CN106435040A - 一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光rt‑pcr试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT‑PCR试剂盒及其用途。该试剂盒是根据猪流感病毒M基因而研制的实时荧光RT‑PCR试剂盒，包括针对猪流感病毒M基因序列设计的Taqman荧光探针及引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明的试剂盒能够特异性地检测仔猪脐带血中的猪流感病毒，并具有较高的灵敏度，特异性强和重复性优，可以实现大通量样品的检测。并且本发明的试剂盒检测结果快速高效，不会造成样品交叉污染，同时达到母仔猪同时监测的目的。

Description

一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒 及其用途

技术领域

本发明涉及动物病原分子诊断技术领域，特别涉及一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途。

背景技术

猪流感(Swine influenza，SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的猪的一种急性、热性和高度接触性呼吸道疾病，多呈流行性发生，临床上以突发高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭甚至死亡为特征。一般是突然发病，很快感染全群，各个年龄、性别、品种的猪都易感，但很少导致猪的死亡。目前，欧、美、亚、非等世界各大洲均有本病的发生。SI是一种世界性的猪呼吸道传染病，也是主要的猪免疫抑制病之一，在规模化养猪场中普遍存在，难以根除。由于SIV可损害呼吸道上皮细胞，容易继发或混合感染猪繁殖与呼吸综合征、副猪嗜血杆菌病、猪巴氏杆菌病、猪链球菌等呼吸系统疾病，导致病情变得复杂，死亡率增高，给养猪业带来更大的危害。

尽管目前尚未在猪群内检测到该流感病毒的流行，但猪是人流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒的共同宿主，在流感病毒跨种传播的过程中，可能在猪体内发生基因重排，产生新的病毒株，造成新的流行。此外，人也可以感染猪流感病毒，因此快速准确的诊断和监测猪流感，具有重要的经济学意义和公共卫生学意义。

猪流感病毒属于正黏病毒科，A型流感病毒属，为单股负链RNA病毒，能引起各种动物以及人类感染甚至死亡，不仅给养殖业造成了巨大的经济损失，而且对人类健康也造成了严重的威胁。其基因组由PB2、PB1、PA、HA、NP、HA、NA、M、NS 8个片段组成，共编码11种蛋白质。A型流感病毒(Influenza virus A)为单股负链RNA病毒，依据其表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原性差异，可分为17种HA亚型和10种NA亚型。

近些年，SIV对全球养猪业造成了严重的经济损失，引起养猪业的普遍关注。国内外学者建立了病毒分离、血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、酶联免疫试验(ELISA)、琼脂扩散试验(AGP)等多种方法用于SIV的检测。目前应用最为广泛的检测方法为PCR检测方法。实时荧光定量RT-PCR技术(real-time fluorescence quantitative PCR，QPCR)是在常规RT-PCR技术的基础上发展起来的一种较新的核酸检测技术，具备快速、特异性更强、准确性和灵敏度更高的特点，具有实时性，2-3小时便能得出结果，且不需要PCR后处理，有效降低了过程的污染。

脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构，由两条动脉和一条静脉构成，是连接母体和子体的天然通道。脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，在胎盘屏障的作用下大分子物质通常不能从母体进入脐带血中，因此健康仔猪脐带血中不含有任何抗体，但病毒、内毒素等小分子颗粒能够透过胎盘屏障进入脐带血中，从而垂直传播给仔猪。

猪脐带血检测技术具有采样方便、安全省时、不影响生产等优点。结合仔猪脐带血检测的优势，实时荧光RT-PCR检测结果可同时反映母猪、仔猪SIV带毒状况，可对猪群SIV感染和免疫情况进行早期预警评判，进一步有助于猪场做好猪流感的防控工作，降低养殖风险。因此，研制一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR方法，并基于此方法开发检测试剂盒非常有必要，且应用前景广阔。

发明内容

本发明的目的在于提出一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒。该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、重复性优、检测结果快速客观准确等优点，能同时反映母、仔猪SIV带毒状况，评估母猪疫苗的免疫效果，有益于对猪群SIV感染和免疫情况的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的防控工作。

