)的序列相似度优选为至少64％，更优选至少71％，还更优选至少78％，特别优选至少85％，最优选至少92％，甚至最优选100％。
针对包含与第509位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第509位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：9)的序列相似度优选为至少68％，更优选至少72％，还更优选至少76％，特别优选至少84％，最优选至少96％，甚至最优选100％。
针对包含与第574位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基的保守区域，其与包含对应SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第574位氨基酸残基的保守区域(SEQ ID NO：92)的序列相似度优选为至少71％，更优选至少85％，还更优选100％。
第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基优选丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸，并且更优选丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。可以推测这些氨基酸残基极大地参与了控制HMGR酶活性，因为它们是可能在体内被磷酸化的氨基酸。
具体而言，SEQ ID NO：1的拟南芥HMGR的第91位为苏氨酸，第225位为酪氨酸，第257位为酪氨酸，第287位为丝氨酸，第339位为丝氨酸，第411位为丝氨酸，第470位为苏氨酸，第509位为苏氨酸以及第574位为酪氨酸。
针对与SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和第574位氨基酸残基相当的位置的氨基酸残基，在SEQ ID NO：10所示的源于橡胶树的HMGR(HMG1)的情况下，例如，第91位的苏氨酸相当于第70位苏氨酸，第225位酪氨酸相当于第214位酪氨酸，第257位酪氨酸相当于第246位酪氨酸，第287位丝氨酸相当于第276位丝氨酸，第411位丝氨酸相当于第400位丝氨酸，第470位苏氨酸相当于第459位苏氨酸，第509位苏氨酸相当于第498位苏氨酸，以及第574位酪氨酸相当于第563位酪氨酸，以及没有相当于第339位丝氨酸的氨基酸残基，因为该HMGR没有相当于包含第339位丝氨酸的保守区域的保守区域。
而且，在SEQ ID NO：11所示的源自橡胶草(Taraxacum koksaghyz)的HMGR的情况下，第91位苏氨酸相当于第81位苏氨酸，第225位酪氨酸相当于第223位酪氨酸，第287位丝氨酸相当于第285位丝氨酸，第411位丝氨酸相当于第409位丝氨酸，第470位苏氨酸相当于第468位苏氨酸，第509位苏氨酸相当于第507位苏氨酸，以及第574位酪氨酸相当于第572位酪氨酸，并且没有相当于第257位酪氨酸和第339位丝氨酸的氨基酸残基，因为该HMGR没有相当于分别包含第257位酪氨酸和第339位丝氨酸的保守区域的保守区域。
而且，在SEQ ID NO：70所示的源自橡胶树的HMGR(HMG2)的情况下，第411位丝氨酸相当于第35位丝氨酸，第470位苏氨酸相当于第94位苏氨酸，第509位苏氨酸相当于第133位苏氨酸，以及第574位酪氨酸相当于第198位酪氨酸，并且没有相当于第91位、225位、257位和第339位的氨基酸残基，因为该HMGR没有相当于分别包含第91位、225位、257位和第339位氨基酸残基的保守区域的保守区域。
而且，在SEQ ID NO：71所示的源自橡胶树的HMGR(HMG3)的情况下，第91位苏氨酸相当于第81位苏氨酸，第225位酪氨酸相当于第225位酪氨酸，第257位酪氨酸相当于第257位酪氨酸，第287位丝氨酸相当于第287位丝氨酸，第339位丝氨酸相当于第339位丝氨酸，第411位丝氨酸相当于第411位丝氨酸，第470位苏氨酸相当于第470位苏氨酸，第509位苏氨酸相当于第509位苏氨酸，以及第574位酪氨酸相当于第574位酪氨酸。
而且，在SEQ ID NO：72所示的源自橡胶树的HMGR(HMG4)的情况下，第225位酪氨酸相当于第243位酪氨酸，第257位酪氨酸相当于第275位酪氨酸，第287位丝氨酸相当于第305位丝氨酸，第339位丝氨酸相当于第357位丝氨酸，第411位丝氨酸相当于第429位丝氨酸，第470位苏氨酸相当于第488位苏氨酸，第509位苏氨酸相当于第527位苏氨酸，以及第574位酪氨酸相当于第592位酪氨酸，并且没有相当于第91位的苏氨酸的氨基酸残基，因为该HMGR没有相当于包含第91位苏氨酸的保守区域的保守区域。
而且，在SEQ ID NO：73所示的源自橡胶树的HMGR(HMG5)的情况下，第91位苏氨酸相当于第73位苏氨酸，第225位酪氨酸相当于第243位酪氨酸，第287位丝氨酸相当于第305位丝氨酸，第339位丝氨酸相当于第357位丝氨酸，第411位丝氨酸相当于第429位丝氨酸，以及第470位苏氨酸相当于第488位苏氨酸，并且没有相当于第257位酪氨酸和第509位苏氨酸的氨基酸残基，因为该HMGR没有相当于包含第257位酪氨酸和第509位苏氨酸的保守区域的保守区域。
包含前述实施例的具体实施例如下面表1所示。
本发明的突变的蛋白质是通过氨基酸残基修饰得到的，其中选自由第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被其它氨基酸残基取代。通过该修饰，可以根据需要在体内人工地控制特定氨基酸残基的可逆的磷酸化，从而控制HMGR的酶活性以及甲羟戊酸产量。也可以控制类异戊二烯的产量，因为HMGR是类萜生物合成通路的限速酶。
该取代的其它氨基酸残基没有特别的限定，只要它与取代前的氨基酸不同即可，但是其优选为丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。当丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸被取代时，磷酸化变得不可能；然而通过取代为天冬氨酸或谷氨酸，可以模拟磷酸化以及得到组成性磷酸化状态。缺失或取代的方法没有特别地限定，可以使用已知的方法。例如，可以通过聚合酶链反应(PCR)缺失或取代特定氨基酸残基，所述PCR使用与缺失或取代位点的核苷酸序列重叠的引物；其中编码缺失或取代位点的氨基酸残基的三个核苷酸全部被缺失，或被编码要取代的其它氨基酸的核苷酸(1至3个核苷酸取代)所取代。
优选地，在HMGR中，选自由第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代。通过将氨基酸残基取代为天冬氨酸或谷氨酸，可以模拟磷酸化状态，或换言之获得组成性磷酸化状态，从而控制HMGR的酶活性。
而且，在HMGR中，优选选自由第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。通过使该氨基酸残基缺失或者将其取代为丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸，可以防止磷酸化，或换言之去除磷酸化位点，从而控制HMGR的酶活性。
所述缺失、丙氨酸取代、苯丙氨酸取代和半胱氨酸取代在去除磷酸化位点方面具有类似的效应，但是考虑到原始氨基酸残基对蛋白质的作用，优选取代的氨基酸残基具有与原始氨基酸残基类似的结构(三维大小、占用面积等)。具体而言，当原始氨基酸残基是酪氨酸时，优选苯丙氨酸取代；当它为丝氨酸或苏氨酸时为丙氨酸取代或半胱氨酸取代。
具体地，选自于由第91位和339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代；更优选，选自于由第91位和339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代。HMGR的酶活性可以通过这种取代而改善。
具体地，选自于由第91位和339位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被缺失，或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。通过该取代，HMGR的酶活性将被抑制或维持，由于磷酸化可以被抑制，因此也可抑制磷酸化导致的酶活性的增加。
具体地，选自于由第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位的氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基优选被天冬氨酸或谷氨酸取代。通过这种取代，可以降低或消除HMGR的酶活性。
具体地，优选选自于由第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及与前述相当的位置的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。通过这种取代，可以维持HMGR的酶活性；由于磷酸化可以被抑制，因此也可以抑制由磷酸化导致的酶活性劣化。
因为即便是在保守区域含有不同的氨基酸残基的HMGR也具有上述类似的功能，故HMGR没有特别的限定，只要其具有相当于选自下组的至少一个保守区域的保守区域即可：由含有SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基的保守区域构成的组；并且对其与SEQ ID NO:1所示的拟南芥HMGR的氨基酸序列的序列相似度没有特定下限，但是该序列相似度优选为至少50％，更优选至少60％，还更优选至少75％，更优选至少78％，最优选至少80％。低于50％，其与上述各保守区域的序列相似度不在上述范围之内。
除了SEQ ID NO：1所示的拟南芥(Arabidopsis thaliana)HMGR以外，HMGR的例子包括来自下述的HMGR：橡胶树(Hevea brasiliensis)、水稻(Oryza sativa)、拟南芥、马铃薯(Solanum tuberosum L.)、番茄(Solanum lycopersicum)、南苜蓿(Medicagopolymorpha)、莴苣(Lactuca sativa Lettuce)、橡胶草(Taraxacum koksaghyz)、短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)(一种产生橡胶的蒲公英)、灰白银胶菊(Partheniumargentatum)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、木薯(Manihot esculenta)、杜仲(Eucommiaulmoides)、泽漆(Euphorbia helioscopia L.)。从这些之中，HMGR优选源自选自于由下述构成的组的至少一种植物：橡胶树、莴苣(Lactuca sativa Lettuce)、橡胶草(Taraxacumkoksaghyz)、短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)、灰白银胶菊(Partheniumargentatum)、苦苣菜(Sonchus oleraceus)、木薯(Manihot esculenta)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、杜仲(Eucommia ulmoides)、泽漆(Euphorbia helioscopiaL.)。橡胶树(Hevea brasiliensis)HMGR是特别优选的。
本发明的HMGR可包括存在于一个生物物种中的多种HMGR，例如SEQ ID NO：1表示的HMG1(s)、在拟南芥HMGR的情况下，如SEQ ID NO：69等所示的HMG2、以及SEQ ID NO：10所示的HMG1、SEQ ID NO：70所示的HMG2、SEQ ID NO：71所示的HMG3、SEQ ID NO：72所示的HMG4、在橡胶树HMGR的情况下，如SEQ ID NO：73等所示的HMG5。其它例子如表1所示。
本发明的突变的蛋白质可通过传统的已知方法制备，即通过如下所述地制备重组载体，以及使用能够表达靶蛋白的微生物、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物、昆虫、植物等，以制备具有导入的编码靶蛋白的基因的转化体以表达靶蛋白。也可使用传统已知方法纯化本发明的的突变的蛋白质，例如，如果该突变的蛋白质和融合到靶蛋白的组氨酸标签或类似物共同表达，则可以使用特定的柱子容易地纯化突变的蛋白质。
可使用传统已知的方法来确定本发明的突变的蛋白质的酶活性，例如一种制备具有导入的编码靶蛋白的基因的转化体的方法，所述靶蛋白使用例如大肠杆菌来表达，并通过将酶活性测量方法对应确定其活性从而确定靶蛋白功能的存在与否。
(基因)
本发明的基因是编码突变的蛋白质的基因。由于该基因编码突变的蛋白质，由该基因表达的突变的蛋白质可以用于控制HMGR酶活性以及甲羟戊酸产量。也可以控制类异戊二烯产量，因为HMGR是类萜生物合成通路的限速酶。
本发明的基因的例子包括具有SEQ ID NO：12的第1至1776个核苷酸的核苷酸序列的DNA，在严谨条件下与核苷酸序列和SEQ ID NO：12的第1至1776个核苷酸的核苷酸序列互补的DNA杂交并编码具有HMGR活性的蛋白质的DNA；以及与SEQ ID NO：12的第1至1776个核苷酸的核苷酸序列的序列相似度具有至少60％、优选至少80％、更优选至少90％、还更优选至少95％，特别优选至少98％的DNA，所述DNA编码具有HMGR活性的蛋白质。
此处所用的“杂交”是指将DNA与具有特定核苷酸序列的DNA，或该DNA的一部分进行杂交的步骤。因此，具有特定苷酸序列的DNA或该DNA的一部分的核苷酸序列的长度足够用作Northern或Southern杂交分析的探针，或用作PCR分析中的寡核苷酸引物。用作探针的该DNA可具有至少100个碱基的长度，优选至少200个碱基，更优选至少500个碱基，尽管它也可以是至少10个碱基，长度方面优选至少15个碱基的DNA。
执行DNA杂交试验的技术是众所周知的。根据例如分子克隆(MolecularCloning)，第2版和第3版(2001)、通用和分子细菌学方法(Methods for General andMolecular Bacteriology)，ASM出版社(1994)、免疫学方法手册，学院出版社(分子学)、以及很多其它标准教科书，可以确定实验进行的杂交条件。
该严谨条件可包括，例如DNA固定化过滤器在42℃下过夜温育，以及DNA探针溶于包含50％甲酰胺、5×SSC(750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt's溶液、10％硫酸葡聚糖、以及20μg/l变性的鲑鱼精子DNA的溶液中，随后在大约65℃下，在例如0.2×SSC溶液中冲洗该过滤器。也可以使用较低的严谨条件。严谨性的变化可通过操控甲酰胺浓度(低比例的甲酰胺导致更低的严谨性)、盐浓度或温度完成。例如，较低的严谨条件包括在37℃下，在包含6×SSCE(20×SSCE:3mol/l氯化钠、0.2mol/l磷酸二氢钠、0.02mol/l的EDTA，pH 7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、以及100μg/l的变性鲑鱼精子DNA的溶液中过夜温育，然后在50℃下在包含0.1％SDS的1×SSC溶液中冲洗。除此之外，为了得到更低的严谨性，杂交之后的冲洗可在上述较低的严谨条件下在较高盐浓度(例如5×SSC)下完成。
上述不同条件中的变化可通过包含或取代用于抑制杂交实验背景的封闭液来完成。为了兼容性，包含封闭液可能需要改变杂交条件。
可使用传统已知方法来证实在上述严谨条件下与DNA杂交的DNA编码特定蛋白质，以及例如该核苷酸序列可通过例如测序仪来证实。
(重组载体)
本发明的基因可以被导入到质粒中从而得到带有编码HMGR的基因的重组载体。该重组载体被用于在大肠杆菌等中表达靶蛋白，或作为制备另一转化体的载体。用于导入的质粒没有特别限定。
当该重组载体被用于表达靶蛋白时，该宿主优选但不限定于真核生物，尽管也可使用任何能够表达靶蛋白的微生物、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物、昆虫、植物等。
(转化体)
本发明的基因可以被导入到宿主中以获得带有编码上述HMGR的基因的转化体。由于HMGR酶活性是在体内带有导入基因的转化体中获得的，故使得增加、降低或控制甲羟戊酸的产量是可能的，其中所述靶蛋白在所述转化体中表达，以及所述甲羟戊酸是通过HMGR催化和生物合成的。因此，通过产类异戊二烯的植物的转化体可以推测控制类异戊二烯产量是可能的，因为HMGR活性在带有导入基因的转化体中被体内控制，所述HMGR是类异戊二烯生物合成通路的限速酶。
用于该转化体的宿主没有特别的限定，只要是带有HMGR的有机物即可，但从这些之中，优选产类异戊二烯的植物以便于控制甲羟戊酸产量以及类异戊二烯产量。产类异戊二烯的植物的例子包括橡胶树以及其它橡胶品种；苦苣菜(Sonchus oleraceus)、花叶滇苦菜(Sonchus asper)、长裂苦苣菜(Sonchus brachyotus)和其它苦苣菜品种；高大一枝黄花(Solidago altissima)、毛果一枝黄花亚种Asiatica(Solidago virgaureasubsp.Asiatica)、毛果一枝黄花亚种leipcarpa(Solidago virgaureasubsp.Leipcarpa)、毛果一枝黄花亚种leipcarpa f.paludosa(Solidago virgaureasubsp.leipcarpa f.paludosa)、毛果一枝黄花亚种Gigantea(Solidago virgaureasubsp.Gigantea)、巨大一枝黄花leiophylla(Solidago gigantea Ait.var.leiophyllaFernald)和其它一枝黄花属品种；向日葵(Helianthus annuus)、绢毛葵(Helianthusargophyllus)、黑紫向日葵(Helianthus atrorubens)、瓜叶葵(Helianthus debilis)、千瓣葵(Helianthus decapetalus)、高葵花(Helianthus giganteus)和其它向日葵品种；蒲公英(Taraxacum)、蒲公英venustum H.Koidz(Taraxacum venustum H.Koidz)、蒲公英hondoense Nakai(Taraxacum hondoense Nakai)、宽果蒲公英(Taraxacum platycarpumDahlst)、日本蒲公英(Taraxacum japonicum)、药蒲公英(Taraxacum officinale Weber)、橡胶草(Taraxacum koksaghyz)、短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)(一种产生橡胶的蒲公英)和其它蒲公英品种；无花果(Ficus carica)、橡胶榕(Ficus elastica)、薜荔(Ficus pumila L.)、天仙果(Ficus erecta Thumb.)、菲律宾榕(Ficus ampelasBurm.f.)、黄果榕(Ficus benguetensis Merr.)、涩叶榕(Ficus irisana Elm.)、厚叶榕(Ficus microcarpa L.f.)、常绿榕(Ficus septica Burm.f.)、孟加拉榕(Ficusbenghalensis)和其它榕品种；灰白银胶菊(Parthenium argentatum)、银胶菊(Partheniumhysterophorus)、豚草(Ambrosia artemisiifolia)(银胶菊(Partheniumhysterophorus))和其它银胶菊品种；泽漆(Euphorbia helioscopia L.)、大戟属lasiocaula Boiss和其他大戟属品种；和莴苣(Lactuca sativa Lettuce)和其它莴苣品种；木薯(Manihot esculenta)和其它木薯品种；杜仲(Eucommia ulmoides)和其它杜仲品种；拟南芥(Arabidopsis thaliana)和其它拟南芥品种；及类似物。从这些之中产类异戊二烯的植物优选为选自于由以下植物构成的组的至少一种：橡胶树属、苦苣菜属、蒲公英属、银胶菊属、莴苣属、木薯属、鼠耳芥属、杜仲属和大戟属，更优选地为选自于由以下构成的组的至少一种：橡胶树(Hevea brasiliensis)、莴苣(Lactuca sativa)、橡胶草(Taraxacumkoksaghyz)、短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)、灰白银胶菊(Partheniumargentatum)：,苦苣菜(Sonchus oleraceus)、木薯(Manihot esculenta)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、杜仲(Eucommia ulmoides)和泽漆(Euphorbia helioscopiaL.)，并且更优选橡胶树(Hevea brasiliensis)、莴苣(Lactuca sativa)或橡胶草(Taraxacum koksaghyz)。
