CN106434835A - NF‑κB活化因子1及其抑制剂在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用 - Google Patents

NF‑κB活化因子1及其抑制剂在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种NF‑κB活化因子1（ACT1）在治疗脂肪肝和II型糖尿病中的功能和应用。通过高脂饮食诱导的模型研究ACT1基因的功能，发现HFD组ACT1基因敲除小鼠的体重和空腹血糖水平均低于对照组WT小鼠，腹腔注射葡萄糖耐量实验发现ACT1基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显增强；从小鼠肝脏重量和肝脏脂质成分测定结果等均说明HFD组的ACT1‑KO小鼠脂肪肝病变明显好转，脂质蓄积显著减少，这些结果表明ACT1基因敲除显著改善脂肪肝和II型糖尿病。针对ACT1的上述作用，其可作为筛选用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物靶标，其抑制剂可用于预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物。

Description

NF-κB活化因子1及其抑制剂在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的 功能和应用
技术领域
本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种NF-κB活化因子1(NF-κBactivator 1，ACT1)作为药物靶标在筛选治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的药物中应用。
背景技术
糖尿病是一种以慢性高血糖为特征、严重危害人类健康的代谢性疾病。临床上主要以I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠型糖尿病为主；其中，II型糖尿病最多见，约占总糖尿病患者的90％-95％。现在全球患II型糖尿病的人数已超过20年前的两倍。在2015年，国际糖尿病联合会估计全球患糖尿病的人数已超过4.15亿。糖尿病是由遗传和环境因素的复合病因引起的，可能与胰岛素抵抗和胰腺β细胞功能缺陷有关，但其病因和发病机制仍未完全阐明；且长期碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢紊乱可引起多系统损害，导致眼、肾、神经、心脏和血管等组织器官发生慢性进行性病变和功能减退甚至衰竭。
肝脏是物质代谢的中枢，具有诸如调控葡萄糖和脂质以及其他物质的合成与分解的重要生理功能。脂肪肝是指各种原因引起肝细胞发生脂肪变性和脂质积聚。当肝脏中脂质的流入和合成超过脂质的流出和分解时，即可形成脂肪肝。糖尿病和脂肪肝可互相影响，糖尿病可促进脂肪肝进一步发展为脂肪肝肝炎、肝硬化、甚至肝细胞性肝癌；而脂肪肝可促进糖尿病发生急性严重代谢紊乱，如糖尿病酮症酸中毒和高渗高血糖综合征等。研究结果显示，在糖尿病人群中，非酒精性脂肪肝患病率可高达80％。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，II型糖尿病合并脂肪肝的患病率正逐年增加。
NF-κB活化因子1(NF-κB activator 1，ACT1)是活化核转录因子NF-κB的重要蛋白分子。ACT1由574个氨基酸组成，包含2个肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)结构域、1个螺旋-环-螺旋结构域和1个SEFIR结构域(1)。在IL-17的刺激下，IL-17受体可通过SEFIR-SEFIR结构域相互作用，来招募ACT1(2)：ACT1可与Traf6和TAK1相互作用来激活NF-κB信号通路；I Kappa B激酶i(IKKi)磷酸化ACT1，促发ACT1的构象发生改变，可减少ACT1对Traf6亲和力，并促进ACT1与Traf2/5结合，从而激活促分裂原活化蛋白激酶信号(MAPK)信号通路(3-5)。因此，ACT1是IL-17受体下游信号通路中关键接头蛋白分子。且有研究表明，高浓度的IL-17与诸如哮喘、类风湿性关节炎和炎症性肠病等自身免疫性疾病和炎症性疾病有关(4，6，7)。
参考文献：
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发明内容
为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种ACT1基因的表达与脂肪肝和Ⅱ型糖尿病之间的相互关系，提供一种ACT1作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的药物中的应用，进而提供一种ACT1的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明以野生型C57小鼠与ACT1基因敲除小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究ACT1基因的功能，结果发现与野生型WT小鼠对比，ACT1基因敲除小鼠的体重、空腹血糖水平明显低于同种饲料饲养的WT小鼠。进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现，ACT1基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显增强。从小鼠肝脏重量、肝脏/体重比和脂质成分含量测定等均说明HFD组(High fat diet，高脂饮食)的ACT1-KO小鼠脂肪肝病变明显好转，脂质蓄积显著减少。这表明ACT1基因敲除会显著改善脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的发生，ACT1基因具有恶化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的作用，为研究防治脂肪肝和II型糖尿病的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。
因此，ACT1基因可作为药物靶点，构建ACT1基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物；
