CN106404819A - 基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法 - Google Patents

基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，包括以下步骤：步骤1，将自由基捕获剂α‑(4‑吡啶基‑1‑氧)‑N‑叔丁基硝基酮加入到待检测的海参试样，使自由基捕获剂的浓度为20‑60mM；步骤2，将步骤1获得的混合样品进行热加工处理；步骤3，热处理后的样品立即放入冰浴中保存，检测时对样品进行离心，用毛细管吸取上清液进行电子自旋共振检测。本发明是应用ESR技术检测海参加工过程中氧化物质的生成，以反映海参在加工过程中的品质变化，为海参生产及加工提供理论参考，从而通过控制加工工艺参数来提高海参的品质。本发明为海参加工过程中的品质检测提供更快速、准确的方法及明确的规范。

Description

基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的 方法
技术领域
本发明属于食品质量检测技术领域，特别是涉及一种基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法。
背景技术
海参(Stichopus japonicus)富含蛋白质、黏多糖及海参皂苷等多种生理活性物质，具有极高的营养价值和药用价值，现已加工成多种产品形式。海参在加工过程中因其自溶特性必须经过热处理，而且对于即食海参还需经过热杀菌过程以保证一定的货架期。然而，热处理过程中常常伴随物质氧化的发生，目前已在多种水产品加工过程中发现热处理会导致蛋白质氧化、脂质过氧化，影响产品的加工品质。研究海参加工过程中的氧化物，将为评价海参产品的品质，预测海参产品的货架期提供有力依据。
检测蛋白、脂质的氧化程度常用化学方法来进行，如采用硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化的终产物之一丙二醛的含量来评价脂质的过氧化程度。但化学方法存在灵敏度和精确度不高的问题，同时脂质过氧化其终产物比较复杂，除了丙二醛以外还有其他的醛类产物，会干扰测定结果的准确度和精度。
电子自旋共振(electron spin resonance,ESR)技术是检测自由基最直接最有效的方法，是自由基生物学和医学不可缺少的重要研究技术。捕获剂ST与自由基R·反应形成的自旋加合物R-ST具有相对较长的寿命而且有特征的ESR波谱，可以方便地在ESR波谱仪上检测。活性氧自由基在食品的氧化腐败中起着决定性的作用。质量控制时，可以在食品生产的流程中定时地加入捕获剂，定时采样，然后在ESR波谱仪上检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，以解决利用化学方法检测存在灵敏度和精确度不高的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，包括以下步骤：
步骤1，将自由基捕获剂α-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮加入到待检测的海参试样，使自由基捕获剂的浓度为20-60mM；
步骤2，将步骤1获得的混合样品进行热加工处理；
步骤3，热处理后的样品立即放入冰浴中保存，检测时对样品进行离心，用毛细管吸取上清液进行电子自旋共振检测；电子自旋共振检测的扫描条件为：中心磁场：3490-3510G；扫描宽度：50-100G；频率：9.85GHz；衰减器：20.00dB；功率：1.50-2.50mW；接收增益：1.00×105-1.00×106；调制频率：100kHz；调制幅度：1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；时间常数：4000.00-6000.00msec；转换时间：300.00-400.00msec。
本发明如上所述的基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，优选地，在步骤1之前还包括海参试样预处理，将新鲜的海参宰杀去脏、去筋，按1:3-1:10的重量配比加入pH5.5-8.0的磷酸盐缓冲液，在冰浴条件下匀浆获得海参试样。
本发明如上所述的基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，优选地，步骤2中的热处理的条件为，75-121℃温度下加热时间10min-5h。更优选地，步骤2中的热处理的条件为，90-100℃温度下加热时间2-4h。
本发明如上所述的基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，优选地，步骤3中的离心处理的条件为，在8000-13000rpm转速，4-10℃的温度条件下离心5-20min。更优选地，步骤3中的离心处理的条件为，在6-8℃的温度条件下离心10-16min。
本发明的有益效果是：