基于上述目的，本发明提供了一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：

上游扩增引物：5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAA-3’，其为SEQ ID NO:1序列；

下游扩增引物：5’-ACTGCTCTATCCATGTTGTTC-3’，其为SEQ ID NO:2序列；

特异性荧光探针：TAMARA-5’-CAGTCCTCGCTCACTGGGCA-3’-FAM，其为SEQ ID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因。

在本发明中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为3:3:1。

在本发明中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为0.1～0.6μM。

在本发明中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光RT-PCR反应液(含酶)及说明书。

在RT-PCR反应体系中加入荧光RT-PCR反应液，该反应液中含有UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等。本发明的荧光RT-PCR反应液中还含有dNTPs、反转录酶、TaqDNA聚合酶和一些增强成分(MgCl₂、DMSO或甲酰胺)的混合物，具体的增强成分根据实际需要进行添加。

在本发明中，优选的，所述阴性对照为无DNA酶的ddH₂O；所述阳性对照为含有猪流感病毒M基因序列的克隆质粒T-SIV-M，克隆质粒T-SIV-M的终浓度为1×10⁵copies/μL～1×10⁷copies/μL。

合理的引物和荧光探针设计是成功应用实时荧光RT-PCR技术的关键。引物和探针的特异性对反应有很大影响，如果引物和探针特异性不高，可能在扩增构成中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。

猪流感病毒本身极易变异，而这种变异的分子生物学基础主要是由病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的基因重排而造成，所以在这两个基因序列中很难找出合适的保守基因用于猪流感多种亚型的实时荧光RT-PCR扩增。猪流感病毒的基质蛋白(M)基因相对保守并具有种群特异性，因此在M基因序列中找出一段保守型基因作为实时荧光RT-PCR扩增的靶基因，并使其用于各个亚型猪流感病毒的快速诊断，并且选取M基因作为扩增的模板能兼顾同亚型不同毒株之间的保守序列，保证了检测方法的通用性。

本发明从猪流感病毒全长M基因上筛选出一段基因片段，该基因片段在猪流感病毒非常保守，大小为142bp，发明人针对该保守片段设计了多对引物和探针，最终根据扩增效果(扩增效率、灵敏度等)筛选出本发明的引物和探针。试验结果表明，本发明引物和探针的特异性强，能有效从脐带血、血液与组织样品中检测到包括H1和H3亚型流行株在内的A型猪流感病毒。

本发明所提供的扩增引物对及TaqMan荧光探针可检测不同来源的A型流感病毒，尤其适合检测A型猪流感病毒。

在本发明中，优选的，所述猪流感病毒M基因的核苷酸序列如下所示：

5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTAAATGGAAATGGGGACCCGAACAACATGGATAGAGCAGT-3’，其为SEQ ID NO:4所示。

在本发明中，优选的，所述克隆质粒T-SIV-M采用以下方法制备得到：利用SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列扩增猪流感病毒M基因序列，胶回收目的片段后与pEASY-T1载体连接，转化后筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为T-SIV-M。

克隆质粒T-SIV-M的构建步骤具体如下：

(1)用Invitrogen TRIzol提取H1N1亚型SIV的RNA，反转录为cDNA；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为特异性引物扩增猪流感病毒M基因序列，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃再延伸10min；PCR产物于3％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；

(2)PCR产物的纯化、克隆及序列分析：PCR产物用Omega DNA Gel Excraction Kit胶回收试剂盒回收，然后与pEASY-T1克隆载体进行连接，连接后转化Trans1-T1 PhageResistant化学感受态细胞，涂布于含AMP、IPTG和X-gal的LB培养基平板上，37℃培养12h-18h；挑选菌落用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列进行菌落PCR鉴定，阳性菌落扩大培养后用Omega Plasmid Mini Kit Ⅰ质粒提取试剂盒提取质粒，送擎科生物测序，测序后进行序列比对，正确的阳性克隆质粒命名为T-SIV-M。

在本发明中，优选的，用于检测仔猪脐带血中猪流感病毒时，反应体系以20μL计为：

荧光RT-PCR反应液(含酶)：15μL；

10μMSEQ ID NO:1所示的上游扩增引物：0.6～1.2μL，10μMSEQ ID NO:2所示的下游扩增引物：0.6～1.2μL，10μMSEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针：0.2μL～0.4μL；

