CN106434892A - 一种检测非交通性脑积水易感性的引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测非交通性脑积水易感基因的引物及试剂盒，本发明提供的检测非交通性脑积水易感基因的方法为检测易感基因GSTT2的一个多态性位点:rs2719，本发明的引物及试剂盒可用来准确检测非交通性脑积水易感基因；利用本发明的引物及试剂盒可以为非交通性脑积水的深入研究和辅助诊断、防治、新药研发提供了新的思路。

Description

一种检测非交通性脑积水易感性的引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，特别是非交通性脑积水的基因检测试剂盒。

背景技术

脑积水是由于颅脑疾患,使得脑脊液分泌过多或(和)循环、吸收障碍而致颅内脑脊液量增加，脑室系统扩大或(和)蛛网膜下腔扩大的一种病症。其典型症状为头痛、呕吐、视力模糊，视神经乳头水肿，偶伴复视，眩晕及癫痫发作。未经治疗的先天性脑积水，虽有20％可以停止发展，但是，约半数患儿一年半内死亡。

脑积水分为交通性脑积水和非交通性脑积水，正常人的脑脊液的形成和吸收是一个动态的平衡过程。脑脊液的形成是由侧脑室的脉络丛产生的，脉络丛产生的脑脊液经过其他脑室，经过小脑与脑桥的间隙流到蛛网膜下腔，经过蛛网膜下腔的血管重新吸收，以达到平衡。如果脉络丛产生的脑脊液过多或者蛛网膜下腔发生纤维化，就会导致交通性脑积水，非交通性脑积水又称梗阻性脑积水，是指病变位于脑室系统内或附近，阻塞脑室系统脑脊液循环而形成，即第四室出口以上部位发生阻塞造成的脑积水，常见于蛛网膜囊肿，导水管闭锁或狭窄，正中孔或室间孔发育不良，Chiari畸形，颅咽管瘤等。脑积水患儿起初没有明显的临床表现，随着脑脊液的增多，患儿表现为明显的头围增大，语言认知能力受到影响，肢体瘫痪；患儿需要做脑脊液分流手术，即从侧脑室分流过多的脑脊液经导管到腹腔中进行治疗；因此对患儿的早期诊断非常重要，可以实现早诊断早治疗；当前的诊断主要是核磁共振扫描技术，通过对病人脑部扫描，确定Evan比例，即侧脑室最宽的部分与脑部最宽的部分的比例，如果大于0.3即为脑积水，但核磁共振扫描所需费用高,对病人体动敏感，易产生伪影，扫描时间长,部分病人会有幽闭恐惧症；而且当用核磁共振技术扫描后判断的脑积水是要等到病人发病甚至病重后才能被确诊，这样很不利于病情的控制，而脑积水病人如果早诊断早治疗的话会有效控制病情。

一个世纪以来，人们对脑积水的生理、生化、影像、药物治疗以及社会家庭、环境等方面观察，对脑积水发病机理做出了各种假说和判断，随着科技进步，人们越来越认识到基因缺陷是产生非交通性脑积水的重要原因，经调查研究，非交通性脑积水是遗传度很高的疾病，科技日益发展的今天如何对待交通性脑积水，如何从遗传角度检测易感基因以及个体的疾病易感性，从而进行进一步风险预测和诊断，成为广大科技人员和医疗卫生人员面临的严峻问题，

利用遗传标记对致病基因进行检测，是近几年来发展的技术。遗传标记，即在染色体上有一段特异DNA序列片段，且有多态性，在世世代代传递中，遵循规律为分离、独立分配和连锁规律，因此可获得遗传物质传递信息。遗传标记可以把基因组分为不同区域，通过连锁和关联分析可获得致病基因所在染色体区域，可对该病基因进一步进行克隆。对于各种不同疾病，寻找致病基因和分析是研究的关键之一。