本发明是应用ESR技术检测海参加工过程中氧化物质的生成，以反映海参在加工过程中的品质变化，为海参生产及加工提供理论参考，从而通过控制加工工艺参数来提高海参的品质。本发明为海参加工过程中的品质检测提供更快速、准确的方法及明确的规范。
附图说明
图1为实施例1的检测结果图；
图2为实施例2的检测结果图；
图3为实施例2的检测结果图；
图4为实施例3的检测结果图；。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，包括以下步骤：
准备步骤：海参试样预处理，将新鲜的海参宰杀去脏、去筋，按1:3-1:10的重量配比加入pH5.5-8.0的磷酸盐缓冲液，在冰浴条件下匀浆获得海参试样。
步骤1，将自由基捕获剂α-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮加入到待检测的海参试样，使自由基捕获剂的浓度为20-60mM；
步骤2，将步骤1获得的混合样品进行热加工处理；在优选的实施例中，步骤2中的热处理的条件为，75-121℃温度下加热时间10min-5h。在更优选的实施例中，步骤2中的热处理的条件为，90-100℃温度下加热时间2-4h。
步骤3，热处理后的样品立即放入冰浴中保存，检测时对样品进行离心，在优选的实施例中，步骤3中的离心处理的条件为，在8000-13000rpm转速，4-10℃的温度条件下离心5-20min。在更优选的实施例中，步骤3中的离心处理的条件为，在6-8℃的温度条件下离心10-16min。用毛细管吸取上清液进行电子自旋共振检测；电子自旋共振检测的扫描条件为：中心磁场：3490-3510G；扫描宽度：50-100G；频率：9.85GHz；衰减器：20.00dB；功率：1.50-2.50mW；接收增益：1.00×105-1.00×106；调制频率：100kHz；调制幅度：1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；时间常数：4000.00-6000.00msec；转换时间：300.00-400.00msec。
对于不同样品，扫描条件选择有所不同。中心磁场是为保证所得波谱能够近似呈对称分布，因此过高或过低都会影响波谱信号的位置；扫描宽度的选择要能够覆盖全部的波谱以便于搜索到共振信号，但不易过宽，这样会影响检测灵敏度且会增加扫描时间，应根据检测样品选择合适的扫描宽度；频率与衰减器值为自动给出；ESR信号强度与功率有关，低温下样品容易饱和，为保证样品不受损坏，因此，所选功率不易过大；接收增益的选择以获得大小合适、清晰可见的波谱即可；ESR波谱仪共7个调制频率，最高为100kHz，此时呈现的超精细分裂清楚，图谱形状较佳，因为，调制频率设定为100kHz；调制幅度的选择直接影响ESR信号的幅值和形状，且调制幅度的选择要与样品的线宽相吻合，当大于1.00G时，不仅引起ESR信号的幅度下降，而且过零点(共振位置)向左(反磁场扫描)的方向移动，选择比较小的调制幅度可以精确地测定样品的谱形，实现高分辨率的检测，而增大调制幅度可实现高灵敏度的检测，但又要考虑到失真允许的限度，因此，调制幅度设定为1.00G；相位调变设定为0.00deg，输出信号的幅度最大；偏移量为固定值0.00％；时间常数的选择与接收增益有关，当接收增益增加10倍时，时间常数应增加100倍；转换时间根据实验需要可进行相应调整，对于海参样品的检测时间常数在4000.00-6000.00msec、转换时间在300.00-400.00msec较合适。
以下实施例中所用试剂、仪器的规格型号及生产厂家如下：
试剂：磷酸氢二钠，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；磷酸二氢钠，分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；α-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮(POBN)，色谱纯，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。
注：磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠与磷酸二氢钠按一定比例配制)
仪器：ESR检测仪，A200型，布鲁克拜厄斯宾有限公司；干浴器，HEATER 2型，德国IKA公司；数显恒温水浴锅，HH-4型，常州智博瑞仪器制造有限公司；电子分析天平，AB2004-N型，梅特勒-托利多仪器有限公司；冰箱，BD-B2型，海尔集团电冰箱厂；冷冻离心机，Sorvall Legend Micro 17R型，Thermo Scientific。
实施例1
(1)原料处理：将新鲜的海参宰杀去脏、去筋，按1:5的比例加入pH 6.0的磷酸盐缓冲液(50mM)，在冰浴条件下匀浆，匀浆后获得的匀浆液直接用于热处理。
(2)与捕获剂的混合：将自由基捕获剂POBN加入海参匀浆液中，使POBN的终浓度为30mM，二者混合均匀。
(3)热加工处理：将混合后的样品在95℃条件下加热4h。