RNA模板：2μL；

ddH₂O：补足至20μL。

在本发明中，优选的，用于检测仔猪脐带血中猪流感病毒时，实时荧光RT-PCR的反应条件为：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性15Sec，60℃退火30Sec并收集荧光，共40个循环；结束反应。

在本发明中，实时荧光RT-PCR结果分析：在阴性对照检测无Ct值，阳性对照检测Ct值≤30时，则结果判定成立。

结果分析：检测样品有典型的扩增曲线，且Ct值≤35，则判断样品为猪流感病毒感染阳性；若检测样品35<Ct值≤40，表明病毒载量低，标注可疑，并进行重复检测，若重复检测结果仍为35<Ct值≤40，则判断样品为猪流感病毒感染阴性；Ct值≤35，则判断样品为猪流感病毒阳性。

在RT-PCR反应体系中加入荧光RT-PCR反应液，该反应液中含有UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等。本发明的荧光RT-PCR反应液中还含有dNTPs、MgCl₂、反转录酶和TaqDNA聚合酶的混合物。

在本发明中，为了使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值，对待检脐带血中提取的RNA模板浓度、引物浓度和特异性荧光探针的浓度进行了优化，引物浓度过低会影响扩增效率，引物浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且增加引物之间形成二聚体的机会，同样特异性荧光探针浓度过低会引起特异性的荧光信号变弱，而浓度过高则会引起探针与模板发生非特异性结合，产生非特异性荧光信号从而干扰特异性荧光信号，待检脐带血中提取的RNA模板浓度会影响RT-PCR扩增的效率，应根据目的基因的大小选择合适的RNA模板浓度。本发明经过一系列优化试验，最终确定本发明的荧光RT-PCR反应体系和反应条件，采用本发明的实时荧光RT-PCR方法检测猪流感病毒的扩增效率接近100％，并可获得最小的Ct值。

进一步的，本发明还提供了上述试剂盒在制备检测仔猪脐带血中猪流感病毒试剂中的用途。

本发明将猪流感病毒的M基因和TaqMan探针相结合，在猪流感病毒的M基因选取保守区设计特异性引物和特异性探针，通过对待检脐带血中提取的RNA模板浓度、引物浓度以及特异性荧光探针浓度等进行优化，建立了仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR方法。灵敏度试验结果表明，该方法的检测范围为10⁸-10¹copies/μL，可以从猪流感病毒感染脐带血中检测到最低10copies的猪流感病毒核酸，灵敏度是常规PCR方法的300倍。特异性试验结果表明，该方法对猪繁殖与呼吸综合征经典株和变异株、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪乙型脑炎病毒等常见传染病的病原体均无非特异性反应，说明该方法特异性和可靠性强。重复性试验结果表明，10⁷copies/μL浓度的阳性对照T-SIV-M克隆质粒Ct值标准差为0.035，10³copies/μL浓度的阳性对照T-SIV-M克隆质粒Ct值标准差为0.01，具有较好的重复性。

综上所述，本发明建立的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR方法和基于该方法建立的试剂盒具有准确度高，灵敏度高，特异性强和重复性优的特点，可以用于猪流感病毒感染的病原学研究、早期诊断，对猪流感病毒的快速诊断、综合防控、病原净化和早期治疗具有重要意义。

本发明应用实时荧光RT-PCR检测仔猪脐带血中猪流感病毒的工作原理：由于猪属于上皮绒毛胎盘，母猪和胎儿独立血液循环系统之间存在血胎盘屏障的缘故，正常的“脐带血”是不含病原体和抗体物质的，即不存在任何病原的相关基因片段，因此，可通过检测“脐带血”中是否存在猪流感病毒核酸来判断无症状母猪的带毒情况，亦可以预警仔猪感染猪流感病毒的风险。具体步骤为：(1)样品采集；(2)样品处理；(3)RNA提取；(4)实时荧光RT-PCR：利用本发明设计的特异性引物和探针进行；(5)判定结果。