第三代遗传标记—SNP(single nucleotide polymorphism)指基因组中某特定核苷酸的位置上会存在两种或两种以上的不同碱基，在群体中最小等位基因频率≥1％。人类的基因组中多数SNP位点仅存在2种等位基因，所以通常SNP会指在特定位置上，某一核苷酸出现双等位基因的改变。SNP是人类基因组计划走向应用的非常重要方法。主要因为SNP提供一个非常有力的工具，用于高危人群的发现、疾病易感基因的鉴定、药物设计和基础生物学研究等。因为人类大量存在SNP位点，提供了更多的机会发现基因与疾病间的关系。通过SNP发现疾病相关基因的突变要比家系等研究容易。某些SNP并不是致病基因，但它可能与某些相邻的致病基因连锁，也同样为重要标记。

SNP以其密度高(平均每1kb就有1个)、代表性强(位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平)、遗传稳定性好(同微卫星多态性比较而言)、易于自动化分析(因SNP在人群中多为双等位基因标记，可简单以“+/－或1/0”直接分型)等特点成为很好的遗传标志。

目前尚无任何关于GSTT2基因与非交通性脑积水相关联的研究结果，本发明第一次利用SNP技术对非交通性脑积水易感基因进行检测，为非交通性脑积水的深入研究和防治、诊断、治疗提供了新的思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测非交通性脑积水易感性的引物及试剂盒，从而满足本领域对于正确识别非交通性脑积水易感基因的需求，为非交通性脑积水的深入研究、预防、治疗、诊断提供了新的思路。

发明人通过研究结果表明，22号染色体GSTT2基因位于22q11.23，编码谷胱甘肽硫转移酶，是非交通性脑积水的易感基因，通过对GSTT2基因的SNP位点：rs2719进行分析，结果显示，rs2719与非交通性脑积水高度相关。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

1、一种检测非交通性脑积水易感基因的引物，其特征在于：所述引物为扩增GSTT2基因rs2719的核苷酸序列，分别为序列表SEQ ID No.1和序列表SEQ ID No.2所示。

2、一种检测非交通性脑积水易感基因的试剂盒，其特征在于包括以下试剂：

1)引物：为SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，

2)PCR扩增缓冲液，Taq DNA聚合酶，

3)dNTP混合液。

具体的说，本发明是用以下技术方案实现的：

一种检测非交通性脑积水的GSTT2易感基因rs2719的核苷酸序列，为序列表SEQID No.3所示核苷酸序列。该核苷酸序列位于GSTT2基因，其变异位点，以字母“R"表示，

所述的单核苷酸多态性位点rs2719的基因型为G时，受试者的易感性最低，携带T等位基因时候，受试者的易感性升高。

一种体外检测非交通性脑积水易感基因的检测方法，包括如下步骤：

1、基因组DNA提取

采用提取DNA的试剂盒，提取外周血的白细胞中全基因组的DNA

2、基因组DNA质量检测

3、基因组DNA含量和纯度的检测

4、利用引物，PCR扩增目的片段

扩增GSTT2基因rs2719多态性的引物分别为：SEQ ID No.1，SEQ ID No.2的核苷酸序列

5、检测多态性位点的基因型。

将PCR产物直接测序，根据荧光信号的差异判定基因型。

6、结果判定

rs2719碱基为(T)的个体为非交通性脑积水易感人群。

本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品来源无限制，如：体液(血液、腹水及尿液等)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含GSTT2基因突变位点的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含GSTT2基因变异点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。

在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据GSTT2基因突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩增步骤的引物。

本发明通过大样本的统计分析，研究了GSTT2基因序列的rs2719多态性位点在非交通性脑积水患者的等位基因频率，并根据基因型在患病子女中的传递情况，进行传递不平衡检验和单体型分析，结果发现，全部样本的基因型分布和等位基因频率均符合Hardy-Weinburg平衡，经过Bonferroni矫正，传递不平衡检验分析有显著的统计学差别，通过大样本实验进行了论证。

根据本发明由GSTT2基因碱基突变特性判定非交通性脑积水的易感人群的方法，可对未表现出临床症状的人群进行如下方法的筛查，rs2719碱基为G的不易发生交通性脑积水，rs2719碱基为T的易发生非交通性脑积水，为易感人群，有此类病的家庭，千万不要讳疾忌医，致使病情日渐恶化、迁延，造成难以康复的结果。对此病及早进行防治，是本发明的一个重要用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明创造性对非交通性脑积水易感性基因进行检测，目前对脑积水的检测主要是通过核磁共振的方式，而这种方法不能实现早期诊断。