(4)ESR检测：热处理后的样品立即放入冰浴中，在10000rpm，4℃的条件下离心10min。然后放回冰浴，用毛细管吸取上清液进行ESR检测。ESR检测时的扫描条件为：
中心磁场：3505G；扫描宽度：50G；频率：9.85GHz；衰减器：20.00dB；功率：2.05mW；接收增益：1.00×105；调制频率：100kHz；调制幅度：1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；时间常数：5242.88msec；转换时间：360.00msec。
测得的ESR图谱如图1所示，用第一组峰的两个峰振幅的平均值来代表捕获到的自由基的ESR信号强度，为49318。即采用该方法测定海参在95℃加热4h过程中产生的自由基ESR信号强度为49318。
实施例2
(1)原料处理：将新鲜的海参宰杀去脏、去筋，按1:10的比例加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液(50mM)，在冰浴条件下匀浆，匀浆后获得的匀浆液-30℃暂存。
(2)与捕获剂的混合：海参匀浆液4℃解冻后，将自由基捕获剂POBN加入海参匀浆液中，使POBN的终浓度为40mM，二者混合均匀。
(3)热加工处理：将混合后的样品分装成5份，分别在115℃条件下加热0,1h,2h,3h,4h,5h。
(4)ESR检测：热处理后的样品立即放入冰浴中，在12000rpm，2℃的条件下离心15min。然后放回冰浴，用毛细管吸取上清液进行ESR检测。ESR检测时的扫描条件为：
中心磁场：3505G；扫描宽度：50G；频率：9.85GHz；衰减器：20.00dB；功率：1.93mW；接收增益：1.00×105；调制频率：100kHz；调制幅度：1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；时间常数：4800.00msec；转换时间：360.00msec。
可得到一系列的ESR图谱如图2所示，用第一组峰的两个峰振幅的平均值来代表捕获到的自由基的ESR信号强度，采用该方法测定海参在115℃加热不同时间产生的自由基ESR信号强度变化如图2，海参在115℃随时间变化的趋势如图3。
实施例3
(1)原料处理：将新鲜的海参宰杀去脏、去筋，按1:3的比例加入pH 5.5的磷酸盐缓冲液(50mM)，在冰浴条件下匀浆，匀浆后获得的匀浆液直接用于热处理。
(2)与捕获剂的混合：将自由基捕获剂POBN加入海参匀浆液中，使POBN的终浓度为50mM，二者混合均匀。
(3)热加工处理：将混合后的样品模拟杀菌条件在121℃处理15min。
(4)ESR检测：热处理后的样品立即放入冰浴中，在13000rpm，4℃的条件下离心20min。然后放回冰浴，用毛细管吸取上清液进行ESR检测。ESR检测时的扫描条件为：
中心磁场：3505G；扫描宽度：50G；频率：9.85GHz；衰减器：20.00dB；功率：2.00mW；接收增益：1.00×106；调制频率：100kHz；调制幅度：1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；时间常数：5000.00msec；转换时间：400.00msec。
测得的ESR图谱如图4所示，用第一组峰的两个峰振幅的平均值来代表捕获到的自由基的ESR信号强度，为648345。即采用该方法测定海参杀菌条件121℃处理15min产生的自由基ESR信号强度为648345。
实施例4
(1)原料处理：将新鲜的海参宰杀去脏、去筋，按1:4的比例加入pH 8.0的磷酸盐缓冲液(50mM)，在冰浴条件下匀浆，匀浆后获得的匀浆液直接用于热处理。
(2)与捕获剂的混合：将自由基捕获剂POBN加入海参匀浆液中，使POBN的终浓度为20mM，二者混合均匀。
(3)热加工处理：将混合后的样品在75℃条件下加热5h。
(4)ESR检测：热处理后的样品立即放入冰浴中，在8000rpm，8℃的条件下离心5min。然后放回冰浴，用毛细管吸取上清液进行ESR检测。ESR检测时的扫描条件为：
中心磁场：3510G；扫描宽度：70G；频率：9.85GHz；衰减器：20.00dB；功率：2.05mW；接收增益：1.00×105；调制频率：100kHz；调制幅度：1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；时间常数：5242.88msec；转换时间：360.00msec。
测得的ESR图谱用第一组峰的两个峰振幅的平均值来代表捕获到的自由基的ESR信号强度为19952。即采用该方法测定海参在75℃条件下加热5h过程中产生的自由基ESR信号强度为19952。
实施例5
(1)原料处理：将新鲜的海参宰杀去脏、去筋，按1:7的比例加入pH 7.0的磷酸盐缓冲液(50mM)，在冰浴条件下匀浆，匀浆后获得的匀浆液直接用于热处理。
(2)与捕获剂的混合：将自由基捕获剂POBN加入海参匀浆液中，使POBN的终浓度为60mM，二者混合均匀。
(3)热加工处理：将混合后的样品模拟杀菌条件在90℃处理4h。