本发明还提供了一种脐带血的采集方法，具体步骤如下：

(1)取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；

(2)当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可；若母猪分娩出现木乃伊、死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；

(3)脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；

(4)将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20℃冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。

本发明脐带血的采集方法克服现有常规采血技术的耗时长、采血困难、对猪只应激大等问题，能够快速、简便地进行脐带血的采集。

与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下有益效果：

(1)本发明的检测方法克服了常规检测技术耗时长、敏感度低、安全系数低、抗污染能力差和不能准确定量等问题，检测快速高效，不会造成样品交叉污染，同时达到母仔猪同时监测的目的。

(2)本发明的检测方法准确度高，灵敏度高，特异性强，重复性优，可以实现大通量样品的检测。

(3)本发明的检测方法适用于待检猪的脾脏、淋巴结、血清及血浆等样品，同时还适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。

(4)本发明运用一步法实时荧光RT-PCR技术，通过一个PCR反应，就可以从脐带血、血液与组织样品中检测出是否有猪流感病毒存在，快捷迅速、节约成本。

附图说明

图1为本发明阳性对照10倍稀释的梯度标准曲线；

图2为本发明敏感性检测结果图；

图3为本发明重复性检测结果图，其中A图为阳性对照T-SIV-M克隆质粒10⁷copies/μl浓度的重复性检测结果，B图为阳性对照T-SIV-M克隆质粒10³copies/μl浓度的重复性检测结果；

图4为本发明特异性检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

实施例1

1.脐带血的采集

a.取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；

b.当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可，将其“脐带血”挤到青霉素瓶，密封；

注意事项：①必须要采集同窝母猪产的所有的仔猪，避免同窝母猪所产仔猪的个体差异造成漏检；②可以双人操作，也可以单独操作，若仔猪脐带血不便挤出，可以将脐带剪成几段再操作即可；③若母猪分娩出现木乃伊，死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；④弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；

c.脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；

d.将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20℃冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。

提取脐带血中RNA并反转录为cDNA，RNA保存在-80℃，cDNA保存在-20℃，备用。

2.引物和荧光探针的设计和制备

在GenBank基因库中查找50株A型SIV毒株的M基因序列，经序列比对选取其保守区域，针对该保守片段设计了多对引物和探针，最终根据扩增效果(扩增效率、灵敏度等)筛选出一对特异性扩增引物和一条特异性荧光探针，序列如下：上游扩增引物：5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAA-3’(SEQ ID NO:1)；

下游扩增引物：5’-ACTGCTCTATCCATGTTGTTC-3’(SEQ ID NO:2)；

特异性荧光探针：TAMARA-5’-CAGTCCTCGCTCACTGGGCA-3’-FAM，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因(SEQ ID NO:3)。

上述引物由华大基因合成并进行标记。

3.阳性对照质粒的构建与制备

(1)用Invitrogen Trizol方法提取A型SIV的RNA，并反转录为cDNA；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为特异性引物扩增猪流感病毒的M基因序列，94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃再延伸10min；PCR产物于3％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；

(2)PCR产物的纯化、克隆及序列分析：PCR产物用Omega DNA Gel Excraction Kit胶回收试剂盒回收，然后与pEASY-T1克隆载体进行连接，连接后转化Trans1-T1 PhageResistant化学感受态细胞，涂布于含AMP、IPTG和X-gal的LB培养基平板上，37℃培养12h-18h；挑选菌落用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列进行菌落PCR鉴定，阳性菌落扩大培养后用Omega Plasmid Mini Kit Ⅰ质粒提取试剂盒提取质粒，送擎科生物测序，测序后进行序列比对，正确的阳性克隆质粒命名为T-SIV-M。

克隆质粒T-SIV-M用Omega Plasmid Mini Kit Ⅰ质粒小提试剂盒提取，获得定量标准质粒。用Thermo Nanodrop2000超微量分光光度计测定质粒浓度，并记录OD260和OD280的比值，然后按照公式换算为质粒拷贝数，克隆质粒T-SIV-M终浓度为1×10⁵copies/μl～1×10⁷copies/μl。