2、本发明可以实现早期诊断，传统的免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多的免疫学检测存在较长的“窗口期”，不利于对疾病的早期诊断，利用本发明的试剂盒进行检测，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测虽然也有利于疾病的早期诊断，而交通性脑积水的病人如果在严重的症状出现之前进行检测，就可以实现早诊断早治疗。

3、取样简单方便，可以通过病人的血液标本中检出特异基因,本发明用血液等标本对非交通性脑积水进行检测,属于本领域人员利用现有技术能轻松实现的操作。

4、与传统的基因扩增技术相比，本发明提供的检测方法省时，灵敏度高，特异性强。

5、利用本发明阐述GSTT2基因位点的碱基变异，作为生物标志物之一，可用于药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节GSTT2表达的活性分子，有利于促进非交通性脑积水新药研发。

具体实施方式

实施例1

1、选择候选基因和SNPs

本发明人查阅文献、利用计算机互联网及生物信息学获取各方面交通性脑积水候选基因研究，在22号染色体通过连锁不平衡分析方法进行单个核苷酸多态性(SNP)连锁不平衡分析，通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库，获得GSTT2基因，并通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP，http://snp.cshl.org/数据库，搜索出符合其条件的候选基因SNPs。其入选标准：1、已有相关文献进行报道；2、位点最小等位基因频率应大于10％；3、所选SNPs必须能够符合引物设计软件的要求；4、所选位点不能影响基因分型实验。

2、研究对象

本发明以298例非交通性脑积水和301例健康对照(身体健康，无躯体疾病，无家族遗传性疾病史，无精神疾病史，无药物滥用)为研究对象。所有研究对象均为中国汉族人，并且自愿签订伦理委员会批准的知情同意书。

2.1非交通性脑积水的入组和排除标准

2.1.1入组标准

(1)符合非交通性非脑积水诊断标准；

(2)自愿参加并签署知情同意书。

2.1.2排除标准

(1)诊断为交通性脑积水患者；

(2)明确中枢神经系统疾病，如中风、帕金森和癫痫等

(3)严重躯体疾病，如感染、糖尿病和高血压等；

3、血液和临床资料收集

受试者在认真阅读、理解、并自愿签署伦理委员会批准的项目知情同意书后，取外周静脉血5ml，-20度保存至提取基因组DNA。收集非交通性脑积水患者年龄、性别、家族史、民族和文化程度、首次入院和确诊时间、临床症状、认知功能等和疾病相关的资料；正常人收集一般人口学资料及认知功能评定量表。

3.1基因组DNA提取

采用专门提取DNA试剂盒，提取外周血的白细胞中全基因组的DNA。操作步骤如下：血液解冻、标记1.5mlEppendorf离心管→细胞裂解液900uL加入离心管中→加入解冻后全血200uL后，混匀，常温下作用20min，并颠倒4-6次→10，000rpm离心时间4min，去除上清，然后振荡，使沉淀物再次悬浮→300uL核裂解液，然后轻轻地振荡，使其混匀，再37℃水浴30min→RNA降解酶1.5μL，振荡混匀，水浴15min，37℃→蛋白沉淀液100uL，轻弹管底，常温作用20min→12，000rpm离心4min，将上清液转移到已加入异丙醇300uL的离心管中，20min轻轻颠倒→12，000rpm离心4min，弃上清，加70％乙醇300uL，轻轻摇匀→12，000rpm离心4min，弃上清，将离心管倾斜倒置，等待凉干→DNA溶解液100uL混匀，水浴1h，65℃(或4℃过夜)，DNA在离心管中已制备完毕。

3.2基因组DNA质量检测

取1-2μL基因组DNA原液，通过琼脂糖电泳方法检测所提取DNA样品是否满足质量标准要求；

3.3基因组DNA含量和纯度的检测

用NanoDrop-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计准确测定每份样本DNA含量和OD比值(A260/A230、A260/A280)。A260/A230比值低：小分子杂质或残存的盐污染，若过高有未知的杂质。比值(A260/A280)低：蛋白或者苯酚有残留所致；比值(A260/A280)比值高：RNA有残留所致；通常A260/A280≈1.8代表样本DNA是纯净的