上述重组载体可以用作表达载体，并可以使用能够在宿主细胞中进行自我复制的那些或能够包含到宿主细胞的染色体中的那些。
可以使用已知的表达载体，例如pET160、pBI或pUC载体、Ti质粒，以及烟草花叶病毒载体。
可以使用任何用于将DNA导入植物细胞的方法来导入重组载体。例子包括使用土壤农杆菌(JP-A S59-140885，JP-A S60-70080，WO 94/00977)、电穿孔方法(JP-A S60-251887)、以及使用粒子枪(JP-B 2606856，JP-B 2517813)等的方法。
可以通过上述或其它方法制备转化体(转基因植物细胞)。
(点突变育种)
也可通过突变育种技术制备具有修饰的HMGR的植物，所述突变育种技术使用相关位点的核苷酸序列作为育种标记物。可以使用下述作为突变育种技术：普通突变植物生产方法和普通突变筛选方法例如定向诱导基因组局部突变(TILLING)。由于本发明的基因作为点突变的结果被包含在突变体(突变的植物细胞)中，因此修饰后的HMGR被表达从而取代野生型HMGR以提供HMGR酶活性，从而可以增加、减少以及控制甲羟戊酸产量，所述甲羟戊酸是通过HMGR催化和生物合成的。因此，通过产类异戊二烯的植物的突变体，推测可以控制类异戊二烯产量，因此HMGR的活性在突变体中被控制，所述HMGR是类异戊二烯生物合成通路中的一个限速酶。
本发明也提供一种带有本发明基因的产类异戊二烯的植物。该产类异戊二烯的植物没有特别限定，只要它是带有转基因植物细胞或突变的植物细胞的产类异戊二烯的植物即可。从概念上，该产类异戊二烯的植物不仅包括如上所述制备的转基因植物细胞或突变的植物细胞，而且也包括例如，它们的后代或克隆，甚至是通过这些细胞传代获得的后代植物。一旦得到具有导入到植物细胞基因组的DNA或载体的植物细胞或表达通过点突变修饰的HMGR的突变的植物细胞，可以通过有性繁殖或无性繁殖、组织培养、细胞培养、细胞融合、或其它技术从转基因植物细胞或突变的植物细胞中得到它们的后代或克隆。而且，该转基因植物细胞或突变的植物细胞，或它们的后代或克隆也可用于得到生殖材料(例如种子、水果、插条、块茎、块根、嫩枝、不定芽、不定胚、愈伤组织(calluse)、原生质体)，并且它们可以用于批量生产产类异戊二烯的植物。
从转基因植物细胞或突变的植物细胞中使植物再生的技术是已知的，例如Doi等公开了用于桉树的技术(JP-A H11-127025)，Fujimura等公开了用于水稻的技术(Fujimura等(1995)，植物组织培养通讯，第2卷第74页)，Shillito等公开了用于玉米的技术((Shillito等(1989)，生物/技术，第7卷第581页-)，Visser等公开了用于马铃薯的技术(Visser等(1989)，理论与应用遗传学，第78卷第589页-)，以及Akama等公开了用于拟南芥的技术(Akama等(1992)，植物细胞报告，第12卷第7页-)。根据这些文件，本领域技术人员可以从转基因植物细胞或突变的植物细胞中再生植物。
可以通过众所周知的方法确定靶蛋白基因是否在再生的植物中表达。例如，可使用蛋白质印迹分析(western blot analysis)来评估靶蛋白的表达。
可以从转基因植物或突变的植物中得到种子，例如如下所述：将转基因植物或突变的植物植根于适当的介质中，然后移植到盆中含水的土壤中，在适当的培养条件下使其长大直至最终产生种子，然后收集种子。而且，植物也可以从种子开始长大，例如如下所述：将来自如上所述的转基因植物或突变的植物的种子播种在含水土壤中，在适当的培养条件下使其成长为植物。
在本发明中，可以通过使用产类异戊二烯的植物来控制甲羟戊酸产量、类异戊二烯产量和类萜产量，所述产类异戊二烯的植物携带有本发明的基因以生产甲羟戊酸、类异戊二烯和类萜。具体而言，如上所述获得的转基因植物细胞或突变的植物细胞、从转基因植物细胞或突变的植物细胞得到的愈伤组织、从该愈伤组织再分化的细胞、或其类似物可以在适当的介质中被培养，或者从转基因植物细胞中再生的转基因植物、从突变的植物细胞中再生的突变的植物、由从转基因植物或突变的植物中得到的种子成长而来的植物、或其类似物可以在适当的培养条件下成长以生产甲羟戊酸、类异戊二烯和类萜。由于甲羟戊酸、类异戊二烯和类萜生物合成通路中的限速酶的酶活性被本发明的转化体或突变体中的修饰的蛋白质控制，因此可以控制通过所述蛋白质(酶)催化并生物合成的甲羟戊酸的产量，从而控制类异戊二烯产量以及进一步地，类萜产量。
在说明书中，“类萜”是个通用术语，用于指具有异戊二烯(C5H8)单元的聚合物。类萜的例子包括聚合物例如单萜(C10)、倍半萜烯(C15)、双萜(C20)、二倍半萜(C25)、三萜烯(C30)、四萜烯(C40)以及天然橡胶。在说明书中，“类异戊二烯”是指具有异戊二烯(C5H8)单元的化合物，并且从概念上讲包括类萜。
在本发明中，可以通过修饰上述9种氨基酸残基的至少一种氨基酸残基来控制甲羟戊酸产量、类异戊二烯产量和类萜产量，但是如果对这9种氨基酸残基中的两种以上进行修饰，则本发明的效果会更显著。
实施例
结合实施例，将详细解释本发明，但是本发明并不限于这些实施例。
(新的磷酸化位点存在的启发性证据)
具有将拟南芥的HMGR1的第577位丝氨酸替换为丙氨酸的突变的HMGR1(以下称之为S577A-HMGR1)，被转染至缺少内源性HMGR1的拟南芥突变体以生产表达S577A-HMGR1的拟南芥转化体，其中已知丝氨酸577的磷酸化会降低酶活性。从表达S577A-HMGR1(HMGR是ER定位的膜蛋白)的该转基因植物中收集ER组分。当包含S577A-HMGR1的ER组分经磷酸酶处理后，发现其酶活性以与下述相同的方式增加：即当包含来自表达野生型HMGR1的拟南芥的野生型HMGR的ER组分经磷酸酶处理后。蛋白印迹法证实表达S577A-HMGR1的转基因植物和表达野生型HMGR1的转基因植物中积累的HMGR含量具有可比性。这表明除了已知的磷酸化位点(丝氨酸577)之外，还存在参与控制HMGR的酶活性的新的磷酸化位点(氨基酸残基)。
(计算机模拟(in silico)干扰HMGR磷酸化位点)
对表1所示植物执行多个序列比对以寻找高度保守的序列部分(保守区域)。同时，从全长序列中筛选出可能经历磷酸化的氨基酸残基，并从这些残基中选择保守区域中包含的预期的磷酸化位点。该结果如表1所示。
用于进行多序列比对的软件被称为IdentityX，以及用于筛选可能经历磷酸化的氨基酸残基(磷酸化位点)的软件被称为PhosPhAt。
(构建HMGR表达载体)
SEQ ID NO：12的序列，其为SEQ ID NO：1所示的源自拟南芥的HMGR的S型DNA序列(以下称之为HMG1S)，使用下述引物通过PCR进行扩增。使用大肠杆菌通过热休克方法将所得PCR产物克隆至pENTR/D-TOPO以得到被称为pENTR/HMG1S的入门载体。使用DH5α作为大肠杆菌通过pENTR Directional TOPO克隆试剂盒来制备入门载体。
(引物1：SEQ ID NO:13)
5'-CACCATGGATCTCCGTCGGAGGCCTC-3'
(引物2：SEQ ID NO:14)
5'-CGCCTCGAGTCATGTTGTTGTTGTTGTCG-3'
(制备表达载体(重组载体))
使用以上得到的pENTR/HMG1S，将靶蛋白的部分基因序列重组并转染至pET160-DEST以得到pDEST/HMG1S表达载体。将Gateway系统(Invitrogen)的LR反应用于重组反应。
(制备突变的HMGR表达载体)
使用pDEST/HMG1作为模板通过PrimeSTAR HS(Takara)执行PCR反应。每份PCR反应溶液的样品(25μl)的组成为1至5ng质粒，0.75μl各个如下所示的用于各突变的正向或反向引物(各10pmol/μl)、5μl的5×primestar缓冲液(Mg2+)、2μl的dNTPmix、0.25μl的primestar HS、以及15.75μl的milliQ水。使用下述预定的反应循环执行PCR：步骤1：98℃下2分钟，步骤2：98℃下10秒，步骤3：60℃下15秒，步骤4：在68℃下8分钟，步骤2至4重复17次。一部分PCR产物(7μl)被电泳，当观察到扩增时，将0.2μl的DpnI添加到剩下的PCR产物中，并在37℃反应3小时。将2μl反应溶液添加到20μl自制的大肠杆菌(DH5α)化学感受态细胞，并且通过热休克方法转化细胞。所有的细菌培养均接种到包含50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基中并在37℃下过夜培养。在培养之后，通过克隆PCR筛选得到的克隆。使用Qiagen质粒小量提取试剂盒执行质粒提取，并通过测序确认突变插入以得到期望的突变的HMG1S表达载体。通过该方法制备总共34种突变的HMG1S表达载体。也包括作为阳性对照的丝氨酸-577突变的HMG1S。使用ABI3130XI测序仪通过BigDye Terminator Cycle Sequencing V3.0ReadyReaction Kit(美国应用生物系统)进行序列确认。
用于制备各突变的HMG1S的引物如下所示。
(用于HMG1S的第225位突变酪氨酸的引物)
(用于pHMG1S/Y225F的引物)
(引物3(正向)：SEQ ID NO:15)
5’-ttgatTTTgaatcgattttggggcaatgc-3’
(引物4(反向)：SEQ ID NO:16)
5’-ttgatTTTgaatcgattttggggcaatgc-3’
(用于pHMG1S/Y225D的引物)
(引物5(正向)：SEQ ID NO:17)
5’-ttaccgttggatggatttgatGATgaatcgattttggggcaatgc-3’
(引物6(反向)：SEQ ID NO:18)
5’-gcattgccccaaaatcgattcGGCatcaaatccatccaacggtaa-3’
(用于pHMG1S/Y225E的引物)
(引物7(正向)：SEQ ID NO:19)
5’-ttaccgttggatggatttgatGAGgaatcgattttggggcaatgc-3’
(引物8(反向)：SEQ ID NO:20)
5’-gcattgccccaaaatcgattcCTCatcaaatccatccaacggtaa-3’
<用于HMG1S的第257位突变酪氨酸的引物>
(用于pHMG1S/Y257F的引物)
(引物9(正向)：SEQ ID NO:21)
5’-atgagTTCtctgttcctatggctacaacc-3’
(引物10(反向)：SEQ ID NO:22)
5’-acagaGAActcataaccatcaagcaacaa-3’
(用于pHMG1S/Y257D的引物)
(引物11(正向)：SEQ ID NO:23)
5’-ttgttgcttgatggttatgagGACtctgttcctatggctacaacc-3’
(引物12(反向)：SEQ ID NO:24)
5’-ggttgtagccataggaacagaGTCctcataaccatcaagcaacaa-3’
(用于pHMG1S/Y257E的引物)
(引物13(正向)：SEQ ID NO:25)
5’-ttgttgcttgatggttatgagGAAtctgttcctatggctacaacc-3’
(引物14(反向)：SEQ ID NO:26))
5’-ggttgtagccataggaacagaTTCctcataaccatcaagcaacaa-3’
<用于HMG1S的第411位突变丝氨酸的引物>
(用于pHMG1S/S411A的引物)
(引物15(正向)：SEQ ID NO:27)
5’-ggattgagggacgtggtaaaGCAgttgtttgcgaggctgtaatc-3’
(引物16(反向)：SEQ ID NO:28)
5’-gattacagcctcgcaaacaacTGCtttaccacgtccctcaatcc-3’
(用于pHMG1S/S411D的引物)
(引物17(正向)：SEQ ID NO:29)
5’-ggattgagggacgtggtaaaGATgttgtttgcgaggctgtaatc-3’
(引物18(反向)：SEQ ID NO:30)
5’-gattacagcctcgcaaacaacATCtttaccacgtccctcaatcc-3’
(用于pHMG1S/S411E的引物)
(引物19(正向)：SEQ ID NO:31)
5’-ggattgagggacgtggtaaaGAAgttgtttgcgaggctgtaatc-3’
(引物20(反向)：SEQ ID NO:32)
5’-gattacagcctcgcaaacaacTTCtttaccacgtccctcaatcc-3’
<用于HMG1S的第470位突变苏氨酸的引物>
(用于pHMG1S/T470A的引物)
(引物21(正向)：SEQ ID NO:33)
5’-gctGCAggccaagatccagctcaaaacgtg-3’
(引物22(反向)：SEQ ID NO:34)
5’-ggccTGCagctatgaatacagcagacac-3’
(用于pHMG1S/T470D的引物)
(引物23(正向)：SEQ ID NO:35)
5’-gctGATggccaagatccagctcaaaacgtg-3’
(引物24(反向)：SEQ ID NO:36)
5’-ggccATCagctatgaatacagcagacac-3’
(用于pHMG1S/T470E的引物)
(引物25(正向)：SEQ ID NO:37)
5’-gctGAAggccaagatccagctcaaaacgtg-3’
(引物26(反向)：SEQ ID NO:38)
5’-ggccTTCagctatgaatacagcagacac-3’
<用于HMG1S的第509位突变苏氨酸的引物>
(用于pHMG1S/T509A的引物)
(引物27(正向)：SEQ ID NO:39)
5’-ccatctatcgaggtggggGCAgtgggaggaggaacacagcttgc-3’
(引物28(反向)：SEQ ID NO:40)
5’-gcaagctgtgttcctcctcccacTGCccccacctcgatagatgg-3’
(用于pHMG1S/T509D的引物)
(引物29(正向)：SEQ ID NO:41)
5’-ccatctatcgaggtggggGATgtgggaggaggaacacagcttgc-3’
(引物30(反向)：SEQ ID NO:42)
5’-gcaagctgtgttcctcctcccacATCccccacctcgatagatgg-3’
(用于pHMG1S/T509E的引物)
(引物31(正向)：SEQ ID NO:43)
5’-ccatctatcgaggtggggGAAgtgggaggaggaacacagcttgc-3’
(引物32(反向)：SEQ ID NO:44)
5’-gcaagctgtgttcctcctcccacTTCccccacctcgatagatgg-3’
<用于HMG1S的第48位突变丝氨酸的引物>
(用于pHMG1S/S48A的引物)
(引物33(正向)：SEQ ID NO:45)
5’-attgctcctccaccgaaagcaGCCgacgcgcttcctcttccgtta-3’
(引物34(反向)：SEQ ID NO:46)
5’-taacggaagaggaagcgcgtcGGCtgctttcggtggaggagcaat-3’
(用于pHMG1S/S48D的引物)
(引物35(正向)：SEQ ID NO:47)
5’-attgctcctccaccgaaagcaGACgacgcgcttcctcttccgtta-3’
(引物36(反向)：SEQ ID NO:48)
5’-taacggaagaggaagcgcgtcGTCtgctttcggtggaggagcaat-3’
(用于pHMG1S/S48E的引物)
(引物37(正向)：SEQ ID NO:49)
5’-attgctcctccaccgaaagcaGAAgacgcgcttcctcttccgtta-3’
(引物38(反向)：SEQ ID NO:50)
5’-taacggaagaggaagcgcgtcTTCtgctttcggtggaggagcaat-3’
<用于HMG1S的第91位突变苏氨酸的引物>
(用于pHMG1S/T91A的引物)
(引物39(正向)：SEQ ID NO:51)
5’-aatacgcctcttcacgtcgtcGCAatcacagaactcggcgccatt-3’
(引物40(反向)：SEQ ID NO:52)
5’-aatggcgccgagttctgtgatTGCgacgacgtgaagaggcgtatt-3’
(用于pHMG1S/T91D的引物)
(引物41(正向)：SEQ ID NO:53)
5’-aatacgcctcttcacgtcgtcGATatcacagaactcggcgccatt-3’
(引物42(反向)：SEQ ID NO:54)
5’-aatggcgccgagttctgtgatATCgacgacgtgaagaggcgtatt-3’
(用于pHMG1S/T91E的引物)
(引物43(正向)：SEQ ID NO:55)
5’-aatacgcctcttcacgtcgtcGAAatcacagaactcggcgccatt-3’
(引物44(反向)：SEQ ID NO:56)
5’-aatggcgccgagttctgtgatTTCgacgacgtgaagaggcgtatt-3’
<用于HMG1S第339位突变丝氨酸的引物>
(用于pHMG1S/S339A的引物)
(引物45(正向)：SEQ ID NO:57)