其中，猪流感病毒M基因片段的大小为142bp，核苷酸序列如下所示：

5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAAGGGAATTTTGGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTAAATGGAAATGGGGACCCGAACAACATGGATAGAGCAGT-3’(SEQ ID NO:4)。

4.标准曲线的制作

将T-SIV-M克隆质粒进行10倍梯度稀释，使其为：10⁸copies/μl-10⁰copies/μl，每个梯度重复三次进行实时荧光定量PCR。根据实验结果选取10⁸copies/μl–10²copies/μl7个点制作标准曲线。图1为本发明阳性对照10倍稀释梯度制作的标准曲线图，其中该标准曲线的参数如下：斜率：-3.28240，截距：39.00093，相关系数：-0.99917，扩增效率：1.01676。制作标准曲线的相关系数R2应大于0.98，斜率位于-3.1－-3.6之间，PCR扩增效率E位于0.9－1.1之间。

5.检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒的组成：

(1)荧光RT-PCR反应液(含酶)：该反应液中含有UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等；

(2)扩增引物组包括上游扩增引物和下游扩增引物：

上游扩增引物：5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAA-3’(SEQ ID NO:1)；

下游扩增引物：5’-ACTGCTCTATCCATGTTGTTC-3’(SEQ ID NO:2)；

(3)特异性荧光探针：

特异性荧光探针：TAMARA-5’-CAGTCCTCGCTCACTGGGCA-3’-FAM，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因(SEQ ID NO:3)；

本发明从猪流感病毒全长M基因上筛选出一段基因片段，该基因片段在猪流感病毒非常保守，大小为142bp，发明人针对该保守片段设计了多对引物和探针，最终根据扩增效果(扩增效率、灵敏度等)筛选出本发明的引物和探针。试验结果表明，本发明引物和探针的特异性强，能有效从脐带血、血液与组织样品中检测到包括H1和H3亚型流行株在内的A型猪流感病毒。

(4)阳性对照T-SIV-M克隆质粒；

(5)阴性对照为无DNAase的ddH₂O；

(6)使用说明书。

6.用上述试剂盒检测仔猪脐带血中的猪流感病毒

(1)实时荧光RT-PCR反应体系的优化：为了得到扩增结果稳定可靠、重复性好的实时荧光定量RT-PCR反应体系，对影响实时荧光定量RT-PCR的4个因素(上游引物、下游引物、探针、模板)分别进行单因子多水平的优化试验。荧光RT-PCR反应的主要因素水平见表1。

表1实时荧光定量RT-PCR反应的因素与水平

根据扩增结果，确定荧光RT-PCR单个反应体系(20μL)为：荧光RT-PCR反应液(含酶)15μL；10μM SEQ ID NO:1所示的上游引物：0.6μL，10μM SEQ ID NO:2所示的下游引物：0.6μL，10μM SEQ ID NO:3所示的荧光探针：0.4μL；待检脐带血中提取的RNA模板：2μL；使用ddH₂O补足至20μL。同时设有阳性对照和阴性对照，阳性对照T-SIV-M克隆质粒：2μL，其余组分相同；阴性对照无DNA酶的ddH₂O：2μL，其余组分相同。

(2)实时荧光定量RT-PCR反应步骤：按照上述配比将各组分加入到0.2mL PCR扩增管中，瞬时离心(3000rpm)10秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性15Sec，60℃退火30Sec并收集荧光，共40个循环；结束反应。

7.结果分析

根据扩增结果判定：每次试验的过程都要加入阳性对照及阴性对照。在阴性对照检测无Ct值，阳性对照检测Ct值≤30时，则结果判定成立。即阳性结果出现典型的扩增曲线，并且制作的标准曲线如图1所示，相关系数R²大于0.98，斜率位于-3.1－-3.6之间，PCR扩增效率E位于0.9－1.1之间。

检测样品有典型的扩增曲线，且Ct值≤35，则判断样品为猪流感病毒感染阳性；若检测样品35<Ct值≤40，表明病毒载量低，标注可疑，并进行重复检测，若重复检测结果仍为35<Ct值≤40，则判断样品为猪流感病毒感染阴性；Ct值≤35，则判断样品为猪流感病毒感染阳性。