4、设计引物

扩增GSTT2基因rs2719多态性的引物分别为：

TCTCTCCAGCTTCATGTGAAGCTCTGCACA(SEQ ID No.1)

ATTGCAGATTTAGTGTCTTACTGGTTATGT(SEQ ID No.2)

PCR扩增目的片段

应用以上引物进行PCR扩增，PCR反应体系为20ul，其中含10mM Tris-HCl(PH8.4)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，200uM dNTP，上下游引物各0.4uM，Taq聚合酶1U，DNA模板30-50ng，PCR扩增条件为：PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸25s，总共35个循环，72℃总延伸2min，取PCR产物5ul用1.5％琼脂糖凝胶电泳，以DNAmarker为分子量标准品，扩增。

5、测序判定基因型

PCR产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察合格后基因测序公司进行测序验证。

6、结果判定

rs2719碱基为(T)的个体为非交通性脑积水易感人群。

本发明通过上述实验，建立Pedigree基因分析数据库，应用拟合优度卡方检验和传递不平衡检验，应用UNPHASED分析软件进行单倍体传递卡方检验，利用GraphPadprism分析数据。

传递不平衡检验显示，SNP与非交通性脑积水显著关联(P<0.001).利用PCR-RFLP技术，检测到rs2719碱基为(T)与非交通性脑积水临床症状总分相关(P<0.05)。rs2719(T)与阳性症状、认知功能、阴性症状相关(P<0.05)。

应用在线遗传统计SHEsis软件计算基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律；分析候选基因SNPs位点与非交通性脑积水的关联性；分析基因各个位点之间连锁不平衡程度及单倍型；应用MDR软件分析基因-基因间的交互作用；应用GraphPadprism软件分析候选基因SNPs位点与非交通性脑积水临床症状。

本发明通过大样本的统计分析，研究了GSTT2基因序列的rs2719多态性位点在非交通性脑积水患者的等位基因频率，并根据基因型在患病子女中的传递情况，进行传递不平衡检验和单体型分析，结果发现，全部样本的基因型分布和等位基因频率均符合Hardy-Weinburg平衡，经过Bonferroni矫正，传递不平衡检验分析有显著的统计学差别，通过大样本实验进行了论证。

该位点共检测298例非交通性脑积水患者，301例健康正常对照受试者；rs2719位点为二态SNP；经测序检测，在群体中出现不同的基因型结果。采用在线遗传统计SHEsis软件分别分析患者、和健康对照受试者的基因型和等位基因频率，SNPs的基因型频率分布均符合H-W平衡，说明该研究的抽样群体符合H-W平衡。检测rs2719位点基因型和非交通性脑积水患者认知功能的相关性，结果显示与阳性症状、阴性症状、认知有显著差异(P<0.05)。说明该位点影响患者的临床症状。

实施例2

验证试验：采用本试剂盒，随机选取非交通性脑积水患者样本20例，对照组样本20例，经PCR测序检测GSTT2基因rs2719位点多态性。

1、PCR扩增：

通过PCR扩增GSTT2基因rs2719部分片段，PCR反应体系为：10×PCR反应缓冲液3μL，10mM/LdNTP0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，10pM/L引物0.5μL，基因组DNA1μL，加去离子水至30μL。PCR时于每一体系中加入20μL石蜡油，防止液体挥发。

PCR反应条件为95℃预变性5min，96℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸25s，总共35个循环，72℃总延伸2min。

2、测序判定基因型

PCR产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察合格后送华大基因测序部进行测序验证。

3、结果

结果显示，患者样本GSTT2基因rs2719位点，多态性基因型为TG的8例，TT12例；健康对照组基因型全部为GG。本方法可以有效检测出非交通性脑积水。

位点多态性：GG时，受试者的易感性最低；携带T等位基因，受试者的易感性升高。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种检测非交通性脑积水易感基因的引物，其特征在于：所述引物为扩增GSTT2基因rs2719的核苷酸序列，分别为序列表SEQ ID No.1和序列表SEQ ID No.2所示。

2.一种检测非交通性脑积水易感基因的试剂盒，其特征在于包括以下试剂：

1)引物：为SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，

2)PCR扩增缓冲液，Taq DNA聚合酶，

3)dNTP混合液。