ACT1基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的目的。例如以ACT1为靶基因，设计可干扰ACT1表达的双链siRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA干扰的方法使ACT1基因沉默来治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病；还可以设计并构建ACT1的突变体，注射后进入细胞，竞争ACT1原形的作用底物，从而抑制ACT1的功能，起到治疗目的；此外，还可以以ACT1为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用ACT1基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制ACT1的分子，从而为脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的治疗提供新的治疗性分子。
针对ACT1的上述功能，提供ACT1作为药物靶标在筛选保护肝脏及糖代谢的药物中的应用。
针对ACT1的上述功能，提供ACT1作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。
针对ACT1的上述功能，提供ACT1的抑制剂在制备保护肝脏及糖代谢的药物中的应用。
针对ACT1的上述功能，提供ACT1的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。
一种保护肝脏及糖代谢的药物，包含ACT1的抑制剂。
一种预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物，包含ACT1的抑制剂。
所述的ACT1的抑制剂优选为ACT1基因的siRNA、ACT1基因的RNA干扰载体，ACT1的抗体及其他能够抑制ACT1表达的抑制剂。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发现ACT1基因的新功能，即ACT1基因能够恶化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的作用。
(2)基于ACT1基因在恶化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能，其为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物提供靶标。
(3)ACT1的抑制剂可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物。
附图说明
图1是WT和ACT1-KO小鼠的体重和空腹血糖结果图；
A为小鼠体重结果图，B为空腹血糖水平统计图(*：p＜0.05vs WT NC组，**：p＜0.01vs WT NC组，#：p＜0.05vs WT HFD组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。
图2是WT和ACT1-KO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图；
A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图，B为各组小鼠糖耐量曲线下面积(area under the curve，AUC)比较图(**：p＜0.01vs WT NC组，##：p＜0.01vsWT HFD组)。
图3是WT和ACT1-KO小鼠的肝脏重量和肝脏脂质含量结果图；
肝脏脂质含量包括肝脏甘油三酯、肝脏胆固醇和肝脏游离脂肪酸(##：p＜0.01vsWT HFD组)。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
实验用动物及饲养：
实验动物种属，性别，周龄及来源：C57BL/6(WT)小鼠和ACT1基因敲除小鼠(ACT1-KO)小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司；ACT1-KO小鼠购自美国TIGM公司，登记号：NM_134000。
实验动物饲料配方：高脂饲料(HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，总的热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料(NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，总的热量质量比:3.85kcal/g。
动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学SPF级实验动物中心。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40％-70％，小鼠自由饮水进食。
【实施例1】小鼠脂肪肝和Ⅱ型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)获得
(1)实验动物分组：选用8周龄，雄性，WT小鼠和ACT1-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WTNC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。
(2)模型通过高脂饲料诱导操作流程：
采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，进行表型相关分析，明确ACT1基因对脂肪肝和Ⅱ型糖尿病发挥的作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和ACT1-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(Highfat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WT NC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。每周均详细记录小鼠摄食量，小鼠空腹体重和空腹血糖每隔4周检测1次。实验第22周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力，第24周终末取材，取出小鼠肝脏，测定肝脏脂质含量。
【实施例2】小鼠体重和血糖水平测定
(1)小鼠空腹体重，食量检测
1)体重检测。
①禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00开始实验操作。
②称重：分别在第0周、4周、8周、12周、16周、20周和24周称重，将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。饲料量检测：待称体重操作完成后，给小鼠加饲料，并在动态电子天平上记录小鼠的饲料量。
(2)空腹血糖水平检测实验
将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食(不禁水)，即禁食6小时后开始实验操作。
①血糖仪准备：检查血糖仪(美国强生公司，ONETOUCH)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。