5’-cgagtagatttgcaagactgcaaGCCgttaaatgcacaatcgc-3’
(引物46(反向)：SEQ ID NO:58)
5’-gcgattgtgcatttaacGGCttgcagtcttgcaaatctactcg-3’
(用于pHMG1S/S339D的引物)
(引物47(正向)：SEQ ID NO:59)
5’-cgagtagatttgcaagactgcaaGATgttaaatgcacaatcgc-3’
(引物48(反向)：SEQ ID NO:60)
5’-gcgattgtgcatttaacATCttgcagtcttgcaaatctactcg-3’
(用于pHMG1S/S339E的引物)
(引物49(正向)：SEQ ID NO:61)
5’-cgagtagatttgcaagactgcaaGAAgttaaatgcacaatcgc-3’
(引物50(反向)：SEQ ID NO:62)
5’-gcgattgtgcatttaacTTCttgcagtcttgcaaatctactcg-3’
<用于HMG1S的第287位突变丝氨酸的引物>
(用于pHMG1S/S287A的引物)
(引物57(正向)：SEQ ID NO:93)
5’-cttgtcaggtggggccaccGCCgtcttgttgaaggatggcatgac-3’
(引物58(反向)：SEQ ID NO:94)
5’-gtcatgccatccttcaacaagacGGCggtggccccacctgacaag-3’
(用于pHMG1S/S287D的引物)
(引物59(正向)：SEQ ID NO:95)
5’-gctatgtttatctctggtggcgccaccGATaccgttcttaagga-3’
(引物60(反向)：SEQ ID NO:96)
5’-tccttaagaacggtATCggtggcgccaccagagataaacatagc-3’
(用于pHMG1S/S287E的引物)
(引物61(正向)：SEQ ID NO:97)
5’-cttgtcaggtggggccaccGAAgtcttgttgaaggatggcatgac-3’
(引物62(反向)：SEQ ID NO:98)
5’-gtcatgccatccttcaacaagacTTCggtggccccacctgacaag-3’
<用于HMG1S的第574位突变酪氨酸的引物>
(用于pHMG1S/Y574A的引物)
(引物113(正向)：SEQ ID NO:150)
5’-gtcaagagtcacatgaagGCCaacagatccagcaaagatatgtct-3’
(引物114(反向)：SEQ ID NO:151)
5’-agacatatctttgctggatctgttGGCcttcatgtgactcttgac-3’
(用于pHMG1S/Y574F的引物)
(引物63(正向)：SEQ ID NO:99)
5’-gtcaagagtcacatgaagTTCaacagatccagcaaagatatgtct-3’
(引物64(反向)：SEQ ID NO:100)
5’-agacatatctttgctggatctgttGAActtcatgtgactcttgac-3’
(用于pHMG1S/Y574D的引物)
(引物65(正向)：SEQ ID NO:101)
5’-gtcaagagtcacatgaagGACaacagatccagcaaagatatgtct-3’
(引物66(反向)：SEQ ID NO:102)
5’-agacatatctttgctggatctgttGTCcttcatgtgactcttgac-3’
(用于pHMG1S/Y574E的引物)
(引物67(正向)：SEQ ID NO:103)
5’-gtcaagagtcacatgaagGAAaacagatccagcaaagatatgtct-3’
(引物68(反向)：SEQ ID NO:104)
5’-agacatatctttgctggatctgttTTCcttcatgtgactcttgac-3’
<用于HMG1S的第577位突变丝氨酸的引物>
(用于pHMG1S/S577A的引物)
(引物51(正向)：SEQ ID NO:63)
5’-caatagaGCCagccgagacatctctggagcaacg-3’
(引物52(反向)：SEQ ID NO:64)
5’-cggctGGCtctattgtatttcatgtgacttctcac-3’
(用于pHMG1S/S577D的引物)
(引物53(正向)：SEQ ID NO:65)
5’-gtcacatgaaatacaatagaGACagccgagacatctctggagc-3’
(引物54(反向)：SEQ ID NO:66)
5’-gctccagagatgtctcggctGTCtctattgtatttcatgtgac-3’
(用于pHMG1S/S577E的引物)
(引物55(正向)：SEQ ID NO:67)
5’-gtcacatgaaatacaatagaGAAagccgagacatctctggagc-3’
(引物56(反向)：SEQ ID NO:68)
5’-gctccagagatgtctcggctTTCtctattgtatttcatgtgac-3’
(制备表达突变的HMGR的转化体)
使用上述得到的各突变的HMG1S表达载体，通过热休克方法转化大肠杆菌，以获得表达各突变的HMG1S的转化体。BL21star(DE3)用作大肠杆菌。
(突变的HMGR的表达)
上述得到的表达各突变的HMG1S的各大肠杆菌转化体在2ml LB液体培养基中在37℃下过夜培养，培养之后的细菌培养物被转移至50ml LB液体培养基中，然后在37℃下摇床培养2小时，随后添加IPTG至终浓度为0.5mM，并在20℃下培养细胞6小时。向全部LB液体培养基中添加氨苄青霉素至浓度为50μg/ml。在完成所有培养步骤之后，将全部量的各细菌培养物在4℃下以5000g离心5分钟以收集细胞，然后在–20℃下保存颗粒。
(收集和纯化突变的HMGR)
将以上得到的各细菌细胞样品溶解到添加了100μM AEBSF、10μM亮抑酶肽、10mM DTT以及0.1％溶解酵素的结合缓冲液(40mM磷酸钠(pH8.0)、1mM EDTA、300mM氯化钠、0.1％TritonX-100、10％甘油、0.8mM咪唑)中。该细菌细胞在冰上冷却时通过Sonifier 450超声波仪(Branson)被破碎(破碎条件：工作周期(duty cycle)为50％，输出控制(outputcontrol)为2.5，1分钟×3)。然后在4℃下以15,000rpm离心15分钟，并将事先用结合缓冲液冲洗三次的100μl Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)添加到上清液中。将混合物在4℃下旋转摇动1小时，然后在4℃和8000rpm下离心5分钟。然后将树脂转移至空柱子上(Bio-Rad)，并使用冲洗缓冲液(20mM咪唑、其它成分与结合缓冲液类似)冲洗三次。将添加了100μM AEBSF、10μM亮抑酶肽和10mM DTT的15μl洗脱液(430mM咪唑，其它成分与结合缓冲液类似)添加到树脂上，然后将其在4℃以15,000rpm离心1分钟进行洗脱。将另外的20μl洗脱液添加到树脂，然后通过在4℃以15,000rpm离心1分钟来洗脱。得到总共35μl组氨酸标签纯化的突变的HMG1S蛋白质溶液。
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认得到的各蛋白质的数量和纯度。针对定量，对BSA标准溶液(100ng、300ng、1μg)同时进行电泳，进行CBB染色之后使用Gel Doc XR+和Image Lab，从凝胶中检测并确定带的强度。
(确定突变的HMGR的酶活性)
将1.65ng纯化之后得到的各HMG1S突变体添加到反应溶液(1mM NADPH、0.4mg/ml BSA、40mM磷酸钠(pH 8.0)、1mM EDTA、50mM氯化钠、1％TritonX-100、10％甘油、4mM DTT)中，并在37℃下预温育5分钟，随后添加20μM 14C标记的HMG-CoA(Perkin Elmer)(反应溶液终体积为26μl)，以及混合物在37℃反应15分钟。添加5μl的1mg/ml的甲羟戊酸内酯和5μl 6N盐酸，然后将混合物在室温下停留15分钟，然后通过添加125μl饱和的pH6.0的磷酸钾缓冲液来中和混合物。添加300μl乙酸乙酯，并剧烈混合，然后将混合物在20℃下以15,000rpm离心5分钟。在液体闪烁计数仪中，分析上清液中的乙酸乙酯层的放射性。各突变的HMG1S的酶活性结果如表2所示。酶活性表示为比活性，其中野生型HMG1S设置为等于1。
[表1]
在表1中，括号中的数字代表与用作标准的拟南芥HMGR(S型)的各保守区域的序列相似度的百分比(％)。“-”是指不存在相应的保守区域或特定氨基酸残基。
根据表1，可以发现在带有保守区域的其它类型HMGR中，存在对应前述氨基酸残基的氨基酸残基，其中所述保守区域相当于含有如SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR(HMG1S)的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基的保守区域。
在表2中，“-”意味着酶活性被消除，而分数为1或以上是指酶活性高于野生型。
根据表2的结果，首先表明当选自由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代时，酶活性被降低或消除。
同时它也表明，当选自由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被丙氨酸或苯丙氨酸取代时，与野生型相比，其酶活性降低但是也相对维持稳定。这表明其可以阻止体内磷酸化，并因此防止因那些位点的磷酸化而导致的酶活性抑制，因此可以维持稳定的酶活性。
接下来，当选自由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR第91位和339位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代时，酶活性增加。
也表明，当丙氨酸取代SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位和/或339位氨基酸残基时，其酶活性与野生型HMGR相比增加，但是低于那些假磷酸化的突变体。
这是显然的，因为在野生型中，这些氨基酸残基根据需要在体内被磷酸化，因此其酶活性被认为因为磷酸化而增加，在具有丙氨酸取代的能够抑制磷酸化的突变体中，酶活性被维持或被抑制。
然而，结果表明，当丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸取代SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第48位氨基酸残基时，酶活性与野生型没有区别，因此HMGR酶活性是不可控的。
这些结果表明，HMGR酶活性可以通过使选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470、509和574位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸被缺失、或被其它氨基酸残基取代来控制。
表1和2的结果也可以证明，HMGR酶活性可以通过使选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470、509位和574位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被其它氨基酸残基取代来控制。
这是显然的，在表达突变的蛋白质的转化体中甲羟戊酸产量以及类异戊二烯产量和类萜产量也是可控的，其中选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥HMGR第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失或被其它氨基酸残基取代。
(构建HbHMGR表达载体)
SEQ ID NO：105的序列，其为SEQ ID NO：10所示的来自橡胶树的HMG1的DNA序列(以下称之为HbHMG1)，使用下述引物通过PCR进行扩增。将得到的PCR产物使用大肠杆菌通过热休克方法克隆至pENTR/D-TOPO以得到称为pENTR/HbHMG1的入门载体。使用DH5α大肠杆菌，通过pENTR Directional TOPO克隆试剂盒制备入门载体。
(引物69：SEQ ID NO:106)
5'-CACCATGGACACCACCGGCCGGCTCCACCAC-3'
(引物70：SEQ ID NO:107)
5'-CGCCTCGAGTCAAGATGCAGCTTTAGACAT-3'
(制备表达载体(重组载体))
使用pENTR/HbHMG1，将靶蛋白的部分基因序列进行重组并转染至pET160-DEST中以得到表达载体pDEST-HbHMG1。Gateway系统(Invitrogen)的LR反应用于重组反应。
(制备突变的HbHMGR表达载体)
使用pDEST/HbHMG1作为模板通过PrimeSTAR HS(Takara)执行PCR反应。每份((25μl)PCR反应溶液样品的组成为1-5ng质粒、0.75μl如下所示的用于各突变的正向或反向引物、5μl用于primestar(Mg2+)的5×缓冲液、2μl dNTPmix、0.25μl primestar HS、以及15.75μlmilliQ水。使用下述预定反应循环执行PCR：步骤1：在98℃下2分钟，步骤2：98℃下10秒钟，步骤3：60℃下15秒，步骤4：68℃下8分钟，步骤2至4重复17分钟。将一部分PCR产物(7μl)进行电泳，并且当观察到扩增时，向PCR残留产物中添加0.2μl DpnI，并在37℃下反应3小时。将2μl反应溶液添加到20μl自制的大肠杆菌(DH5α)化学感受态细胞中，然后通过热休克方法转化细胞。将全部细菌培养物接种至包含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基中，并在37℃下过夜培养。在培养之后，通过克隆PCR筛选得到的克隆。通过Plasmid迷你试剂盒(Qiagen)执行质粒提取，并通过测序确认突变的插入以获得期望的突变的HbHMG1表达载体。通过该方法制备了总共21种突变的HbHMG1表达载体。包括作为阳性对照的丝氨酸-566位(相当于拟南芥的HMG1S的577位丝氨酸)突变的HbHMG1。使用ABI3130XI测序仪通过BigDye Terminator Cycle Sequencing V3.0Ready Reaction Kit(美国应用生物系统公司)进行序列确认。
制备各突变的HbHMG1中使用的引物如下所示。
<用于HbHMG1的第214位突变酪氨酸的引物>
(用于pHbHMG1/Y214F的引物)
(引物71(正向)：SEQ ID NO:108)
5’-gtagaagggttcgatTTCgagtcgattttaggac-3’
(引物72(反向)：SEQ ID NO:109)
5’-gtcctaaaatcgactcGAAatcgaacccttctac-3’
(用于pHbHMG1/Y214E的引物)
(引物73(正向)：SEQ ID NO:110)
5’-gtagaagggttcgatGAAgagtcgattttaggaca-3’
(引物74(反向)：SEQ ID NO:111)
5’-tgtcctaaaatcgactcTTCatcgaacccttctac-3’
<用于HbHMG1的第246位突变酪氨酸的引物>
(用于pHbHMG1/Y246F的引物)
(引物75(正向)：SEQ ID NO:112)
5’-gctgaacgggcgggagTTCtctgttccaatggc-3’
(引物76(反向)：SEQ ID NO:113)
5’-gccattggaacagaGAActcccgcccgttcagc-3’
(用于pHbHMG1/Y246E的引物)
(引物77(正向)：SEQ ID NO:114)
5’-gctgaacgggcgggagGAAtctgttccaatggc-3’
(引物78(反向)：SEQ ID NO:115)
5’-gccattggaacagaTTCctcccgcccgttcagc-3’
<用于HbHMG1的第400位突变丝氨酸的引物>
(用于pHbHMG1/S400A的引物)
(引物79(正向)：SEQ ID NO:116)
5’-gaaggacgtggcaaaGCCgttgtttgtgag-3’
(引物80(反向)：SEQ ID NO:117)
5’-ctcacaaacaacGGCtttgccacgtccttc-3’
(用于pHbHMG1/S400D的引物)
(引物81(正向)：SEQ ID NO:118)
5’-tgaaggacgtggcaaaGACgttgtttgtgaggcaattatcaag-3’
(引物82(反向)：SEQ ID NO:119)
5’-cttgataattgcctcacaaacaacGTCtttgccacgtccttca-3’
(用于pHbHMG1/S400E的引物)
(引物83(正向)：SEQ ID NO:120)
5’-tgaaggacgtggcaaaGAAgttgtttgtgaggcaattatcaag-3’
(引物84(反向)：SEQ ID NO:121)
5’-cttgataattgcctcacaaacaacTTCtttgccacgtccttca-3’
<用于HbHMG1的第459位突变苏氨酸的引物>
(用于pHbHMG1/T459C的引物)
(引物85(正向)：SEQ ID NO:122)
5’-ctgcaatctttattgccTGTggccaggatccagc-3’
(引物86(反向)：SEQ ID NO:123)
5’-gctggatcctggccACAggcaataaagattgcag-3’
(用于pHbHMG1/T459D的引物)
(引物87(正向)：SEQ ID NO:124)
5’-tcgtatctgcaatctttattgccGATggccaggatccagcacaga-3’
(引物88(反向)：SEQ ID NO:125)
5’-tctgtgctggatcctggccATCggcaataaagattgcagatacga-3’
(用于pHbHMG1/T459E的引物)
(引物89(正向)：SEQ ID NO:126)
5’-tcgtatctgcaatctttattgccGAAggccaggatccagcacaga-3’
(引物90(反向)：SEQ ID NO:127)
5’-tctgtgctggatcctggccTTCggcaataaagattgcagatacga-3’
<用于HbHMG1的第498位突变苏氨酸的引物>
(用于pHbHMG1/T498C的引物)
(引物91(正向)：SEQ ID NO:128)
5’-ctccattgaggtgggtTGTgtcggaggtggaactc-3’
(引物92(反向)：SEQ ID NO:129)
5’-gagttccacctccgacACAacccacctcaatggag-3’
(用于pHbHMG1/T498D的引物)
(引物93(正向)：SEQ ID NO:130)
5’-accatgccctccattgaggtgggtGACgtcggaggtggaactcaac-3’
(引物94(反向)：SEQ ID NO:131)
5’-gttgagttccacctccgacGTCacccacctcaatggagggcatggt-3’
