CN106434517A - 一种高效丙酸产甲烷菌系的驯化方法 - Google Patents

一种高效丙酸产甲烷菌系的驯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丙酸产甲烷菌系的驯化方法，所述丙酸产甲烷菌系包括丙酸氧化细菌群、互营丙酸氧化菌群、乙酸裂解产甲烷菌群、氢营养型产甲烷菌群，该方法以沼气发酵液为接种物，以丙酸钠为碳源，以生物质材料为附着载体，通过阶梯性提高培养基中丙酸钠的浓度的方法来驯化沼气发酵液来获得高效丙酸产甲烷菌系，得到的丙酸产甲烷菌系具有耐冲击性强，生物强化作用稳定性高等优点，用于提高沼气发酵性能，长期稳定地在丙酸浓度在3.0g/L以上条件下高效利用，产气率为理论产量的75％，丙酸及乙酸的利用率大于90％。

Description

一种高效丙酸产甲烷菌系的驯化方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种高效丙酸产甲烷菌系的驯化方法。
背景技术：
在能源短缺及环境污染的双重压力下，既能处理废弃物又能产生可再生能源的沼气产业得到了较快发展，从小规模的户用沼气走向了规模化生产。据统计，全国沼气用户约4300万户，全国规模化沼气工程约10万处，然而，多数沼气池由于无法长期稳定运行而处于闲置状态，大部分沼气工程至今无法盈利。由挥发性有机酸累积导致的酸抑制问题是制约沼气发酵稳定性及经济性的因素之一。酸抑制或酸败现象在餐厨垃圾、农林废弃物、城市有机垃圾、能源作物等为原料的厌氧发酵过程中常发生。酸抑制是由于厌氧发酵系统上游产酸过程与下游产甲烷过程失衡，中间产物挥发性脂肪酸累积(主要是丙酸，乙酸)，致使发酵系统pH降低，抑制了产甲烷菌的活性，最终导致发酵系统产气能力下降或者发生酸败。通常的解决方法是宏观上优化运行参数，如投加碱调节pH，或者降低有机负荷和发酵浓度，使发酵在相对较低的发酵浓度下运行，这就限制了发酵效率。随着生物强化技术在废水处理领域的应用，研究人员开始尝试将其应用到沼气发酵系统中，即人为的添加特定功能的微生物来应对酸抑制，提高发酵系统的稳定性，提高发酵浓度，或恢复酸败系统产气。
虽然，已有关于生物强化技术缓解酸抑制的报道，但是投加功能菌的多为购买的纯培养的针对丙酸降解的互营丙酸氧化细菌，或针对乙酸产甲烷过程的产甲烷古菌，亦或是人为地将几种微生物进行组合制成复合微生物菌剂。这些菌剂的制备技术存在以下问题：第一，厌氧的微生物培养条件苛刻，需要专门厌氧设备及微生物专业技术人员进行培养；第二，纯培养的微生物丙酸氧化细菌或产甲烷菌作为外源投加的菌种很难适应厌氧发酵系统中的复杂环境条件，如高丙酸浓度或乙酸浓度；第三，单一类型的微生物作为生物强化菌剂投加到厌氧发酵体系后很难抵抗土著微生物的竞争并长期地保持生物持有量以发挥强化作用。因此，为获得生物活性稳定且高效降解丙酸的生物强化菌剂，有必要提出一种有效驯化方法。
发明内容：
本发明的目的是提供一种高效丙酸产甲烷菌系的驯化方法，得到的丙酸产甲烷菌系主要包括丙酸氧化细菌群、互营丙酸氧化菌群、乙酸裂解产甲烷菌群、氢营养型产甲烷菌群等，具有耐冲击性强，生物强化作用稳定性高等优点，用于提高沼气发酵性能。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种丙酸产甲烷菌系的驯化方法，所述丙酸产甲烷菌系包括丙酸氧化细菌群、互营丙酸氧化菌群、乙酸裂解产甲烷菌群、氢营养型产甲烷菌群，该方法以沼气发酵液为接种物，以丙酸为碳源，以生物质材料为附着载体，通过阶梯性提高培养基中丙酸钠的浓度的方法来驯化沼气发酵液来获得高效丙酸产甲烷菌系，该方法包括以下步骤：在氮气和二氧化碳体积比为4:1的混合气氛中，按体积比为19:1将接种物接种到丙酸钠浓度为0.5g/L的新鲜培养基中，放入连续的CSTR在线自动采气装置中进行培养，每24h置换新鲜的培养基，7-14天为一个培养周期，每培养10-15天后加入1-2cm长的能源草，所述能源草与新鲜的培养基体积比为20％，此后阶梯性提高新鲜培养基中丙酸钠的浓度，直至新鲜培养基中丙酸钠浓度大于3.0g/L，经过10个周期的驯化，获得了目标产物；所述新鲜培养基配制如下：在1L水中加入400mg NH4Cl、250mg MgSO4·6H2O、400mg KCl、120mg CaCl2·2H2O、80mg(NH4)2HPO4、55mg FeCl3·6H2O、5000mg NaHCO3、丙酸钠，还加入CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、CuCl2·2H2O、AlCl3·6H2O、ZnCl2、Na2WO4·2H2O、H3BO3、Na2SeO3、Ma2MoO4·2H2O各0.0005mg，所述丙酸钠的加入量跟相应的培养基所需的丙酸钠浓度一致，所述丙酸的浓度通过在培养基中加入相应量丙酸钠实现，pH调节至7.0。
所述生物质材料为木质纤维素类原料(如秸秆，能源草等)。