(4)ESR检测：热处理后的样品立即放入冰浴中，在9000rpm，10℃的条件下离心18min。然后放回冰浴，用毛细管吸取上清液进行ESR检测。ESR检测时的扫描条件为：
中心磁场：3500G；扫描宽度：80G；频率：9.85GHz；衰减器：20.00dB；功率：2.00mW；接收增益：1.00×106；调制频率：100kHz；调制幅度：1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；时间常数：5000.00msec；转换时间：400.00msec。
测得的ESR图谱用第一组峰的两个峰振幅的平均值来代表捕获到的自由基的ESR信号强度为219769。即采用该方法测定海参杀菌条件85℃处理10min产生的自由基ESR信号强度为219769。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，包括以下步骤：
步骤1，将自由基捕获剂α-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮加入到待检测的海参试样，使自由基捕获剂的浓度为20-60mM；
步骤2，将步骤1获得的混合样品进行热加工处理；
步骤3，热处理后的样品立即放入冰浴中保存，检测时对样品进行离心，用毛细管吸取上清液进行电子自旋共振检测；电子自旋共振检测的扫描条件为：中心磁场：3490-3510G；扫描宽度：50-100G；频率：9.85GHz；衰减器：20.00dB；功率：1.50-2.50mW；接收增益：1.00×105-1.00×106；调制频率：100kHz；调制幅度：1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；时间常数：4000.00-6000.00msec；转换时间：300.00-400.00msec。
2.根据权利要求1所述的基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，其特征在于，在步骤1之前还包括海参试样预处理，将新鲜的海参宰杀去脏、去筋，按1:3-1:10的重量配比加入pH5.5-8.0的磷酸盐缓冲液，在冰浴条件下匀浆获得海参试样。
3.根据权利要求1所述的基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，其特征在于，步骤2中的热处理的条件为，75-121℃温度下加热时间10min-5h。
4.根据权利要求3所述的基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，其特征在于，步骤2中的热处理的条件为，90-100℃温度下加热时间2-4h。
5.根据权利要求1所述的基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，其特征在于，步骤3中的离心处理的条件为，在8000-13000rpm转速，4-10℃的温度条件下离心5-20min。
6.根据权利要求5所述的基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，其特征在于，步骤3中的离心处理的条件为，在6-8℃的温度条件下离心10-16min。
7.一种基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，海参试样预处理，将新鲜的海参宰杀去脏、去筋，按1:3-1:10的重量配比加入pH5.5-8.0的磷酸盐缓冲液，在冰浴条件下匀浆获得海参试样；
步骤2，将自由基捕获剂α-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮加入到待检测的海参试样，使自由基捕获剂的浓度为20-60mM；
步骤3，将步骤2获得的混合样品进行热加工处理；条件为75-121℃温度下加热时间10min-5h；
步骤4，热处理后的样品立即放入冰浴中保存，检测时对样品在4-10℃的温度条件下离心5-20min，用毛细管吸取上清液进行电子自旋共振检测；电子自旋共振检测的扫描条件为：中心磁场：3490-3510G；扫描宽度：50-100G；频率：9.85GHz；衰减器：20.00dB；功率：1.50-2.50mW；接收增益：1.00×105-1.00×106；调制频率：100kHz；调制幅度：1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；时间常数：4000.00-6000.00msec；转换时间：300.00-400.00msec。
8.根据权利要求7所述的基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，其特征在于，步骤3中的热处理的条件为，90-100℃温度下加热时间2-4h。
9.根据权利要求7所述的基于电子自旋共振波谱技术检测海参加工过程中品质变化的方法，其特征在于，步骤4中的离心处理的条件为，在6-8℃的温度条件下离心10-16min。
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