(用于pHbHMG1/T498E的引物)
(引物95(正向)：SEQ ID NO:132)
5’-accatgccctccattgaggtgggtGAAgtcggaggtggaactcaac-3’
(引物96(反向)：SEQ ID NO:133)
5’-gttgagttccacctccgacTTCacccacctcaatggagggcatggt-3’
<用于HbHMG1的第566位突变丝氨酸的引物>
(用于pHbHMG1/S566A的引物)
(引物97(正向)：SEQ ID NO:134)
5’-gtcacatgaagtacaacagaGCCagcaaagatatgtctaaagct-3’
(引物98(反向)：SEQ ID NO:135)
5’-agctttagacatatctttgctGGCtctgttgtacttcatgtgact-3’
(用于pHbHMG1/S566D的引物)
(引物99(正向)：SEQ ID NO:136)
5’-gtcacatgaagtacaacagaGACagcaaagatatgtctaaagct-3’
(引物100(反向)：SEQ ID NO:137)
5’-agctttagacatatctttgctGTCtctgttgtacttcatgtgact-3’
<用于HbHMG1的第276位突变丝氨酸的引物>
(用于pHbHMG1/S276A的引物)
(引物101(正向)：SEQ ID NO:138)
5’-cttgtcaggtggggccaccGCCgtcttgttgaaggatggcatgac-3’
(引物102(反向)：SEQ ID NO:139)
5’-gtcatgccatccttcaacaagacGGCggtggccccacctgacaag-3’
(用于pHbHMG1/S276D的引物)
(引物103(正向)：SEQ ID NO:140)
5’-caggtggggccaccGACgtcttgttgaagg-3’
(引物104(反向)：SEQ ID NO:141)
5’-ccttcaacaagacGTCggtggccccacctg-3’
(用于pHbHMG1/S276E的引物)
(引物105(正向)：SEQ ID NO:142)
5’-cttgtcaggtggggccaccGAAgtcttgttgaaggatggcatgac-3’
(引物106(反向)：SEQ ID NO:143)
5’-gtcatgccatccttcaacaagacTTCggtggccccacctgacaag-3’
<用于HbHMG1的第563位突变酪氨酸的引物>
(用于pHbHMG1/Y563F的引物)
(引物107(正向)：SEQ ID NO:144)
5’-gtcaagagtcacatgaagTTCaacagatccagc-3’
(引物108(反向)：SEQ ID NO:145)
5’-gctggatctgttGAActtcatgtgactcttgac-3’
(用于pHbHMG1/Y563D的引物)
(引物109(正向)：SEQ ID NO:146)
5’-gtcaagagtcacatgaagGACaacagatccagc-3’
(引物110(反向)：SEQ ID NO:147)
5’-gctggatctgttGTCcttcatgtgactcttgac-3’
(用于pHbHMG1/Y563E的引物)
(引物111(正向)：SEQ ID NO:148)
5’-gtcaagagtcacatgaagGAAaacagatccagc-3’
(引物112(反向)：SEQ ID NO:149)
5’-gctggatctgttTTCcttcatgtgactcttgac-3’
(制备表达突变的HbHMGR的转化体)
使用上述得到的各突变的HbHMG1表达载体，通过热休克方法转化大肠杆菌，以获得表达各突变的HbHMG1的转化体。BL21Star(DE3)用作大肠杆菌。
(突变的HbHMGR的表达)
上述得到的表达各突变的HbHMG1的各大肠杆菌转化体在2ml LB液体培养基中在37℃下过夜培养，培养之后的细菌培养物被转移至50ml LB液体培养基中，然后在37℃下摇床培养2小时，随后添加IPTG至终浓度为0.5mM，并在20℃下培养细胞6小时。向全部LB液体培养基中添加氨苄青霉素至浓度为50μg/ml。在完成所有培养步骤之后，将全部量的各细菌培养物在4℃下以5000g离心5分钟以收集细胞，然后在–20℃下保存颗粒。
(收集和纯化突变的HbHMGR)
将以上得到的各细菌细胞样品溶解到添加了100μM AEBSF、10μM亮抑酶肽、10mM DTT以及0.1％溶解酵素的结合缓冲液(40mM磷酸钠(pH8.0)、1mM EDTA、300mM氯化钠、0.1％TritonX-100、10％甘油、0.8mM咪唑)中。该细菌细胞在冰上冷却时通过Sonifier450超声波仪(Branson)被破碎(破碎条件：工作周期(duty cycle)为50％，输出控制(outputcontrol)为2.5，1分钟×3)。然后在4℃下以15,000rpm离心15分钟，并将事先用结合缓冲液冲洗三次的100μl Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)添加到上清液中。将混合物在4℃下旋转摇动1小时，然后在4℃和8000rpm下离心5分钟。然后将树脂转移至空柱子上(Bio-Rad)，并使用冲洗缓冲液(20mM咪唑、其它成分与结合缓冲液类似)冲洗三次。将添加了100μM AEBSF、10μM亮抑酶肽和10mM DTT的15μl洗脱液(430mM咪唑，其它成分与结合缓冲液类似)添加到树脂上，然后将其在4℃以15,000rpm离心1分钟进行洗脱。将另外的20μl洗脱液添加到树脂，然后通过在4℃以15,000rpm离心1分钟来洗脱。得到总共35μl组氨酸标签纯化的突变的HMG1S蛋白质溶液。
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认得到的各蛋白质的数量和纯度。针对定量，对BSA标准溶液(100ng、300ng、1μg)同时进行电泳，进行CBB染色之后使用Gel Doc XR+和Image Lab从凝胶中检测并确定带的强度。
(确定突变的HbHMGR的酶活性)
将1.65ng纯化之后得到的各HbHMG1突变体添加到反应溶液(1mM NADPH、0.4mg/mlBSA、40mM磷酸钠(pH 8.0)、1mM EDTA、50mM氯化钠、1％TritonX-100、10％甘油、4mMDTT)中，并在37℃下预温育5分钟，随后添加20μM 14C标记的HMG-CoA(Perkin Elmer)(反应溶液终体积为26μl)，以及混合物在37℃反应15分钟。添加5μl的1mg/ml的甲羟戊酸内酯和5μl 6N盐酸，然后将混合物在室温下停留15分钟，然后通过添加125μl饱和的pH6.0的磷酸钾缓冲液来中和混合物。添加300μl乙酸乙酯，并剧烈混合，然后将混合物在20℃下以15,000rpm离心5分钟。在液体闪烁计数仪中，分析上清液中的乙酸乙酯层的放射性。各突变的HbHMG1的酶活性结果如表3所示。酶活性表示为比活性，并且野生型HMG1S的酶活性设为等于1。
在表3中，“-”意味着酶活性被消除，而分数为1或以上是指酶活性高于野生型。
根据表3的结果，首先表明当选自由SEQ ID NO：10所示的橡胶树HMG1的第214位、246位、276位、400位、459位、498位和563位氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代时，酶活性被降低或消除。
同时它也表明，当选自SEQ ID NO：10所示的橡胶树HMG1的第214位、246位、276位、400位、459位、498位和563位氨基酸残基的至少一种氨基酸残基被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代时，其酶活性与野生型相当或者低于野生型但是也相对维持稳定。这表明其可以阻止体内磷酸化，并因此防止因那些位点的磷酸化而导致的酶活性抑制，因此可以维持稳定的酶活性。
序列表部分的自由文字
SEQ ID NO:1：源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的HMGR(S型)的氨基酸序列
SEQ ID NO:2：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第48位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:3：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第91位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:4：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第225位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:5：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第257位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:6：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第339位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:7：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第411位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:8：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第470位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:9：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)中第509位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:10：源自橡胶树(Hevea brasiliensis)的HMG1的氨基酸序列
SEQ ID NO:11：源自橡胶草(Taraxacum koksaghyz)的HMGR的氨基酸序列
SEQ ID NO:12：编码源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的HMGR(S型)的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO:13：引物1
SEQ ID NO:14：引物2
SEQ ID NO:15：引物3
SEQ ID NO:16：引物4
SEQ ID NO:17：引物5
SEQ ID NO:18：引物6
SEQ ID NO:19：引物7
SEQ ID NO:20：引物8
SEQ ID NO:21：引物9
SEQ ID NO:22：引物10
SEQ ID NO:23：引物11
SEQ ID NO:24：引物12
SEQ ID NO:25：引物13
SEQ ID NO:26：引物14
SEQ ID NO:27：引物15
SEQ ID NO:28：引物16
SEQ ID NO:29：引物17
SEQ ID NO:30：引物18
SEQ ID NO:31：引物19
SEQ ID NO:32：引物20
SEQ ID NO:33：引物21
SEQ ID NO:34：引物22
SEQ ID NO:35：引物23
SEQ ID NO:36：引物24
SEQ ID NO:37：引物25
SEQ ID NO:38：引物26
SEQ ID NO:39：引物27
SEQ ID NO:40：引物28
SEQ ID NO:41：引物29
SEQ ID NO:42：引物30
SEQ ID NO:43：引物31
SEQ ID NO:44：引物32
SEQ ID NO:45：引物33
SEQ ID NO:46：引物34
SEQ ID NO:47：引物35
SEQ ID NO:48：引物36
SEQ ID NO:49：引物37
SEQ ID NO:50：引物38
SEQ ID NO:51：引物39
SEQ ID NO:52：引物40
SEQ ID NO:53：引物41
SEQ ID NO:54：引物42
SEQ ID NO:55：引物43
SEQ ID NO:56：引物44
SEQ ID NO:57：引物45
SEQ ID NO:58：引物46
SEQ ID NO:59：引物47
SEQ ID NO:60：引物48
SEQ ID NO:61：引物49
SEQ ID NO:62：引物50
SEQ ID NO:63：引物51
SEQ ID NO:64：引物52
SEQ ID NO:65：引物53
SEQ ID NO:66：引物54
SEQ ID NO:67：引物55
SEQ ID NO:68：引物56
SEQ ID NO:69：源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的HMG2的氨基酸序列
SEQ ID NO:70：源自橡胶树(Hevea brasiliensis)的HMG2的氨基酸序列
SEQ ID NO:71：源自橡胶树(Hevea brasiliensis)的HMG3的氨基酸序列
SEQ ID NO:72：源自橡胶树(Hevea brasiliensis)的HMG4的氨基酸序列
SEQ ID NO:73：源自橡胶树(Hevea brasiliensis)的HMG5的氨基酸序列
SEQ ID NO:74：源自莴苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC18019)的氨基酸序列
SEQ ID NO:75：源自莴苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC23858)的氨基酸序列
SEQ ID NO:76：源自莴苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC19509)的氨基酸序列
SEQ ID NO:77：源自莴苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC22046)的氨基酸序列
SEQ ID NO:78：源自莴苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC22228)的氨基酸序列
SEQ ID NO:79：源自莴苣(Lactuca sativa Lettuce)的HMGR(TC23348)的氨基酸序列
SEQ ID NO:80：源自木薯(Manihot esculenta)的HMGR(003982m)的氨基酸序列
SEQ ID NO:81：源自木薯(Manihot esculenta)的HMGR(004209m)的氨基酸序列
SEQ ID NO:82：源自杜仲(Eucommia ulmondes)的HMGR的氨基酸序列
SEQ ID NO:83：源自泽漆(Euphorbia helioscopia L.)的HMGR的氨基酸序列
SEQ ID NO:84：源自水稻(Oryza sativa)的HMG1的氨基酸序列
SEQ ID NO:85：源自马铃薯(Solanum tuberosum L.)的HMG1的氨基酸序列
SEQ ID NO:86：源自马铃薯(Solanum tuberosum L.)的HMG2的氨基酸序列
SEQ ID NO:87：源自马铃薯(Solanum tuberosum L.)的HMG3的氨基酸序列
SEQ ID NO:88：源自番茄(Solanum lycopersicum)的HMG2的氨基酸序列
SEQ ID NO:89：源自南苜蓿(Medicago polymorpha)的HMG4的氨基酸序列
SEQ ID NO:90：源自南苜蓿(Medicago polymorpha)的HMG5的氨基酸序列
SEQ ID NO:91：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的第287位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:92：包含SEQ ID NO：1的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的第574位氨基酸残基的保守区域的氨基酸序列
SEQ ID NO:93：引物57
SEQ ID NO:94：引物58
SEQ ID NO:95：引物59
SEQ ID NO:96：引物60
SEQ ID NO:97：引物61
SEQ ID NO:98：引物62
SEQ ID NO:99：引物63
SEQ ID NO:100：引物64
SEQ ID NO:101：引物65
SEQ ID NO:102：引物66
SEQ ID NO:103：引物67
SEQ ID NO:104：引物68
SEQ ID NO:105：编码源自橡胶树(Hevea brasiliensis)的HMG1的基因的核苷酸序列
SEQ ID NO:106：引物69
SEQ ID NO:107：引物70
SEQ ID NO:108：引物71
SEQ ID NO:109：引物72
SEQ ID NO:110：引物73
SEQ ID NO:111：引物74
SEQ ID NO:112：引物75
SEQ ID NO:113：引物76
SEQ ID NO:114：引物77
SEQ ID NO:115：引物78
SEQ ID NO:116：引物79
SEQ ID NO:117：引物80
SEQ ID NO:118：引物81
SEQ ID NO:119：引物82
SEQ ID NO:120：引物83
SEQ ID NO:121：引物84
SEQ ID NO:122：引物85
SEQ ID NO:123：引物86
SEQ ID NO:124：引物87
SEQ ID NO:125：引物88
SEQ ID NO:126：引物89
SEQ ID NO:127：引物90
SEQ ID NO:128：引物91
SEQ ID NO:129：引物92
SEQ ID NO:130：引物93
SEQ ID NO:131：引物94
SEQ ID NO:132：引物95
SEQ ID NO:133：引物96
SEQ ID NO:134：引物97
SEQ ID NO:135：引物98
SEQ ID NO:136：引物99
SEQ ID NO:137：引物100
SEQ ID NO:138：引物101
SEQ ID NO:139：引物102
SEQ ID NO:140：引物103
SEQ ID NO:141：引物104
SEQ ID NO:142：引物105
SEQ ID NO:143：引物106
SEQ ID NO:144：引物107
SEQ ID NO:145：引物108
SEQ ID NO:146：引物109
SEQ ID NO:147：引物110
SEQ ID NO:148：引物111
SEQ ID NO:149：引物112
SEQ ID NO:150：引物113
SEQ ID NO:151：引物114
SEQUENCE LISTING
<110> SUMITOMO RUBBER INDUSTRIES, LTD.