本发明还保护所述丙酸产甲烷菌系的应用，所述丙酸产甲烷菌系可长期稳定地应用在丙酸累积浓度为3.0g/L以上的沼气发酵罐中，促进丙酸降解及产甲烷，其产气率为理论产量的75％，丙酸及乙酸的利用率大于90％。
本发明还提供一种丙酸产甲烷菌系固体菌剂的制备方法，将上述驯化后的丙酸产甲烷菌系菌液离心弃去液体部分后置于厌氧环境下室温风干，收集固体粉末并真空密封保存得到丙酸产甲烷菌系固体菌剂。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明得到的丙酸产甲烷菌系具有耐冲击性强，生物强化作用稳定性高等优点，用于提高沼气发酵性能，可长期稳定地应用在丙酸累积浓度为3.0g/L以上的沼气发酵罐中，促进丙酸降解及产甲烷，产气率为理论产量的75％，丙酸及乙酸的利用率大于90％。
(2)本发明得到的丙酸产甲烷菌系固体菌剂便于运送和长期保存。
附图说明：
图1是本发明实施例2中添加有丙酸产甲烷菌系发酵体系与空白对照在不同有机负荷的餐厨垃圾厌氧发酵产气性能对比图；
其中R1为空白对照，R2为添加有丙酸产甲烷菌系发酵体系。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
本实施例接种物沼气发酵液为能源草发酵液，有机负荷2.0g/L d，日容积产气率为0.9L/L d。(也可选取其他任意稳定运行发酵罐的发酵液)。
培养装置为2L的连续的CSTR在线自动采气装置。
以风干、切碎至1-2cm的能源草为附着载体。
本实施例丙酸产甲烷菌系的驯化方法，包括以下步骤：在氮气和二氧化碳体积比为4:1的混合气氛中，以保证厌氧环境，将接种物1900ml接种到丙酸钠浓度为0.5g/L的100ml新鲜培养基中，放入2L的连续的CSTR在线自动采气装置中进行培养，每24h用注射器吸出100ml的菌液，并注入100ml新鲜的培养基，7-14天为一个培养周期，每培养10-15天后加入1-2cm长的能源草，所述能源草与新鲜的培养基的体积比为20％，此后阶梯性提高新鲜培养基中丙酸钠的浓度(参见表1)，直至新鲜培养基中丙酸钠浓度大于3.0g/L，经过10个周期的驯化，获得了可长期稳定地在丙酸浓度在3.0g/L条件下高效利用的丙酸产甲烷菌系，其产气率为理论产量的75％，丙酸及乙酸的利用率大于90％；所述新鲜培养基配制如下：在1L水中加入400mg NH4Cl、250mg MgSO4·6H2O、400mg KCl、120mg CaCl2·2H2O、80mg(NH4)2HPO4、55mg FeCl3·6H2O、5000mg NaHCO3、丙酸钠，还加入CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、CuCl2·2H2O、AlCl3·6H2O、ZnCl2、Na2WO4·2H2O、H3BO3、Na2SeO3、Ma2MoO4·2H2O各0.0005mg，所述丙酸钠的加入量跟相应的培养基所需的丙酸钠浓度一致，所述丙酸的浓度通过在培养基中加入相应量丙酸钠实现，pH调节至7.0。
表1
培养周期 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
丙酸钠浓度(g/L) 0.5 0.625 0.75 0.9 1.2 1.6 1.8 2.0 2.5 3.0
将上述驯化后的丙酸产甲烷菌系菌液以5000-8000rpm的转速离心5-10min，弃去液体部分后置于厌氧环境(厌氧操作箱，厌氧气袋)下室温风干，收集固体粉末并真空密封保存得到丙酸产甲烷菌系固体菌剂。
实施例2：本发明获得的高效丙酸产甲烷菌剂对餐厨垃圾的厌氧发酵生物强化作用。
发酵原料：人工配置的餐厨垃圾，由米粉，奶粉及全蛋粉组成的，三种成分的比例为米粉：蛋白粉：奶粉为2：1：1，C/N为40。
接种物：猪粪处理厂厌氧发酵液。
反应装置：2L的连续CSTR在线自动采气装置。
实验设置：共运行2个2L半连续厌氧发酵罐，分别为R1，R2。R1为空白对照，即餐厨垃圾独立厌氧发酵，不添加菌剂。R2从运行的第16天开始每天添加实施例1得到的高效丙酸产甲烷系固体菌剂0.3g。
2个反应器的运行过程如下：水力停留时间(HRT)为15天，即每天排出100ml的发酵液，注入100ml的人工配置的餐厨垃圾。2个反应器共连续运行60d，即4个HRT，每个HTR的有机负荷率(OLR)依次为0.5g/L d，0.75g/L d，1.0g/L d及1.5g/L d。
结果表明：有机负荷率为0.5g/L d的前15天内，R1和R2的容积甲烷产量在0.14L左右，当有机负荷提升至0.75g/L d时，R1未加菌剂的发酵体系产气明显下降，而R2添加菌剂的发酵体系产气量增加，此后的两个HRT，R1产气稳定，有机负荷率在1.5g/L d仍可稳定运行，而不加菌剂的R1在有机负荷率提至1.0g/L d后已完全不能产气(参见图1)。
由此可见，通过本发明得到的高效丙酸产甲烷菌剂可提高餐厨垃圾厌氧发酵的有机负荷率3倍，提高发酵浓度，促进产气。