②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。
③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。
④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。
Ⅱ型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重和血糖等水平，体重和血糖变化结果如图1所示，WT小鼠在给与HFD饲料饲养后，从第4周开始体重明显高于其NC饲料组，给与ACT1-KO小鼠24周的HFD饲料和NC饲料饲养后，从第8周开始HFD组的ACT1-KO小鼠体重明显低于HFD组的WT小鼠体重，一直持续到第24周(见图1A)；经空腹血糖检测发现在HFD组的小鼠从第4周、8周、12周、16周、20周和24周的空腹血糖水平明显较相应NC对照组升高，HFD组的ACT1-KO小鼠空腹血糖水平也明显低于WT组小鼠空腹血糖水平(见图1B)。表明ACT1基因敲除后显著影响了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢稳态，ACT1基因敲除能显著改善小鼠的糖代谢能力，这些结果表明ACT1基因在高脂诱导引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用。
【实施例3】葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)
实验第22周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对糖耐受能力。
(1)在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μL/g计算葡萄糖的注射体积。
(2)先检测葡糖糖注射前即0分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。
(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。
(4)分别于腹腔注射后15分、30分、60分、120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。
进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucosetolerancetests，IPGTT)来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力，在实验第22周，通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的WT小鼠和ACT1-KO小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后60分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平(0分钟时血糖)，在2小时时恢复至空腹血糖水平，且ACT1-KO小鼠血糖水平从0分钟至2小时一直处于低于WT小鼠的血糖水平(图2A)。比较各组小鼠血糖曲线下面积(areaunder the curve，AUC)，发现WT小鼠HFD组的AUC显著高于NC组，ACT1-KO HFD组的AUC显著小于WT HFD组的AUC(图2B)，表明ACT1基因敲除能够显著促进糖代谢稳态。
【实施例4】肝脏质量及肝脏组织脂质成分测定
(1)终末肝脏组织取材
1)小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。
2)用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。
3)迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速拍照，称重。
(2)肝脏脂质成分测定
①从-80℃冰箱取出肝脏组织样品，称量50mg组织，使用研磨器将肝脏组织研磨成粉末状，溶于1mLPBS中，混匀后再与1mL氯仿/甲醇(2:1)共孵育过夜。
②以12000g高速离心15min后，收集管底脂质层物质，风干，以去除水分。
③将分离出的脂质层物质溶于200μL含1％Triton X-100的PBS溶液中，仔细吹吸混匀。
④开启电脑labman软件，打印机，再开启生化分析仪；
⑤选择并清洗检测探针、比色杯等，保证探针通畅、比色杯无杂质附着，吸光值在设定的参考范围；
⑥在labman软件上检查所需检测指标试剂是否足够，设定检测指标和检测顺序等。
⑦将制得的混匀液上机检测，分析。
在HFD组的ACT1-KO小鼠肝脏重量较HFD组的WT小鼠低(如图3)。对肝脏中的甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸进行检测，发现在HFD组的ACT1-KO小鼠肝脏中的甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸均较HFD组的WT小鼠低(如图3)。这些结果说明ACT1基因敲除小鼠的脂肪肝明显改善。
上述结果显示ACT1-KO小鼠在HFD的诱导下发生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病变明显好转。这些结果表明ACT1基因能显著促进糖代谢紊乱、促进肝脏脂质形成和脂肪肝形成。本发明结果说明ACT1基因在脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病模型中有着重要的恶化作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.ACT1基因作为药物靶标在筛选保护肝脏及糖代谢的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物是抑制ACT1基因表达的药物；所述的应用是非诊断和非治疗的。
3.ACT1基因作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的药物是抑制ACT1基因表达的药物；所述的应用是非诊断和非治疗的。
5.一种预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物，期特征在于，包含ACT1的抑制剂。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：所述的ACT1的抑制剂优选为ACT1基因的siRNA、ACT1基因的RNA干扰载体，ACT1的抗体及其他能够抑制ACT1表达的抑制剂。
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