<120> MUTEIN, METHOD FOR PRODUING SAID MUTEIN, GENE ENCODING SAID MUTEIN,RECOMBINANT VECTOR AND PLANT BEARING SAID GENE, METHOD FOR CONTROLLING AMOUNTOF MEVALONIC ACID PRODUCED AND AMOUNT OF ISOPRENOID PRODUCED, METHOD FORCONTROLLING 3-HYDROXY-3-METHYLGLUTARYL-COA REDUCTASE ACTIVITY
<130> SR2104WO
<140> PCT/JP2015/064821
<141> 2015-05-22
<150> JP 2014-107508
<151> 2014-05-23
<160> 151
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 592
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 1
Met Asp Leu Arg Arg Arg Pro Pro Lys Pro Pro Val Thr Asn Asn Asn
1 5 10 15
Asn Ser Asn Gly Ser Phe Arg Ser Tyr Gln Pro Arg Thr Ser Asp Asp
20 25 30
Asp His Arg Arg Arg Ala Thr Thr Ile Ala Pro Pro Pro Lys Ala Ser
35 40 45
Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Ala Val Phe Phe Thr
50 55 60
Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys
65 70 75 80
Ile Arg Tyr Asn Thr Pro Leu His Val Val Thr Ile Thr Glu Leu Gly
85 90 95
Ala Ile Ile Ala Leu Ile Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe
100 105 110
Gly Ile Asp Phe Val Gln Ser Phe Ile Ser Arg Ala Ser Gly Asp Ala
115 120 125
Trp Asp Leu Ala Asp Thr Ile Asp Asp Asp Asp His Arg Leu Val Thr
130 135 140
Cys Ser Pro Pro Thr Pro Ile Val Ser Val Ala Lys Leu Pro Asn Pro
145 150 155 160
Glu Pro Ile Val Thr Glu Ser Leu Pro Glu Glu Asp Glu Glu Ile Val
165 170 175
Lys Ser Val Ile Asp Gly Val Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Arg
180 185 190
Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ser Ile Arg Arg Glu Ala Leu Gln
195 200 205
Arg Val Thr Gly Arg Ser Ile Glu Gly Leu Pro Leu Asp Gly Phe Asp
210 215 220
Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr Ile
225 230 235 240
Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Tyr Glu
245 250 255
Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr
260 265 270
Asn Arg Gly Cys Lys Ala Met Phe Ile Ser Gly Gly Ala Thr Ser Thr
275 280 285
Val Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Ala Ser
290 295 300
Ala Arg Arg Ala Ser Glu Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asn Pro Glu Asn
305 310 315 320
Phe Asp Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe Ala Arg
325 330 335
Leu Gln Ser Val Lys Cys Thr Ile Ala Gly Lys Asn Ala Tyr Val Arg
340 345 350
Phe Cys Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys
355 360 365
Gly Val Gln Asn Val Leu Glu Tyr Leu Thr Asp Asp Phe Pro Asp Met
370 375 380
Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala
385 390 395 400
Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala
405 410 415
Val Ile Arg Gly Glu Ile Val Asn Lys Val Leu Lys Thr Ser Val Ala
420 425 430
Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Ala Gly Ser Ala Val
435 440 445
Ala Gly Ser Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val Ser
450 455 460
Ala Val Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser
465 470 475 480
Ser Gln Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Ile Asn Asp Gly Lys Asp Ile
485 490 495
His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly
500 505 510
Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val
515 520 525
Lys Gly Ala Ser Thr Glu Ser Pro Gly Met Asn Ala Arg Arg Leu Ala
530 535 540
Thr Ile Val Ala Gly Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser
545 550 555 560
Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Arg Ser His Met Lys Tyr Asn Arg
565 570 575
Ser Ser Arg Asp Ile Ser Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr
580 585 590
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 2
Ser Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr
1 5 10
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 3
Thr Pro Leu His Val Val Thr
1 5
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 4
Gly Phe Asp Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met
1 5 10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 5
Glu Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 6
Ser Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln Ser
1 5
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 7
Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala
1 5 10 15
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 8
Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 25
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 9
His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly
1 5 10 15
Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala
20 25
<210> 10
<211> 575
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 10
Met Asp Thr Thr Gly Arg Leu His His Arg Lys His Ala Thr Pro Val
1 5 10 15
Glu Asp Arg Ser Pro Thr Thr Pro Lys Ala Ser Asp Ala Leu Pro Leu
20 25 30
Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Ala Val Phe Phe Thr Leu Phe Phe Ser Val
35 40 45
Ala Tyr Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys Ile Arg Asn Ser Thr
50 55 60
Pro Leu His Ile Val Thr Leu Ser Glu Ile Val Ala Ile Val Ser Leu
65 70 75 80
Ile Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile Asp Phe Val
85 90 95
Gln Ser Phe Ile Ala Arg Ala Ser His Asp Val Trp Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Thr Asp Pro Asn Tyr Leu Ile Asp Glu Asp His Arg Leu Val Thr Cys
115 120 125
Pro Pro Ala Asn Ile Ser Thr Lys Thr Thr Ile Ile Ala Ala Pro Thr
130 135 140
Lys Leu Pro Thr Ser Glu Pro Leu Ile Ala Pro Leu Val Ser Glu Glu
145 150 155 160
Asp Glu Met Ile Val Asn Ser Val Val Asp Gly Lys Ile Pro Ser Tyr
165 170 175
Ser Leu Glu Ser Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ala Ile Arg
180 185 190
Arg Glu Ala Leu Gln Arg Met Thr Arg Arg Ser Leu Glu Gly Leu Pro
195 200 205
Val Glu Gly Phe Asp Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met
210 215 220
Pro Val Gly Tyr Val Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu
225 230 235 240
Leu Asn Gly Arg Glu Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys
245 250 255
Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Leu Ser Gly
260 265 270
Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val
275 280 285
Val Arg Phe Ala Ser Ala Thr Arg Ala Ala Glu Leu Lys Phe Phe Leu
290 295 300
Glu Asp Pro Asp Asn Phe Asp Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Lys Ser
305 310 315 320
Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln Gly Ile Lys Cys Ser Ile Ala Gly Lys
325 330 335
Asn Leu Tyr Ile Arg Phe Ser Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met
340 345 350
Asn Met Val Ser Lys Gly Val Gln Asn Val Leu Glu Phe Leu Gln Ser
355 360 365
Asp Phe Ser Asp Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser
370 375 380
Asp Lys Lys Pro Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser
385 390 395 400
Val Val Cys Glu Ala Ile Ile Lys Glu Glu Val Val Lys Lys Val Leu
405 410 415
Lys Thr Asn Val Ala Ser Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu
420 425 430
Ala Gly Ser Ala Val Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala
435 440 445
Gly Asn Ile Val Ser Ala Ile Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala
450 455 460
Gln Asn Val Glu Ser Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn
465 470 475 480
Asp Gly Lys Asp Leu His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val
485 490 495
Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu
500 505 510
Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly Ala Asn Lys Glu Ser Pro Gly Ser Asn
515 520 525
Ser Arg Leu Leu Ala Ala Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu
530 535 540
Leu Ser Leu Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Lys Ser His
545 550 555 560
Met Lys Tyr Asn Arg Ser Ser Lys Asp Met Ser Lys Ala Ala Ser
565 570 575
<210> 11
<211> 582
<212> PRT
<213> Taraxacum koksaghys
<400> 11
Met Asp Val Gly Arg Arg Ser Ser Leu Lys Pro Ala Ala Thr Lys Gly
1 5 10 15
Lys Thr Met Ala Glu Asp Gln Tyr Asp Asp Gln Ile Phe Lys Ala Asp
20 25 30
Lys Lys Val Val Asp Ala Val Val Asn Pro Leu Pro Val Gly Ile Ser
35 40 45
Asn Gly Val Phe Phe Thr Val Phe Phe Ser Val Val Tyr Phe Leu Leu
50 55 60
Ile Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg Ser Ser Thr Pro Leu His Val Val
65 70 75 80
Thr Met Ser Glu Met Ala Ala Ile Phe Phe Phe Val Ala Ser Phe Ile
85 90 95
Tyr Leu Val Gly Phe Phe Gly Met Ser Phe Val Gln Ala Thr Pro Tyr
100 105 110
Asp Glu Glu Glu Glu Leu Glu Val Asp Glu Thr Glu Ile Val Arg Lys
115 120 125
Glu Asp Thr Arg Val Thr Pro Cys Gly Ala Ala Leu Asp Cys Glu Ser
130 135 140
Asp Val Val Val Lys Gln Val Val Lys Lys Glu Leu Val Phe Thr Pro
145 150 155 160
Thr Asp Thr Thr Val Val Thr Glu Glu Asp Glu Glu Val Ile Gln Ser
165 170 175
Val Val Ser Gly Lys Thr Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Lys Leu Gly
180 185 190
Asp Cys Lys Arg Ala Ala Phe Ile Arg Arg Val Ala Leu Glu Arg Ile
195 200 205
Thr Gly Lys Ser Leu Asp Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Glu
210 215 220
Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr Val Gln Ile
225 230 235 240
Pro Val Gly Val Ala Gly Pro Met Leu Leu Asn Gly Lys Glu Phe Ser
245 250 255
Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg
260 265 270
Gly Phe Lys Ala Ile Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Thr Ser Ile Leu Leu
275 280 285
Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Gly Thr Ala Arg
290 295 300
Arg Ala Ala Asp Leu Lys Phe Phe Leu Glu Glu Pro Leu Asn Phe Glu
305 310 315 320
Thr Leu Ala Ser Val Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe Gly Arg Leu Gln
325 330 335
Lys Ile Gln Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Met Arg Phe Thr
340 345 350
Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly Val
355 360 365
Gln Asn Val Leu Glu Tyr Leu Gln Ser Asp Phe Pro Asp Met Asp Val
370 375 380
Ile Gly Ile Ser Gly Asn Tyr Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala Val
385 390 395 400
Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Ile Ile
405 410 415
Lys Glu Asp Ile Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Asn Val Ala Ala Leu
420 425 430
Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser Ala Met Ala Gly
435 440 445
Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val Ser Ala Val
450 455 460
Tyr Leu Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Ile Glu Ser Ser His
465 470 475 480
Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu His Val
485 490 495
Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr
500 505 510
Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly
515 520 525
Ala Asn Arg Glu Ala Ala Gly Glu Asn Ala Arg Gln Leu Ala Lys Val
530 535 540
Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Leu Ser Ala Ile
545 550 555 560
Ala Ala Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Asn
565 570 575
Lys Asp Val Thr Lys Ala
580
<210> 12
<211> 1776
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 12
atggatctcc gtcggaggcc tcctaaacca ccggttacca acaacaacaa ctccaacgga 60
tctttccgtt cttatcagcc tcgcacttcc gatgacgatc atcgtcgccg ggctacaaca 120
attgctcctc caccgaaagc atccgacgcg cttcctcttc cgttatatct cacaaacgcc 180
gttttcttca cgctcttctt ctccgtcgcg tattacctcc tccaccggtg gcgtgacaag 240
atccgttaca atacgcctct tcacgtcgtc actatcacag aactcggcgc cattattgct 300
ctcatcgctt cgtttatcta tctcctaggg ttttttggta ttgactttgt tcagtcattt 360
atctcacgtg cctctggtga tgcttgggat ctcgccgata cgatcgatga tgatgaccac 420
cgccttgtca cgtgctctcc accgactccg atcgtttccg ttgctaaatt acctaatccg 480
gaacctattg ttaccgaatc gcttcctgag gaagacgagg agattgtgaa atcggttatc 540
gacggagtta ttccatcgta ctcgcttgaa tctcgtctcg gtgattgcaa aagagcggcg 600
tcgattcgtc gtgaggcgtt gcagagagtc accgggagat cgattgaagg gttaccgttg 660
gatggatttg attatgaatc gattttgggg caatgctgtg agatgcctgt tggatacatt 720
cagattcctg ttgggattgc tggtccattg ttgcttgatg gttatgagta ctctgttcct 780
atggctacaa ccgaaggttg tttggttgct agcactaaca gaggctgcaa ggctatgttt 840
atctctggtg gcgccaccag taccgttctt aaggacggta tgacccgagc acctgttgtt 900
cggttcgctt cggcgagacg agcttcggag cttaagtttt tcttggagaa tccagagaac 960
tttgatactt tggcagtagt cttcaacagg tcgagtagat ttgcaagact gcaaagtgtt 1020
aaatgcacaa tcgcggggaa gaatgcttat gtaaggttct gttgtagtac tggtgatgct 1080
atggggatga atatggtttc taaaggtgtg cagaatgttc ttgagtatct taccgatgat 1140
ttccctgaca tggatgtgat tggaatctct ggtaacttct gttcggacaa gaaacctgct 1200
gctgtgaact ggattgaggg acgtggtaaa tcagttgttt gcgaggctgt aatcagagga 1260
gagatcgtga acaaggtctt gaaaacgagc gtggctgctt tagtcgagct caacatgctc 1320
aagaacctag ctggctctgc tgttgcaggc tctctaggtg gattcaacgc tcatgccagt 1380
aacatagtgt ctgctgtatt catagctact ggccaagatc cagctcaaaa cgtggagagt 1440
tctcaatgca tcaccatgat ggaagctatt aatgacggca aagatatcca tatctcagtc 1500
actatgccat ctatcgaggt ggggacagtg ggaggaggaa cacagcttgc atctcaatca 1560
gcgtgtttaa acctgctcgg agttaaagga gcaagcacag agtcgccggg aatgaacgca 1620
aggaggctag cgacgatcgt agccggagca gttttagctg gagagttatc tttaatgtca 1680
gcaattgcag ctggacagct tgtgagaagt cacatgaaat acaatagatc cagccgagac 1740
atctctggag caacgacaac gacaacaaca acaaca 1776
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-01
<400> 13
caccatggat ctccgtcgga ggcctc 26
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-02
<400> 14
cgcctcgagt catgttgttg ttgttgtcg 29
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-03
<400> 15
ttgattttga atcgattttg gggcaatgc 29
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-04
<400> 16
gattcaaaat caaatccatc caacggtaa 29
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-05
<400> 17
ttaccgttgg atggatttga tgatgaatcg attttggggc aatgc 45
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-06
<400> 18
gcattgcccc aaaatcgatt cggcatcaaa tccatccaac ggtaa 45
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-07
<400> 19
ttaccgttgg atggatttga tgaggaatcg attttggggc aatgc 45
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-08
<400> 20
gcattgcccc aaaatcgatt cctcatcaaa tccatccaac ggtaa 45
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-09
<400> 21
atgagttctc tgttcctatg gctacaacc 29
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-10
<400> 22
acagagaact cataaccatc aagcaacaa 29
<210> 23
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-11
<400> 23
ttgttgcttg atggttatga ggactctgtt cctatggcta caacc 45
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-12
<400> 24
ggttgtagcc ataggaacag agtcctcata accatcaagc aacaa 45
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-13
<400> 25
ttgttgcttg atggttatga ggaatctgtt cctatggcta caacc 45
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-14
<400> 26
ggttgtagcc ataggaacag attcctcata accatcaagc aacaa 45
<210> 27
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-15
<400> 27
ggattgaggg acgtggtaaa gcagttgttt gcgaggctgt aatc 44
<210> 28
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-16
<400> 28
gattacagcc tcgcaaacaa ctgctttacc acgtccctca atcc 44
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-17
<400> 29
ggattgaggg acgtggtaaa gatgttgttt gcgaggctgt aatc 44
<210> 30
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-18
<400> 30
gattacagcc tcgcaaacaa catctttacc acgtccctca atcc 44
<210> 31
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-19
<400> 31
ggattgaggg acgtggtaaa gaagttgttt gcgaggctgt aatc 44
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-20
<400> 32
gattacagcc tcgcaaacaa cttctttacc acgtccctca atcc 44
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-21
<400> 33
gctgcaggcc aagatccagc tcaaaacgtg 30
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-22
<400> 34
ggcctgcagc tatgaataca gcagacac 28
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-23
<400> 35
gctgatggcc aagatccagc tcaaaacgtg 30
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-24
<400> 36
ggccatcagc tatgaataca gcagacac 28
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-25
<400> 37
gctgaaggcc aagatccagc tcaaaacgtg 30
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-26
<400> 38
ggccttcagc tatgaataca gcagacac 28
<210> 39
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-27
<400> 39
ccatctatcg aggtgggggc agtgggagga ggaacacagc ttgc 44
<210> 40
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-28
<400> 40
gcaagctgtg ttcctcctcc cactgccccc acctcgatag atgg 44
<210> 41
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-29
<400> 41
ccatctatcg aggtggggga tgtgggagga ggaacacagc ttgc 44
<210> 42
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-30
<400> 42
gcaagctgtg ttcctcctcc cacatccccc acctcgatag atgg 44
<210> 43
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-31
<400> 43
ccatctatcg aggtggggga agtgggagga ggaacacagc ttgc 44
<210> 44
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-32
<400> 44
gcaagctgtg ttcctcctcc cacttccccc acctcgatag atgg 44
<210> 45
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-33
<400> 45
attgctcctc caccgaaagc agccgacgcg cttcctcttc cgtta 45
<210> 46
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-34
<400> 46
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<210> 47
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-35
<400> 47
attgctcctc caccgaaagc agacgacgcg cttcctcttc cgtta 45
<210> 48
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-36
<400> 48
taacggaaga ggaagcgcgt cgtctgcttt cggtggagga gcaat 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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attgctcctc caccgaaagc agaagacgcg cttcctcttc cgtta 45
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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aatacgcctc ttcacgtcgt cgcaatcaca gaactcggcg ccatt 45
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<213> Artificial Sequence
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aatggcgccg agttctgtga ttgcgacgac gtgaagaggc gtatt 45
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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aatggcgccg agttctgtga tatcgacgac gtgaagaggc gtatt 45
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 43
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<213> Artificial Sequence
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<400> 57
cgagtagatt tgcaagactg caagccgtta aatgcacaat cgc 43
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 58
gcgattgtgc atttaacggc ttgcagtctt gcaaatctac tcg 43
<210> 59
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-47
<400> 59
cgagtagatt tgcaagactg caagatgtta aatgcacaat cgc 43
<210> 60
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 60
gcgattgtgc atttaacatc ttgcagtctt gcaaatctac tcg 43
<210> 61
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-49
<400> 61
cgagtagatt tgcaagactg caagaagtta aatgcacaat cgc 43
<210> 62
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 62
gcgattgtgc atttaacttc ttgcagtctt gcaaatctac tcg 43
<210> 63
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 63
caatagagcc agccgagaca tctctggagc aacg 34
<210> 64
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-52
<400> 64
cggctggctc tattgtattt catgtgactt ctcac 35
<210> 65
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-53
<400> 65
gtcacatgaa atacaataga gacagccgag acatctctgg agc 43
<210> 66
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 66
gctccagaga tgtctcggct gtctctattg tatttcatgt gac 43
<210> 67
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-55
<400> 67
gtcacatgaa atacaataga gaaagccgag acatctctgg agc 43
<210> 68