Claims (4)

1.一种丙酸产甲烷菌系的驯化方法，其特征在于，所述丙酸产甲烷菌系包括丙酸氧化细菌群、互营丙酸氧化菌群、乙酸裂解产甲烷菌群、氢营养型产甲烷菌群，该方法以沼气发酵液为接种物，以丙酸为碳源，以生物质材料为附着载体，通过阶梯性提高培养基中丙酸钠的浓度的方法来驯化沼气发酵液来获得高效丙酸产甲烷菌系，该方法包括以下步骤：在氮气和二氧化碳体积比为4:1的混合气氛中，按体积比为19:1将接种物接种到丙酸钠浓度为0.5g/L的新鲜培养基中进行培养，培养温度为37℃，每24h置换新鲜的培养基，7-14天为一个培养周期，每培养10-15天后加入1-2cm长的能源草，所述能源草与新鲜的培养基的体积比为20％，此后阶梯性提高新鲜培养基中丙酸钠的浓度，直至新鲜培养基中丙酸钠浓度大于3.0g/L，经过10个周期的驯化，获得了目标产物；所述新鲜培养基配制如下：在1L水中加入400mg NH4Cl、250mg MgSO4·6H2O、400mg KCl、120mgCaCl2·2H2O、80mg(NH4)2HPO4、55mgFeCl3·6H2O、5000mg NaHCO3、丙酸钠，还加入CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、CuCl2·2H2O、AlCl3·6H2O、ZnCl2、Na2WO4·2H2O、H3BO3、Na2SeO3、Ma2MoO4·2H2O各0.0005mg，所述丙酸钠的加入量跟相应的培养基所需的丙酸钠浓度一致，所述丙酸的浓度通过在培养基中加入相应量丙酸钠实现，pH调节至7.0。
2.根据权利要求1所述的丙酸产甲烷菌系的驯化方法，其特征在于，所述生物质材料选自秸秆或能源草。
3.一种权利要求1得到的丙酸产甲烷菌系的应用，其特征在于，所述丙酸产甲烷菌系在丙酸浓度为3.0g/L以上条件下稳定产气。
4.一种丙酸产甲烷菌系固体菌剂的制备方法，其特征在于，将经权利要求1所述的丙酸产甲烷菌系的驯化方法驯化后得到的丙酸产甲烷菌系菌液离心弃去液体部分后置于厌氧环境下室温风干，收集固体粉末并真空密封保存得到丙酸产甲烷菌系固体菌剂。
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