实施例2灵敏性研究

以阳性对照T-SIV-M克隆质粒评价本发明试剂盒的灵敏性，将T-SIV-M克隆质粒进行10倍梯度稀释，检测范围为10⁸-10⁰copies/μl。结果表明，该方法的检测范围为10⁸-10¹copies/μl，在此范围的病毒含量可以得到可靠的结果，即该方法的灵敏性可以检测到10个拷贝的病毒含量的样品。灵敏性试验结果见图2。

实施例3重复性研究

选用阳性对照T-SIV-M克隆质粒10⁷copies/μl和10³copies/μl 2个高低浓度梯度，对每个浓度的样本做4个重复，结果10⁷copies/μl浓度Ct值标准差为0.035，10³copies/μl浓度Ct值标准差为0.01，具有较好的重复性。检测结果见表2和图3。

表2荧光定量RT-PCR检测猪流感病毒的重复性试验

实施例4特异性研究

为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征经典株和变异株、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪乙型脑炎病毒共9种病毒。

检测结果表明：本发明的试剂盒仅对仔猪脐带血中的猪流感病毒进行扩增，表明本发明试剂盒能特异性扩增猪流感病毒，而不与其它核酸发生交叉反应。检测结果见图4。

综上可见，本发明设计的一对特异性引物和一条荧光探针以及构成的实时荧光RT-PCR试剂盒可以快速鉴定仔猪脐带血中的猪流感病毒，而且该检测方法简单、快速、特异性好、灵敏度高、重复性优，检测结果真实可靠。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖南新南方养殖服务有限公司

<120>一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒及其用途

<130> FI160701-ND

<160> 4

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

caatcttgtcacctctgact aa 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

actgctctatccatgttgtt c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

cagtcctcgctcactgggca 20

<210> 4

<211> 142

<212> RNA

<213> SIV M基因序列

<400> 4

caatcttgtcacctctgactaagggaattttgggatttgtattcacgctcaccgtgccca 60

gtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccaaaatgccctaaatggaaatggggacc 120

cgaacaacatggatagagcagt 142

Claims (10)

1.一种检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：

上游扩增引物：5’-CAATCTTGTCACCTCTGACTAA-3’，其为SEQ ID NO:1序列；

下游扩增引物：5’-ACTGCTCTATCCATGTTGTTC-3’，其为SEQ ID NO:2序列；

特异性荧光探针：TAMARA-5’-CAGTCCTCGCTCACTGGGCA-3’-FAM，其为SEQ ID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因。

2.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为3:3:1。

3.根据权利要求2所述的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为0.1～0.6μM。

4.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光RT-PCR反应液(含酶)及说明书。

5.根据权利要求4所述的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无DNA酶的ddH₂O，所述阳性对照为含有猪流感病毒M基因序列的克隆质粒T-SIV-M，克隆质粒T-SIV-M的终浓度为1×10⁵copies/μL～1×10⁷copies/μL。

6.根据权利要求5所述的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述猪流感病毒M基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

7.根据权利要求6所述的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述克隆质粒T-SIV-M采用以下方法制备得到：利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列扩增猪流感病毒M基因序列，胶回收目的片段后与pEASY-T1载体连接，转化后筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为T-SIV-M。

8.根据权利要求5所述的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，用于检测仔猪脐带血中猪流感病毒时，反应体系以20μL计为：

荧光RT-PCR反应液(含酶)：15μL；

10μMSEQ ID NO:1所示的上游扩增引物：0.6～1.2μL，10μMSEQ ID NO:2所示的下游扩增引物：0.6～1.2μL，10μMSEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针：0.2μL～0.4μL；

RNA模板：2μL；

ddH₂O：补足至20μL。

9.根据权利要求8所述的检测仔猪脐带血中猪流感病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，其特征在于，用于检测仔猪脐带血中猪流感病毒时，实时荧光RT-PCR的反应条件为：50℃反转录30min；95℃预变性2min；95℃变性15Sec，60℃退火30Sec并收集荧光，共40个循环；结束反应。

10.权利要求1-9任一项所述的试剂盒在制备检测仔猪脐带血中猪流感病毒试剂中的用途。