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-56
<400> 68
gctccagaga tgtctcggct ttctctattg tatttcatgt gac 43
<210> 69
<211> 562
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 69
Met Glu Asp Leu Arg Arg Arg Phe Pro Thr Lys Lys Asn Gly Glu Glu
1 5 10 15
Ile Ser Asn Val Ala Val Asp Pro Pro Leu Arg Lys Ala Ser Asp Ala
20 25 30
Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Thr Phe Phe Leu Ser Leu Phe
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Phe Ala Thr Val Tyr Phe Leu Leu Ser Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg
50 55 60
Asn Ser Thr Pro Leu His Val Val Asp Leu Ser Glu Ile Cys Ala Leu
65 70 75 80
Ile Gly Phe Val Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Cys Gly Ile
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Arg Ser Ser Ser Asp Asp Asp Val Trp Val Asn Asp
100 105 110
Gly Met Ile Pro Cys Asn Gln Ser Leu Asp Cys Arg Glu Val Leu Pro
115 120 125
Ile Lys Pro Asn Ser Val Asp Pro Pro Arg Glu Ser Glu Leu Asp Ser
130 135 140
Val Glu Asp Glu Glu Ile Val Lys Leu Val Ile Asp Gly Thr Ile Pro
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Leu Glu Thr Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ala
165 170 175
Ile Arg Arg Glu Ala Val Gln Arg Ile Thr Gly Lys Ser Leu Thr Gly
180 185 190
Leu Pro Leu Glu Gly Phe Asp Tyr Asn Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys
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Glu Met Pro Val Gly Tyr Val Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro
210 215 220
Leu Leu Leu Asp Gly Val Glu Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu
225 230 235 240
Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly Phe Lys Ala Ile His Leu
245 250 255
Ser Gly Gly Ala Phe Ser Val Leu Val Lys Asp Ala Met Thr Arg Ala
260 265 270
Pro Val Val Arg Phe Pro Ser Ala Arg Arg Ala Ala Leu Val Met Phe
275 280 285
Tyr Leu Gln Asp Pro Ser Asn Phe Glu Arg Leu Ser Leu Ile Phe Asn
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Lys Ser Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ala
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Gly Arg Asn Leu Tyr Pro Arg Phe Ala Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met
325 330 335
Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly Val Gln Asn Val Leu Asp Phe Val
340 345 350
Lys Ser Glu Phe Pro Asp Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Tyr
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Cys Ser Asp Lys Lys Ala Ser Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly
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385 390 395 400
Val Leu Lys Thr Ser Val Glu Ala Leu Val Glu Leu Asn Thr Leu Lys
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Asn Leu Val Gly Ser Ala Met Ala Gly Ser Leu Gly Gly Phe Asn Ala
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His Ser Ser Asn Ile Val Ser Ala Val Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp
435 440 445
Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser His Cys Met Thr Met Ile Leu Pro
450 455 460
Asp Gly Asp Asp Leu His Ile Ser Val Ser Met Pro Cys Ile Glu Val
465 470 475 480
Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ala Ala Cys Leu
485 490 495
Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly Ser Asn Asn Glu Lys Pro Gly Ser Asn
500 505 510
Ala Gln Gln Leu Ala Arg Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu
515 520 525
Leu Ser Leu Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Lys Ser His
530 535 540
Met Lys Tyr Asn Arg Ser Ser Arg Asp Ile Gly Pro Ser Ser Gln Val
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Asn Arg
<210> 70
<211> 210
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 70
Leu Glu Ser Asp Phe Ala Asp Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn
1 5 10 15
Phe Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg
20 25 30
Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Ile Ile Lys Glu Glu Val Val Lys
35 40 45
Lys Val Leu Lys Thr Asp Val Ala Leu Leu Val Glu Leu Asn Met Leu
50 55 60
Lys Asn Leu Ala Gly Ser Ala Val Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn
65 70 75 80
Ala His Ala Gly Asn Ile Val Ser Ala Ile Phe Ile Ala Thr Gly Gln
85 90 95
Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu
100 105 110
Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu His Ile Ser Val Thr Leu Pro Ser
115 120 125
Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser
130 135 140
Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val Met Gly Ala Cys Lys Glu Ser Pro
145 150 155 160
Gly Ser Tyr Ser Arg Leu Leu Ala Thr Ile Val Ala Gly Ser Val Leu
165 170 175
Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val
180 185 190
Lys Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Ser Lys Ala
195 200 205
Ala Ser
210
<210> 71
<211> 586
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 71
Met Asp Glu Val Arg Arg Arg Pro Pro Lys His Ile Val Arg Lys Asp
1 5 10 15
His Asp Gly Glu Val Leu Asn Ser Phe Ser His Gly His His Leu Pro
20 25 30
Pro Leu Lys Pro Ser Asp Tyr Ser Leu Pro Leu Ser Leu Tyr Leu Ala
35 40 45
Asn Ala Leu Val Phe Ser Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Phe Leu Leu
50 55 60
His Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg Lys Ser Thr Pro Leu His Ile Val
65 70 75 80
Thr Phe Pro Glu Ile Ala Ala Leu Ile Cys Leu Val Ala Ser Val Ile
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Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile Gly Phe Val His Ser Phe Ser Arg
100 105 110
Ala Ser Thr Asp Ser Trp Asp Val Glu Glu Tyr Asp Asp Asp Asn Ile
115 120 125
Ile Ile Lys Glu Asp Thr Arg Pro Thr Gly Ala Cys Ala Ala Pro Ser
130 135 140
Leu Asp Cys Ser Leu Ser Leu Pro Thr Lys Ile His Ala Pro Ile Val
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Ser Thr Thr Thr Thr Ser Thr Leu Ser Asp Asp Asp Glu Gln Ile Ile
165 170 175
Lys Ser Val Val Ser Gly Ser Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Lys
180 185 190
Leu Gly Asn Cys Lys Arg Ala Ala Leu Ile Arg Arg Glu Thr Leu Gln
195 200 205
Arg Met Ser Gly Arg Ser Leu Glu Gly Leu Pro Leu Asp Gly Phe Asp
210 215 220
Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Ala Ile Gly Tyr Val
225 230 235 240
Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Lys Glu
245 250 255
Tyr Thr Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Ala
260 265 270
Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Thr Ser Val
275 280 285
Leu Leu Arg Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Pro Thr
290 295 300
Ala Lys Arg Ala Ala Asp Leu Lys Phe Phe Met Glu Asp Pro Asp Asn
305 310 315 320
Phe Asp Thr Ile Ala Val Val Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe Ala Arg
325 330 335
Leu Gln Ser Val Gln Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Met Arg
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys
355 360 365
Ala Val Gln Asn Val Ile Asp Tyr Leu Gln Asn Asp Phe Pro Asp Met
370 375 380
Asp Val Ile Gly Leu Thr Gly Asn Phe Cys Ala Asp Lys Lys Ala Ala
385 390 395 400
Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala
405 410 415
Ile Ile Lys Glu Glu Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Asn Val Ala
420 425 430
Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Ile Lys Asn Leu Thr Gly Ser Ala Val
435 440 445
Ala Gly Ser Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Met Val Thr
450 455 460
Ala Val Tyr Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser
465 470 475 480
Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu
485 490 495
His Ile Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Leu Gly Thr Val Gly Gly
500 505 510
Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val
515 520 525
Lys Gly Ala Ser Lys Asp Ser Pro Gly Ser Asn Ser Arg Leu Leu Ala
530 535 540
Thr Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser
545 550 555 560
Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys Tyr Asn Arg
565 570 575
Ser Ala Lys Asp Val Ser Lys Ile Thr Phe
580 585
<210> 72
<211> 606
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 72
Met Asp Val Arg Arg Arg Pro Thr Ser Gly Lys Thr Ile His Ser Val
1 5 10 15
Lys Pro Lys Ser Val Glu Asp Glu Ser Ala Gln Lys Pro Ser Asp Ala
20 25 30
Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Ile Asn Ala Leu Cys Phe Thr Val Phe
35 40 45
Phe Tyr Val Val Tyr Phe Leu Leu Ser Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Leu His Val Val Ala Leu Ser Glu Ile Ala Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Phe Val Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile
85 90 95
Asp Phe Val Gln Ser Leu Ile Leu Arg Pro Pro Thr Asp Met Trp Ala
100 105 110
Val Asp Asp Asp Glu Glu Glu Thr Glu Glu Gly Ile Val Leu Arg Glu
115 120 125
Asp Thr Arg Lys Leu Pro Cys Gly Gln Ala Leu Asp Cys Ser Leu Ser
130 135 140
Ala Pro Pro Leu Ser Arg Ala Val Val Ser Ser Pro Lys Ala Met Asp
145 150 155 160
Pro Ile Val Leu Pro Ser Pro Lys Pro Lys Val Phe Asp Glu Ile Pro
165 170 175
Phe Pro Thr Thr Thr Thr Ile Pro Ile Leu Gly Asp Glu Asp Glu Glu
180 185 190
Ile Ile Lys Ser Val Val Ala Gly Thr Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu
195 200 205
Ser Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ala Ile Arg Arg Glu Ala
210 215 220
Leu Gln Arg Ile Thr Gly Lys Ser Leu Ser Gly Leu Pro Leu Glu Gly
225 230 235 240
Phe Asp Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly
245 250 255
Tyr Val Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly
260 265 270
Lys Glu Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala
275 280 285
Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile His Leu Ser Gly Gly Ala Thr
290 295 300
Ser Val Leu Leu Arg Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe
305 310 315 320
Gly Thr Ala Lys Arg Ala Ala Gln Leu Lys Leu Tyr Leu Glu Asp Pro
325 330 335
Ala Asn Phe Glu Thr Leu Ser Thr Ser Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe
340 345 350
Gly Arg Leu Gln Ser Ile Lys Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr
355 360 365
Met Arg Phe Cys Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val
370 375 380
Ser Lys Gly Val Gln Asn Val Leu Asn Phe Leu Gln Asn Asp Phe Pro
385 390 395 400
Asp Met Asp Val Ile Gly Leu Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys
405 410 415
Pro Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys
420 425 430
Glu Ala Ile Ile Lys Gly Asp Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Asn
435 440 445
Val Glu Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser
450 455 460
Ala Met Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile
465 470 475 480
Val Thr Ala Ile Tyr Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val
485 490 495
Glu Ser Ser Asn Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Gln
500 505 510
Asp Leu His Val Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val
515 520 525
Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu
530 535 540
Gly Val Lys Gly Ala Ser Lys Glu Thr Pro Gly Ala Asn Ser Arg Val
545 550 555 560
Leu Ala Ser Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Ala Glu Leu Ser Leu
565 570 575
Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys Tyr
580 585 590
Asn Arg Ala Asn Lys Glu Ala Ala Val Ser Lys Pro Ser Ser
595 600 605
<210> 73
<211> 526
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 73
Met Asp Ala Arg Arg Arg Pro Thr Ser Gly Asn Pro Ile His Ser Arg
1 5 10 15
Lys Val Lys Ala Leu Glu Asp Glu Asn Thr Gln Lys Pro Ser Asp Ala
20 25 30
Leu Pro Leu His Ile Tyr Leu Thr Asn Ala Leu Cys Phe Thr Val Phe
35 40 45
Phe Trp Val Val Tyr Phe Leu Leu Ser Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg
50 55 60
Thr Ser Ala Pro Leu His Val Val Thr Leu Ser Glu Ile Ala Ala Ile
65 70 75 80
Val Ala Leu Phe Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile
85 90 95
Asp Phe Val Gln Ser Leu Ile Leu Arg Pro Pro Thr Asp Met Trp Ala
100 105 110
Val Asp Asp Glu Glu Glu Glu Pro Ala Glu Gln Ile Leu Leu Lys Glu
115 120 125
Asp Ala Arg Lys Ser Pro Cys Gly Gln Ala Leu Asp Cys Ser Leu Thr
130 135 140
Ala Pro Pro Leu Ser Arg Pro Ile Val Ser Ser Ser Lys Ala Val Gly
145 150 155 160
Pro Ile Val Leu Pro Ser Pro Lys Pro Lys Val Val Glu Glu Ile Ser
165 170 175
Phe Pro Ala Ile Thr Thr Thr Ala Thr Leu Gly Glu Glu Asp Glu Glu
180 185 190
Ile Ile Lys Ser Val Val Ala Gly Thr Thr Pro Ser Tyr Ser Leu Glu
195 200 205
Ser Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ala Ile Arg Arg Glu Ala
210 215 220
Leu Gln Arg Ile Thr Gly Lys Ser Leu Ser Gly Leu Pro Leu Glu Gly
225 230 235 240
Phe Asp Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly
245 250 255
Tyr Val Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly
260 265 270
Lys Glu Val Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala
275 280 285
Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile His Ile Ser Gly Gly Ala Thr
290 295 300
Ser Val Val Leu Arg Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe
305 310 315 320
Gly Thr Ala Lys Arg Ala Ala Gln Leu Lys Phe Tyr Leu Glu Asp Ser
325 330 335
Ala Asn Phe Glu Thr Leu Ser Thr Val Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe
340 345 350
Gly Arg Leu Gln Ser Ile Arg Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr
355 360 365
Ile Arg Phe Cys Cys Gly Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val
370 375 380
Ser Lys Gly Val Gln Asn Val Leu Asp Phe Leu Gln Asn Asp Phe Pro
385 390 395 400
Asp Met Asp Val Ile Gly Val Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys
405 410 415
Pro Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Ala Cys
420 425 430
Glu Ala Ile Ile Lys Gly Asp Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Asn
435 440 445
Val Glu Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser
450 455 460
Ala Leu Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile
465 470 475 480
Val Thr Ala Ile Tyr Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val
485 490 495
Glu Ser Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Gln
500 505 510
Asp Leu His Val Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Asn
515 520 525
<210> 74
<211> 459
<212> PRT
<213> Lactuca sativa Lettuce
<400> 74
Met Gly Lys Ala Gln Phe Asp Gln His Ser Glu Asp Gln Met Leu Lys
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Lys Met Val Asp Ser Pro Lys Ala Phe Asp Ala Ile
20 25 30
Ser Ile Pro Met Gly Ile Phe Phe Thr Val Phe Phe Ser Val Val Tyr
35 40 45
Tyr Leu Leu Ile Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg Asn Ser Thr Pro Leu
50 55 60
His Val Val Asn Met Ser Glu Met Ala Ala Ile Ile Thr Phe Phe Ala
65 70 75 80
Ser Cys Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Met Asn Phe Val Gln Ala
85 90 95
Thr Pro Phe Thr Glu Thr Glu Glu Glu Asp Glu Val Glu Gly Glu Thr
100 105 110
Thr Pro Cys Gly Ala Ser Ile Ile Arg Glu Ser Asp Ile Val Ser Val
115 120 125
Lys Glu Val Met Lys Lys Glu Val Glu Thr Val Ile Val Ala Thr Asp
130 135 140
Thr Val Val Ser Glu Glu Asp Glu Glu Val Ile Gln Ala Val Val Ser
145 150 155 160
Gly Arg Thr Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Lys Leu Gly Asp Cys Lys
165 170 175
Arg Ala Ala Phe Ile Arg Arg Val Ala Leu Glu Arg Ile Thr Gly Lys
180 185 190
Ser Leu Glu Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Glu Ser Ile Leu
195 200 205
Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr Val Gln Ile Pro Val Gly
210 215 220
Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Met Glu Phe Ser Val Pro Met
225 230 235 240
Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys
245 250 255
Ala Ile Tyr Val Ser Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu Lys Asp Gly
260 265 270
Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Ala Thr Ala Lys Arg Ala Ala
275 280 285
Asp Leu Lys Phe Phe Leu Glu Glu Pro Leu Asn Phe Gly Thr Leu Ala
290 295 300
Ser Val Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe Gly Arg Leu Gln Thr Ile Arg
305 310 315 320
Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Ile Arg Phe Thr Cys Ser Thr
325 330 335
Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly Val Gln Asn Val
340 345 350
Leu Glu Tyr Leu Gln Ala Asp Phe Pro Asp Met Asp Val Ile Gly Ile
355 360 365
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370 375 380
Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Val Ile Pro Glu Glu
385 390 395 400
Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Asp Val Ala Ser Leu Val Glu Leu
405 410 415
Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser Ala Met Ala Gly Ala Leu Gly
420 425 430
Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val Ser Ala Val Tyr Leu Ala
435 440 445
Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser
450 455
<210> 75
<211> 586
<212> PRT
<213> Lactuca sativa Lettuce
<400> 75
Met Asp Val Arg Arg Arg Ser Ser Leu Lys Gln Ala Ala Thr Lys Gly
1 5 10 15
Lys Thr Met Ala Glu Asp Gln Tyr Asn Asp Gln Ile Phe Asn Lys Ala
20 25 30
Thr Asp Lys Lys Val Val Asp Thr Val Val Pro Leu Pro Met Gly Ile
35 40 45
Ser Asn Gly Val Phe Phe Thr Val Phe Phe Ser Val Val Tyr Phe Leu
50 55 60
Leu Ile Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg Thr Ser Thr Pro Leu His Val
65 70 75 80
Val Thr Met Ser Glu Met Ala Ala Ile Val Leu Phe Val Ala Ser Phe
85 90 95
Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Met Ser Phe Val Gln Ala Thr Pro
100 105 110
Tyr Ser Asp Asp Glu Glu Glu Glu Leu Glu Val Asp Glu Thr Glu Met
115 120 125
Val Arg Lys Glu Asp Thr Arg Thr Thr Pro Cys Gly Ala Ala Leu Asp
130 135 140
Cys Glu Ser Asp Val Val Val Lys Gln Val Val Lys Lys Glu Leu Val
145 150 155 160
Phe Val Pro Thr Asp Thr Thr Thr Val Thr Glu Glu Asp Glu Glu Ile
165 170 175
Ile Lys Ser Val Val Ser Gly Lys Thr Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Thr
180 185 190
Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Phe Ile Arg Arg Val Ala Leu
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Glu Arg Ile Thr Gly Lys Ser Leu Asp Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu
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245 250 255
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260 265 270
Thr Asn Arg Gly Phe Lys Ala Ile Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Thr Ala
275 280 285
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Thr Ala Lys Arg Ala Ala Asp Leu Lys Phe Phe Leu Glu Glu Pro Leu
305 310 315 320
Asn Phe Asp Thr Leu Ala Ser Val Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe Gly
325 330 335
Arg Leu Gln Lys Ile Gln Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Ile
340 345 350
Arg Phe Thr Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser
355 360 365
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370 375 380
Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Tyr Cys Ser Asp Lys Lys Pro
385 390 395 400
Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu
405 410 415
Ala Ile Ile Lys Glu Asp Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Asn Val
420 425 430
Ala Ser Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser Ala
435 440 445
Met Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val
450 455 460
Ser Ala Val Tyr Leu Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Ile Glu
465 470 475 480
Ser Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp
485 490 495
Leu His Val Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly
500 505 510
Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ala Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly
515 520 525
Val Lys Gly Ala Asn Arg Glu Ser Pro Gly Thr Asn Ala Arg Gln Leu
530 535 540
Ala Lys Val Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Leu
545 550 555 560
Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys Tyr Asn
565 570 575
Arg Ser Gln Lys Asp Leu Thr Thr Lys Ala
580 585
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<211> 438
<212> PRT
<213> Lactuca sativa Lettuce
<400> 76
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1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg Thr Ser Thr Pro Leu His Val Ala Thr
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Phe Ser Glu Met Ala Ala Leu Val Ser Leu Leu Ala Ser Phe Ile Tyr
100 105 110
Leu Leu Gly Phe Phe Gly Phe Asp Phe Ile Lys Ser Ile Leu Arg Pro
115 120 125
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Lys Ser Leu Ala Gly Met Pro Leu Glu Gly Phe Asp Tyr Glu Ser Ile
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245 250 255
Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asn Gly Ala Glu Phe Ser Val Pro
260 265 270
Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly Cys
275 280 285
Lys Ala Ile Tyr Val Ser Gly Gly Ala Thr Cys Met Leu Leu Arg Asp
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Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Gly Ser Ala Lys Arg Ala
305 310 315 320
Ala Glu Leu Lys Leu Phe Leu Glu Asp Pro Glu Asn Phe Asp Thr Leu
325 330 335
Ala Val Val Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe Gly Lys Leu Gln Ser Ile
340 345 350
Lys Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Ile Arg Phe Cys Cys Ile
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Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly Val Gln Asn
370 375 380
Val Leu Asp Tyr Leu Gln Thr Asp Tyr Pro Asp Met Asp Val Met Gly
385 390 395 400
Ile Ser Gly Asn Tyr Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala Val Asn Trp
405 410 415
Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Val Ile Asn Glu
420 425 430
Glu Val Val Lys Lys Val
435
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<212> PRT
<213> Lactuca sativa Lettuce
<400> 77
Ala Leu Gln Arg Ile Thr Gly Lys Ser Leu Ser Gly Leu Pro Leu Glu
1 5 10 15
Gly Phe Asp Tyr Asp Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val
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Gly Tyr Ile Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asn
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Gly Ala Glu Phe Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val
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65 70 75 80
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Phe Gly Ser Ala Lys Arg Ala Ala Glu Leu Lys Met Phe Leu Glu Asp
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115 120 125
Phe Gly Arg Leu Gln Ser Ile Arg Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu
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Ser Ala Met Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn
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<212> PRT
<213> Lactuca sativa Lettuce
<400> 78
Arg Pro Tyr Gly Arg Leu Thr Gly Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn
1 5 10 15
Arg Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Val Ser Gly Gly Ala Thr Cys Met Leu
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Leu Arg Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Gly Ser Ala
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Lys Arg Ala Ala Glu Leu Lys Leu Phe Leu Glu Asp Pro Glu Asn Phe
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Val Met Gly Ile Ser Gly Asn Tyr Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala
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Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Val
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Ile Asn Glu Glu Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Thr Val Ala Ser
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Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val Ser Ala
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Ile Tyr Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser
210 215 220
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Val Gln Ala Lys Lys Asn Arg Val Glu
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<211> 169
<212> PRT
<213> Lactuca sativa Lettuce
<400> 79
Glu Glu Ile Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Thr Val His Gly Leu Val
1 5 10 15
Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser Ala Ile Ala Gly Ser
20 25 30
Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn Ile Val Ser Ala Val Phe
35 40 45
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65 70 75 80
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Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly Ala
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Ser Ile Gly Ser Pro Gly Ser Asn Ala Arg Leu Leu Ala Ser Val Val
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Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser Ala Ile Ala
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Ala Gly Gln Leu Val Lys Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Asn Arg
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165
<210> 80
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<212> PRT
<213> Manihot esculenta
<400> 80
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1 5 10 15
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Leu Pro Leu His Leu Tyr Leu Thr Asn Ala Ile Cys Phe Thr Val Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Val Ala Leu Leu Ala Ser Phe Val Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Pro Ile Val Leu Pro Ser Pro Lys Pro Lys Val Phe Asp Glu Ile Pro
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Phe Pro Ala Thr Thr Tyr Leu Gly Glu Glu Asp Glu Glu Thr Ile Lys
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Ser Val Val Ala Gly Thr Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Arg Leu
195 200 205
Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ala Ile Arg Arg Glu Ala Ser Gln Arg
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Ile Thr Gly Lys Ser Leu Ser Gly Leu Pro Leu Glu Gly Phe Asp Tyr
225 230 235 240
Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr Val Gln
245 250 255
Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Lys Glu Phe
260 265 270
Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn
275 280 285
Arg Gly Cys Lys Ala Ile His Leu Ser Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu
290 295 300
Leu Arg Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Ala Thr Ala
305 310 315 320
Lys Arg Ala Ala Gln Leu Lys Leu Tyr Val Glu Asp His Ala Asn Phe
325 330 335
Glu Thr Leu Ser Thr Val Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe Gly Arg Leu
340 345 350
Gln Ser Ile Lys Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Met Arg Phe
355 360 365
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370 375 380
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Val Ile Gly Leu Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala
405 410 415
Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Ile
420 425 430
Ile Lys Gly Asp Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Asn Val Asp Ala
435 440 445
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450 455 460
Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Gly Asn Ile Val Thr Ala
465 470 475 480
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485 490 495
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515 520 525
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Gly Ala Ser Lys Glu Thr Pro Gly Ala Asn Ser Arg Leu Leu Ala Ser
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Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser Ala
565 570 575
Ile Ser Ala Gly Gln Leu Val Lys Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ala
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Ser Lys Asp Ala Ala Val Ser Asn Pro Ser Lys
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<211> 589
<212> PRT
<213> Manihot esculenta
<400> 81
Met Asp Ala Thr Ser Arg Pro Pro Lys Pro Pro Cys Ser Thr Ala Thr
1 5 10 15
Gln Gly His Ile His His Arg Lys His Ala Ala Ser Val Glu Arg Arg
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Pro Ser Ser Pro Thr Pro Lys Ala Ser Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu
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Tyr Leu Thr Asn Ala Val Phe Phe Thr Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr
50 55 60
Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys Ile Arg Asn Ser Thr Pro Leu
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His Ile Val Thr Leu Ser Glu Ile Ala Ala Ile Val Ser Leu Ile Ala
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Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile Asp Phe Val Gln Ser
100 105 110
Phe Ile Ala Arg Ala Ser His Glu Ala Trp Asp Leu Asp Asp Thr Asp
115 120 125
Pro Asn Tyr Leu Ile Asp Glu Asp His Arg Leu Ile Thr Cys Pro Pro
130 135 140
Ala Ser Ile Ser Thr Lys Thr Asn Leu Ala Ser Ala Ala Pro Lys Leu
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Pro Thr Ser Val Pro Leu Ile Thr Ser Leu Ala Ser Glu Glu Asp Glu
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Met Ile Val Asn Ser Val Val Asn Gly Ile Ile Pro Ser Tyr Ser Leu
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Glu Ser Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Val Ile Arg Arg Glu
195 200 205
Ala Leu Gln Arg Met Thr Gly Arg Ser Leu Gly Gly Leu Pro Leu Glu
210 215 220
Gly Phe Asp Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val
225 230 235 240
Gly Tyr Val Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asn
245 250 255
Gly Arg Glu Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val
260 265 270
Ala Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Leu Ser Gly Gly Ser
275 280 285
Thr Ser Val Leu Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg
290 295 300
Phe Ala Thr Ala Thr Arg Ala Ala Glu Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asp
305 310 315 320
Pro Asp Asn Phe Asp Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg
325 330 335
Phe Ala Arg Leu Gln Gly Ile Gln Cys Ser Ile Ala Gly Lys Asn Leu
340 345 350
Tyr Met Arg Phe Ser Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met
355 360 365
Val Ser Lys Gly Val Gln Asn Val Leu Glu Phe Leu Gln Asn Asp Phe
370 375 380
Ser Asp Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys
385 390 395 400
Lys Pro Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val
405 410 415
Cys Glu Ala Ile Ile Lys Glu Glu Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr
420 425 430
Lys Val Ala Ser Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Ala Gly
435 440 445
Ser Ala Ile Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Gly Asn
450 455 460
Ile Val Ser Ala Ile Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn
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Lys Asp Leu His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr
500 505 510
Val Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu
515 520 525
Leu Gly Val Lys Gly Ala Ser Glu Glu Ser Pro Gly Ser Asn Ser Arg
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Leu Leu Ala Thr Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser
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Leu Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Arg Ser His Met Lys
565 570 575
Tyr Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Ser Lys Ala Ala Ser
580 585
<210> 82
<211> 590
<212> PRT
<213> Eucommia ulmoides
<400> 82
Met Asp Leu Arg Arg Arg Pro Pro Lys Pro Ala Ala Thr Asn Gly Arg
1 5 10 15
Asn His His Leu His His Gln Gly Asn Ser Ser Ser Pro Ala Ile Asp
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Cys Ser Pro Ser Pro Ile Pro Lys Ala Ser Asp Ala Leu Pro Leu Pro
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Tyr Tyr Leu Leu His Arg Trp Arg Asp Lys Ile Arg Asn Ser Thr Pro
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Leu His Val Leu Thr Leu Ser Glu Leu Ala Ala Ile Val Ser Leu Ile
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Ala Ser Phe Ile Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile Asp Phe Val Gln
100 105 110
Ser Phe Ile Ala Arg Ala Ser His Asp Pro Trp Asp Val Asp Asp Asp
115 120 125
Glu Arg Phe Ile Leu Glu Glu Asp Arg Arg Arg Gly Pro Cys Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Asp Cys Leu Val Gly Pro Val Ala Pro Ser Ile Ser Asp Val
145 150 155 160
Arg Lys Leu Met Asp Pro Pro Ala Pro Leu Pro Ser Val Glu Asp Glu
165 170 175
Gln Met Val Lys Ser Val Ile Ser Gly Thr Val Pro Ser Tyr Ser Leu
180 185 190
Glu Ser Lys Leu Gly Asp Cys Tyr Arg Ala Ala Ser Ile Arg Arg Glu
195 200 205
Ala Ile Gln Arg Ile Thr Gly Lys Ser Leu Ser Gly Leu Pro Leu Glu
210 215 220
Gly Phe Asp Tyr Glu Ala Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Ile
225 230 235 240
Gly Phe Leu Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asn
245 250 255
Gly Cys Glu Tyr Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val
260 265 270
Ala Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Ala Ser Gly Gly Ala
275 280 285
Thr Ser Ile Leu Leu Arg Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg
290 295 300
Phe Pro Ser Ala Lys Arg Ala Ser Glu Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asp
305 310 315 320
Pro Leu Asn Phe Glu Thr Leu Ser Met Val Phe Asn Lys Ser Ser Arg
325 330 335
Phe Ala Arg Leu Gln Gly Ile Gln Cys Ser Ile Ala Gly Lys Asn Leu
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Pro Asp Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys
385 390 395 400
Lys Pro Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val
405 410 415
Cys Glu Ala Ile Ile Ser Glu Asp Ile Val Arg Lys Val Leu Lys Thr
420 425 430
Thr Val Pro Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Ala Gly
435 440 445
Ser Ala Val Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn
450 455 460
Ile Val Ser Ala Val Phe Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn
465 470 475 480
Ile Glu Ser Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly
485 490 495
Lys Asp Leu His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr
500 505 510
Val Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu
515 520 525
Leu Gly Val Lys Gly Ala Asn Lys Glu Ser Pro Gly Ser Asn Ser Arg
530 535 540
Leu Leu Ala Ala Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser
545 550 555 560
Leu Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys
565 570 575
Tyr Asn Arg Ser Asn Arg Asp Phe Thr Lys Val Thr Ser Ser
580 585 590
<210> 83
<211> 583
<212> PRT
<213> Euphorbia helioscopia L.
<400> 83
Met Asp Ser Thr Lys Ser Arg Arg Pro Ile Arg His Leu His His Gln
1 5 10 15
Lys Arg Ile Ser Glu Glu Val Asp Asp His Arg Cys Leu Ser Pro Pro
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Leu Lys Ala Ser Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Ala
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Val Phe Phe Thr Leu Phe Phe Ser Val Ala Tyr Tyr Leu Leu His Arg
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Trp Arg Asp Lys Ile Arg Asn Ser Thr Pro Leu His Val Val Thr Leu
65 70 75 80
Ser Glu Ile Ala Ala Ile Val Ser Leu Ile Ala Ser Phe Ile Tyr Leu
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Leu Gly Phe Phe Gly Ile Gly Phe Val Gln Ser Leu Ile Ala Arg Pro
100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Pro Leu Ala Ser Glu Glu Asp Glu Glu Ile Val Lys Ser Val Val
165 170 175
Asn Gly Thr Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Lys Leu Gly Asp Cys
180 185 190
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195 200 205
Arg Ser Leu Glu Gly Leu Pro Val Glu Gly Phe Asp Tyr Glu Ser Ile
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Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Val Gly Tyr Val Gln Ile Pro Val
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Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Arg Glu Tyr Ser Val Pro
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Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly Cys
260 265 270
Lys Ala Ile His Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ser Val Leu Leu Lys Asp
275 280 285
Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Thr Ser Val Arg Arg Ala
290 295 300
Ala Glu Leu Lys Phe Phe Leu Glu Ser Pro Glu Asn Phe Asp Ser Leu
305 310 315 320
Ser Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Gly Phe Ala Lys Leu Leu Asn Ile
325 330 335
Gln Cys Thr Leu Ala Gly Arg Asn Leu Tyr Met Arg Phe Thr Cys Phe
340 345 350
Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly Val Gln Asn
355 360 365
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370 375 380
Ile Ser Gly Asn Tyr Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala Val Asn Trp
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Ile Glu Gly Arg Gly Lys Trp Val Val Cys Glu Ala Ile Ile Lys Glu
405 410 415
Glu Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Ser Val Ala Ala Leu Val Glu
420 425 430
Leu Asn Met Val Lys Asn Leu Ala Gly Ser Ala Val Ala Gly Ser Leu
435 440 445
Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn Ile Val Ser Ala Val Phe Ile
450 455 460
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465 470 475 480
Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu His Ile Ser Val
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545 550 555 560
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565 570 575
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<213> Oryza sativa
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Ala Leu Pro Ser His Arg Leu Glu Ser Arg Leu Gly Asp Cys Arg Arg
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Ala Ala Arg Leu Arg Arg Glu Ala Leu Arg Arg Val Thr Gly Arg Gly
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195 200 205
Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Val Asn Arg Gly Cys Arg Ala
210 215 220
Ile Ser Ala Ser Gly Gly Ala Phe Ser Val Leu Leu Arg Asp Ala Met
225 230 235 240
Ser Arg Ala Pro Ala Val Lys Leu Pro Ser Ala Met Arg Ala Ala Glu
245 250 255
Leu Lys Ala Phe Ala Glu Ala Pro Ala Asn Phe Glu Leu Leu Ala Ala
260 265 270
Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe Gly Arg Leu Gln Asp Ile Arg Cys
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Gly Tyr Leu Gln Asn Val Phe Pro Asp Met Asp Val Ile Ser Val Ser
325 330 335
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Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Leu Ala Ala Leu Ala Ser Gly His
500 505 510
Leu Val Lys Ser His Met Met Tyr Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Ala
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530
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<212> PRT
<213> Solanum tuberosum L.
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340 345 350
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Ala Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Thr Lys
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Ala Ser Ser
595
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<212> PRT
<213> Solanum tuberosum L.
<400> 87
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Ile Ser Ser Gly Glu Pro Leu Lys Pro His Asn Gln Asp Ser Ser Val
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Lys Ala Ser Asp Ala Leu Pro Leu Pro Leu Tyr Leu Thr Asn Gly Leu
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Leu Leu Leu Asn Gly Lys Glu Phe Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu
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Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Val
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275 280 285
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305 310 315 320
Lys Ser Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln Asn Ile Gln Cys Ala Ile Ala
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370 375 380
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420 425 430
Asn Leu Thr Gly Ser Ala Met Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala
435 440 445
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450 455 460
Pro Ala Gln Asn Ile Glu Ser Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala
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Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile
485 490 495
Glu Val Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala
500 505 510
Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly Ala Asn Arg Glu Ala Pro Gly
515 520 525
Ser Asn Ala Arg Leu Leu Ala Thr Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala
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Ala Pro Leu Ile Thr Ser Ala Ser Ser Gly Glu Asp Glu Glu Ile Ile
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Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Ala Ser Ile Arg Lys Glu Val Met Gln
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Arg Ile Thr Gly Lys Ser Leu Glu Gly Leu Pro Leu Glu Gly Phe Asn
225 230 235 240
Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Ile Gly Tyr Val
245 250 255
Gln Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asn Gly Lys Glu
260 265 270
Phe Ser Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr
275 280 285
Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Thr Cys Ile
290 295 300
Leu Leu Arg Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Cys Val Arg Phe Gly Thr
305 310 315 320
Ala Lys Arg Ala Ala Glu Leu Lys Phe Phe Val Glu Asp Pro Ile Lys
325 330 335
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Ile Ile Thr Glu Glu Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Glu Val Ala
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Ala Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser Ala Met
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Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val Ser
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Ala Ile Ser Ser Gly Gln Leu Val Asn Ser His Met Lys Tyr Asn Arg
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<212> PRT
<213> Medicago polymorpha
<400> 89
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Leu Leu Asn Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg Thr Ser Thr Pro Leu His
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Val Leu Thr Ile Ser Glu Ile Leu Ala Leu Val Ser Leu Ile Ala Cys
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Leu Ile Tyr Leu Thr Ala Phe Phe Gly Val Ala Phe Ile Leu His Tyr
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Ile Arg Asn Gln Ala Val Glu Arg Val Thr Gly Arg Ser Leu Glu Gly
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Leu Pro Met Glu Gly Phe Asp Tyr Asp Ser Ile Leu Gly Gln Cys Cys
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Glu Met Pro Ile Gly Phe Val Gln Ile Pro Val Gly Val Ala Gly Pro
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Leu Leu Leu Asp Gly Lys Glu Tyr Thr Val Pro Met Ala Thr Thr Glu
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Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile Tyr Val
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Ser Gly Gly Ala Ser Ala Val Val Leu Arg Asp Gly Met Thr Arg Ala
245 250 255
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Lys Ser Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln Asn Ile Lys Ala Thr Ile Ala
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325 330 335
Gln Thr Asp Phe Pro Asp Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe
340 345 350
Cys Ser Asp Lys Lys Ala Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly
355 360 365
Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Val Ile Lys Glu Glu Val Val Lys Lys
370 375 380
Val Leu Lys Thr Ser Val Glu Ser Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys
385 390 395 400
Asn Leu Thr Gly Ser Ala Met Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala
405 410 415
His Ala Ser Asn Ile Val Ser Ala Val Tyr Leu Ala Thr Gly Gln Asp
420 425 430
Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser His Cys Met Thr Met Met Glu Ala
435 440 445
Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu His Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile
450 455 460
Glu Val Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ala Ser Gln Ser Ala
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485 490 495
Ala Asn Ser Arg Gln Leu Ala Thr Ile Val Ala Gly Ser Val Leu Ala
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Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser Ala Ile Ala Ala Gly Gln Leu Val Lys
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Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Asn Lys Asp Val Thr Lys Val Ala
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Ser
545
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<213> Medicago polymorpha
<400> 90
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1 5 10 15
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20 25 30
Thr Thr Gly Glu Asn Leu Asn Ser Gln Thr Val Phe Leu Cys Val Thr
35 40 45
Asn Ala Val Phe Phe Gly Val Phe Phe Ser Val Ala Tyr Phe Leu Leu
50 55 60
His Arg Trp Arg Glu Lys Ile Arg Thr Glu Thr Pro Leu His Val Val
65 70 75 80
Thr Val Ser Glu Thr Ala Ala Ile Val Ser Leu Ile Ala Ser Ala Val
85 90 95
Tyr Leu Leu Gly Phe Phe Gly Ile Gly Ser Arg Thr Ser Phe Pro Asp
100 105 110
Asp Leu Ser Asp Glu Glu Ile Leu Ala Lys Glu Asp Ser Arg Lys Pro
115 120 125
Gly Pro Cys Pro Ala Ala Leu Val Asp Thr Asp Val Lys Pro Pro Pro
130 135 140
Ala Thr Leu Thr Pro Ile Val Ala Pro Val Lys Ile Tyr Glu Val Val
145 150 155 160
Ala Pro Val Asn Leu Thr Pro Glu Asp Glu Glu Ile Ala Lys Ser Val
165 170 175
Val Thr Gly Ser Ile Pro Ser Tyr Ser Leu Glu Ser Arg Leu Ala Asp
180 185 190
Cys Arg Lys Ala Ala Ala Ile Arg Arg Ser Ala Val Gln Thr Ile Thr
195 200 205
Gly Lys Ser Leu Glu Gly Leu Pro Leu Glu Gly Phe Asp Tyr Asp Ser
210 215 220
Ile Leu Gly Gln Cys Cys Glu Met Pro Ile Gly Phe Val Gln Ile Pro
225 230 235 240
Val Gly Val Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asp Gly Val Glu Tyr Thr Val
245 250 255
Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Thr Asn Arg Gly
260 265 270
Cys Lys Ala Ile His Val Ser Gly Gly Ala Ser Ser Val Leu Leu Arg
275 280 285
Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Ser Ser Ala Lys Arg
290 295 300
Ala Ala Glu Leu Lys Phe Phe Leu Glu Asp Pro Leu Asn Phe Asp Thr
305 310 315 320
Leu Ala Val Thr Phe Asn Lys Ser Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln Ser
325 330 335
Leu Gln Pro Thr Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Ile Arg Phe Arg Cys
340 345 350
Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly Val Gln
355 360 365
Asn Val Leu Asp Phe Leu Gln Ser Asp Phe Pro Asp Met Asp Val Ile
370 375 380
Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys Ala Ala Ala Val Asn
385 390 395 400
Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Val Ile Lys
405 410 415
Glu Glu Val Val Lys Lys Val Leu Lys Thr Ser Val Glu Ala Leu Val
420 425 430
Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser Ala Leu Ala Gly Ala
435 440 445
Leu Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ser Asn Ile Val Ser Ala Val Tyr
450 455 460
Ile Ala Thr Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser His Cys
465 470 475 480
Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Leu His Ile Ser
485 490 495
Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly Gly Thr Gln
500 505 510
Leu Ala Ser Gln Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu Gly Val Lys Gly Ala
515 520 525
Asn Thr Glu Ser Pro Gly Ala Asn Ala Arg Leu Leu Ala Thr Ile Val
530 535 540
Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Met Ser Ala Ile Ala
545 550 555 560
Ala Gly Gln Leu Val Lys Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Ser Arg
565 570 575
Asp Met Ser Lys Ile Val
580
<210> 91
<211> 18
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 91
Ser Gly Gly Ala Thr Ser Thr Val Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val
1 5 10 15
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 92
Ser His Met Lys Tyr Asn Arg Ser Ser
1 5
<210> 93
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-57
<400> 93
cttgtcaggt ggggccaccg ccgtcttgtt gaaggatggc atgac 45
<210> 94
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-58
<400> 94
gtcatgccat ccttcaacaa gacggcggtg gccccacctg acaag 45
<210> 95
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-59
<400> 95
gctatgttta tctctggtgg cgccaccgat accgttctta agga 44
<210> 96
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-60
<400> 96
tccttaagaa cggtatcggt ggcgccacca gagataaaca tagc 44
<210> 97
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-61
<400> 97
cttgtcaggt ggggccaccg aagtcttgtt gaaggatggc atgac 45
<210> 98
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-62
<400> 98
gtcatgccat ccttcaacaa gacttcggtg gccccacctg acaag 45
<210> 99
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-63
<400> 99
gtcaagagtc acatgaagtt caacagatcc agcaaagata tgtct 45
<210> 100
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-64
<400> 100
agacatatct ttgctggatc tgttgaactt catgtgactc ttgac 45
<210> 101
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-65
<400> 101
gtcaagagtc acatgaagga caacagatcc agcaaagata tgtct 45
<210> 102
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-66
<400> 102
agacatatct ttgctggatc tgttgtcctt catgtgactc ttgac 45
<210> 103
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-67
<400> 103
gtcaagagtc acatgaagga aaacagatcc agcaaagata tgtct 45
<210> 104
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-68
<400> 104
agacatatct ttgctggatc tgttttcctt catgtgactc ttgac 45
<210> 105
<211> 1728
<212> DNA
<213> Hevea brasiliensis
<400> 105
atggacacca ccggccggct ccaccaccga aagcatgcta cacccgttga ggaccgttct 60
ccgaccactc cgaaagcgtc ggacgcgctt ccgcttcccc tctacctgac caacgcggtt 120
ttcttcacgc tgttcttctc ggtggcgtat tacctccttc accggtggcg cgacaagatc 180
cgcaactcca ctccccttca tatcgttact ctctctgaaa ttgttgctat tgtctccctc 240
attgcctctt tcatttacct cctaggattc ttcggtatcg attttgtgca gtcattcatt 300
gcacgcgcct cccatgacgt gtgggacctc gaagatacgg atcccaacta cctcatcgat 360
gaagatcacc gtctcgttac ttgccctccc gctaatatat ctactaagac taccattatt 420
gccgcaccta ccaaattgcc tacctcggaa cccttaattg cacccttagt ctcggaggaa 480
gacgaaatga tcgtcaactc cgtcgtggat gggaagatac cctcctattc tctggagtcg 540
aagctcgggg actgcaaacg agcggctgcg attcgacgcg aggctttgca gaggatgaca 600
aggaggtcgc tggaaggctt gccagtagaa gggttcgatt acgagtcgat tttaggacaa 660
tgctgtgaaa tgccagtggg atacgtgcag attccggtgg ggattgcggg gccgttgttg 720
ctgaacgggc gggagtactc tgttccaatg gcgaccacgg agggttgttt ggtggcgagc 780
actaatagag ggtgtaaggc gatttacttg tcaggtgggg ccaccagcgt cttgttgaag 840
gatggcatga caagagcgcc tgttgtaaga ttcgcgtcgg cgactagagc cgcggagttg 900
aagttcttct tggaggatcc tgacaatttt gataccttgg ccgtagtttt taacaagtcc 960
agtagatttg cgaggctcca aggcattaaa tgctcaattg ctggtaagaa tctttatata 1020
agattcagct gcagcactgg cgatgcaatg gggatgaaca tggtttctaa aggggttcaa 1080
aacgttcttg aatttcttca aagtgatttt tctgatatgg atgtcattgg aatctcagga 1140
aatttttgtt cggataagaa gcctgctgct gtaaattgga ttgaaggacg tggcaaatca 1200
gttgtttgtg aggcaattat caaggaagag gtggtgaaga aggtgttgaa aaccaatgtg 1260
gcctccctag tggagcttaa catgctcaag aatcttgctg gttctgctgt tgctggtgct 1320
ttgggtggat ttaatgccca tgcaggcaac atcgtatctg caatctttat tgccactggc 1380
caggatccag cacagaatgt tgagagttct cattgcatta ccatgatgga agctgtcaat 1440
gatggaaagg atctccatat ctctgtgacc atgccctcca ttgaggtggg tacagtcgga 1500
ggtggaactc aacttgcatc tcagtctgct tgtctcaatt tgcttggggt gaagggtgca 1560
aacaaagagt cgccaggatc aaactcaagg ctccttgctg ccatcgtagc tggttcagtt 1620
ttggctggtg agctctcctt gatgtctgcc attgcagctg ggcagcttgt caagagtcac 1680
atgaagtaca acagatccag caaagatatg tctaaagctg catcttag 1728
<210> 106
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-69
<400> 106
caccatggac accaccggcc ggctccacca c 31
<210> 107
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-70
<400> 107
cgcctcgagt caagatgcag ctttagacat 30
<210> 108
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-71
<400> 108
gtagaagggt tcgatttcga gtcgatttta ggac 34
<210> 109
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-72
<400> 109
gtcctaaaat cgactcgaaa tcgaaccctt ctac 34
<210> 110
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-73
<400> 110
gtagaagggt tcgatgaaga gtcgatttta ggaca 35
<210> 111
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-74
<400> 111
tgtcctaaaa tcgactcttc atcgaaccct tctac 35
<210> 112
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-75
<400> 112
gctgaacggg cgggagttct ctgttccaat ggc 33
<210> 113
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-76
<400> 113
gccattggaa cagagaactc ccgcccgttc agc 33
<210> 114
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-77
<400> 114
gctgaacggg cgggaggaat ctgttccaat ggc 33
<210> 115
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-78
<400> 115
gccattggaa cagattcctc ccgcccgttc agc 33
<210> 116
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-79
<400> 116
gaaggacgtg gcaaagccgt tgtttgtgag 30
<210> 117
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-80
<400> 117
ctcacaaaca acggctttgc cacgtccttc 30
<210> 118
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-81
<400> 118
tgaaggacgt ggcaaagacg ttgtttgtga ggcaattatc aag 43
<210> 119
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-82
<400> 119
cttgataatt gcctcacaaa caacgtcttt gccacgtcct tca 43
<210> 120
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-83
<400> 120
tgaaggacgt ggcaaagaag ttgtttgtga ggcaattatc aag 43
<210> 121
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-84
<400> 121
cttgataatt gcctcacaaa caacttcttt gccacgtcct tca 43
<210> 122
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-85
<400> 122
ctgcaatctt tattgcctgt ggccaggatc cagc 34
<210> 123
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-86
<400> 123
gctggatcct ggccacaggc aataaagatt gcag 34
<210> 124
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-87
<400> 124
tcgtatctgc aatctttatt gccgatggcc aggatccagc acaga 45
<210> 125
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-88
<400> 125
tctgtgctgg atcctggcca tcggcaataa agattgcaga tacga 45
<210> 126
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-89
<400> 126
tcgtatctgc aatctttatt gccgaaggcc aggatccagc acaga 45
<210> 127
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-90
<400> 127
tctgtgctgg atcctggcct tcggcaataa agattgcaga tacga 45
<210> 128
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-91
<400> 128
ctccattgag gtgggttgtg tcggaggtgg aactc 35
<210> 129
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-92
<400> 129
gagttccacc tccgacacaa cccacctcaa tggag 35
<210> 130
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-93
<400> 130
accatgccct ccattgaggt gggtgacgtc ggaggtggaa ctcaac 46
<210> 131
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-94
<400> 131
gttgagttcc acctccgacg tcacccacct caatggaggg catggt 46
<210> 132
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-95
<400> 132
accatgccct ccattgaggt gggtgaagtc ggaggtggaa ctcaac 46
<210> 133
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-96
<400> 133
gttgagttcc acctccgact tcacccacct caatggaggg catggt 46
<210> 134
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-97
<400> 134
gtcacatgaa gtacaacaga gccagcaaag atatgtctaa agct 44
<210> 135
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-98
<400> 135
agctttagac atatctttgc tggctctgtt gtacttcatg tgact 45
<210> 136
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-99
<400> 136
gtcacatgaa gtacaacaga gacagcaaag atatgtctaa agct 44
<210> 137
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-100
<400> 137
agctttagac atatctttgc tgtctctgtt gtacttcatg tgact 45
<210> 138
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-101
<400> 138
cttgtcaggt ggggccaccg ccgtcttgtt gaaggatggc atgac 45
<210> 139
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-102
<400> 139
gtcatgccat ccttcaacaa gacggcggtg gccccacctg acaag 45
<210> 140
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-103
<400> 140
caggtggggc caccgacgtc ttgttgaagg 30
<210> 141
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-104
<400> 141
ccttcaacaa gacgtcggtg gccccacctg 30
<210> 142
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-105
<400> 142
cttgtcaggt ggggccaccg aagtcttgtt gaaggatggc atgac 45
<210> 143
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-106
<400> 143
gtcatgccat ccttcaacaa gacttcggtg gccccacctg acaag 45
<210> 144
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-107
<400> 144
gtcaagagtc acatgaagtt caacagatcc agc 33
<210> 145
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-108
<400> 145
gctggatctg ttgaacttca tgtgactctt gac 33
<210> 146
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-109
<400> 146
gtcaagagtc acatgaagga caacagatcc agc 33
<210> 147
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-110
<400> 147
gctggatctg ttgtccttca tgtgactctt gac 33
<210> 148
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-111
<400> 148
gtcaagagtc acatgaagga aaacagatcc agc 33
<210> 149
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-112
<400> 149
gctggatctg ttttccttca tgtgactctt gac 33
<210> 150
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-113
<400> 150
gtcaagagtc acatgaaggc caacagatcc agcaaagata tgtct 45
<210> 151
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER-114
<400> 151
agacatatct ttgctggatc tgttggcctt catgtgactc ttgac 45

Claims (32)

1.一种突变的蛋白质，其特征在于，在3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶中，选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥(Arabidopsis thaliana)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基所构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被其它氨基酸残基取代。
2.如权利要求1所述的突变的蛋白质，其特征在于，所述位置与拟南芥(Arabidopsisthaliana)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基相当的氨基酸残基分别是SEQ ID NO：10所示的橡胶树(Heveabrasiliensis)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第70位、214位、246位、276位、400位、459位、498位和563位氨基酸残基。
3.如权利要求1所述的突变的蛋白质，其特征在于，所述位置与拟南芥(Arabidopsisthaliana)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第411位、470位、509位和574位氨基酸残基相当的氨基酸残基分别是SEQ ID NO：70所示的橡胶树(Hevea brasiliensis)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第35位、94位、133位和198位氨基酸残基。
4.如权利要求1所述的突变的蛋白质，其特征在于，所述位置与拟南芥(Arabidopsisthaliana)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基相当的氨基酸残基分别是SEQ ID NO：71所示的橡胶树(Hevea brasiliensis)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第81位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基。
5.如权利要求1所述的突变的蛋白质，其特征在于，所述位置与拟南芥(Arabidopsisthaliana)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基相当的氨基酸残基分别是SEQ ID NO：72所示的橡胶树(Heveabrasiliensis)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第243位、275位、305位、357位、429位、488位、527位和592位氨基酸残基。
6.如权利要求1所述的突变的蛋白质，其特征在于，所述位置与拟南芥(Arabidopsisthaliana)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、287位、339位、411位、和470位氨基酸残基相当的氨基酸残基分别是SEQ ID NO：73所示的橡胶树(Heveabrasiliensis)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第73位、243位、305位、357位、429位和488位氨基酸残基。
7.如权利要求1至6中任一项所述的突变的蛋白质，其特征在于，选自于由SEQ ID NO:1的第91位和第339位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代。
8.如权利要求1至6中任一项所述的突变的蛋白质，其特征在于，选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。
9.如权利要求1至6中任一项所述的突变的蛋白质，其特征在于，选自于由SEQ ID NO：1的第91位和第339位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。
10.如权利要求1至6中任一项所述的突变的蛋白质，其特征在于，选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代。
11.一种控制类异戊二烯产量的方法，其特征在于，使用如权利要求1至10中任一项所述的突变的蛋白质。
12.一种控制甲羟戊酸产量的方法，其特征在于，使用如权利要求1至10中任一项所述的突变的蛋白质。
13.基因，其特征在于，所述基因编码如权利要求1至10中任一项所述的突变的蛋白质。
14.一种控制类异戊二烯产量的方法，其特征在于，使用如权利要13所述的基因。
15.一种控制甲羟戊酸产量的方法，其特征在于，使用如权利要13所述的基因。
16.重组载体，其特征在于，所述重组载体携带如权利要求13所述的基因。
17.植物，其特征在于，所述植物携带如权利要求13所述的基因。
18.一种控制类异戊二烯产量的方法，其特征在于，使用如权利要17所述的植物。
19.一种控制甲羟戊酸产量的方法，其特征在于，使用如权利要17所述的植物。
20.一种产类异戊二烯的植物，其特征在于，所述植物携带如权利要求13所述的基因。
21.一种控制类异戊二烯产量的方法，其特征在于，所述方法使用如权利要求20所述的产类异戊二烯的植物。
22.一种控制甲羟戊酸产量的方法，其特征在于，所述方法使用如权利要求20所述的产类异戊二烯的植物。
23.一种控制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的方法，其特征在于，在3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶中，选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥(Arabidopsisthaliana)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被其它氨基酸残基取代。
24.如权利要求23所述的控制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的方法，其特征在于，选自于由SEQ ID NO：1所示的第91位和第339位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代。
25.如权利要求23所述的控制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的方法，其特征在于，选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。
26.如权利要求23所述的控制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的方法，其特征在于，选自于由SEQ ID NO：1的第91位和第339位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。
27.如权利要求23所述的控制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶活性的方法，其特征在于，选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代。
28.一种生产突变的蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：在3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶中，使选自于由SEQ ID NO：1所示的拟南芥(Arabidopsis thaliana)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的第91位、225位、257位、287位、339位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被其它氨基酸残基取代。
29.如权利要求28所述的生产突变的蛋白质的方法，其特征在于，选自于由SEQ ID NO：1的第91位和第339位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代。
30.如权利要求28所述的生产突变的蛋白质的方法，其特征在于，选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被丙氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸取代。
31.如权利要求28所述的生产突变的蛋白质的方法，其特征在于，选自于由SEQ ID NO：1的第91位和第339位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被缺失，或被丙氨酸或苯丙氨酸取代。
32.如权利要求28所述的生产突变的蛋白质的方法，其特征在于，选自于由SEQ ID NO：1的第225位、257位、287位、411位、470位、509位和574位氨基酸残基、以及位置与前述相当的氨基酸残基构成的组的至少一种氨基酸残基被天冬氨酸或谷氨酸取代。
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