CN108535306A - 一种检测海藻多酚对饼干脂质氧化抑制效果的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测海藻多酚对饼干脂质氧化抑制效果的方法，包括以下步骤：制备饼干样品：将海藻多酚添加到饼干中，制备饼干样品；提取脂质：提取饼干样品中的脂质；添加捕获剂：往脂质中加入自由基捕获剂POBN，混合均匀，获得混合样品；ESR检测：将混合样品密封后放入密闭容器中加速老化，再离心，用毛细管吸取上清液进行ESR检测，扫描时间为55‑65s。本发明采用海藻多酚这种天然抗氧化剂抑制饼干脂质的氧化，并且为饼干品质检测提供了一个快速、灵敏、方便、准确的方法。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体地，涉及一种采用ESR技术检测海藻多酚对饼干脂质氧化抑制效果的方法。
背景技术
饼干中含有大量的脂肪，影响高脂产品的生理和感官特性以及营养特性，其中，特别重要的是一种重要的营养物质--多不饱和脂肪酸，其容易发生氧化反应，会降低饼干的质量和功能特性、减少保质期。检测脂质的氧化程度常用化学方法来进行，如采用硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化的终产物之一--丙二醛的含量来评价脂质的过氧化程度。但化学方法存在灵敏度和精确度不高的问题，同时像脂质过氧化其终产物比较复杂，除了丙二醛以外还有其他的醛类产物，会干扰测定结果。
现有技术中，合成抗氧化剂丁基羟基苯甲醚(BHA)是一种性能优良的抗氧化剂，常用于饼干等食品中，但其毒性较高，用量高时对人体有害。
裙带菜孢子叶提取物，也就是海藻多酚，是一种安全无毒、具有独特生物活性的天然化学产物，除了抗氧化活性，也有抗病毒、抗炎、抗癌、抗菌活性，从海藻分泌出的多酚类物质对微生物具有广谱抗性(包括丝状真菌、酵母菌、细菌、病毒等的抑制)，并且在相应的抑制浓度下不影响动物体细胞的生长。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种采用ESR技术检测海藻多酚对饼干脂质氧化抑制效果的方法，用海藻多酚抑制饼干脂质的氧化，并采用ESR技术检测抑制效果。
本发明提供的检测海藻多酚对饼干脂质氧化抑制效果的方法包括以下步骤：
制备饼干样品：将海藻多酚添加到饼干中，制备饼干样品；
提取脂质：提取所述饼干样品中的脂质；
添加捕获剂：往所述脂质中加入自由基捕获剂POBN，混合均匀，获得混合样品；
ESR检测：将所述混合样品密封后放入密闭容器中加速老化，再离心，用毛细管吸取上清液进行ESR检测，扫描时间为55-65s；
ESR检测时的扫描条件为：
中心磁场：3474-3510G，扫描宽度50-100G，频率：8.00-10.00GHz，衰减器：10.00-30.00dB，微波功率1.50-2.50mW，接收增益：1.00×105-1.00×106，调制频率：100kHz，调制幅度1.00G，相位调变：0.00deg，偏移量：0.00％，转换时间：300.00-400.00msec，时间常数：40000.00msc-6000.00msec。
在本发明的一些实施例中，所述海藻多酚与所述饼干的质量比为0.05-0.25：100。
在本发明的一些实施例中，提取脂质步骤包括：
将所述饼干样品破碎匀浆，加入氯仿和甲醇混合溶液，获得混合浆液；
将所述混合浆液离心，收集溶液；
往所述溶液中加入质量百分数为0.5-0.9％的NaCl溶液进行清洗，涡旋后再离心，得到两相溶液，收集下层溶液；
将所述下层溶液用真空旋转蒸发仪旋干，获得所述脂质。
在本发明的一些实施例中，按照1g所述饼干样品加入15-20ml溶剂的比例加入所述氯仿和甲醇混合溶液；所述氯仿和甲醇混合溶液中氯仿与甲醇的质量比为2-4:1。
在本发明的一些实施例中，所述混合浆液离心的转速为1500-2000r/min，时间为5-10min；涡旋后再离心的转速为1500-2000r/min，时间为10-15min。
在本发明的一些实施例中，所述溶液与所述NaCl溶液的体积比为1:0.2-0.4。
在本发明的一些实施例中，添加捕获剂步骤中，所述混合样品中POBN的浓度为20-60mM。
在本发明的一些实施例中，ESR检测步骤中，加速老化的温度为60-70℃，时间为4-24h。
在本发明的一些实施例中，ESR检测步骤中，离心的转速为
8000-13000rpm/min，时间为5-20min。
在本发明的一些实施例中，ESR检测步骤中，用毛细管吸取的上清液的体积为40-60μl。
本发明提供的检测方法基于ESR技术，能快速、准确的检测出饼干脂质氧化中自由基的变化，从而反映出饼干的品质变化，为饼干品质检测提供了一个快速、灵敏、方便、准确的方法，对饼干的品质控制和抗氧化剂选择具有重要意义。
此外，本发明采用海藻多酚这种天然抗氧化剂抑制饼干脂质的氧化，提高了饼干的品质。
本发明为饼干加工和贮存提供了理论参考，为通过控制加工工艺参数提高饼干的品质提供了可能性。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1的ESR图谱。
图2为本发明实施例2的ESR图谱。
图3为本发明实施例3的ESR图谱。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
电子自旋共振(electron spin resonance，ESR)技术是检测自由基最直接最有效的方法，是自由基生物学和医学不可缺少的重要研究技术。本发明通过ESR技术研究不同浓度的海藻多酚对饼干脂质氧化中的自由基影响，进而可为监测饼干品质变化和海藻多酚在抗氧化剂领域的应用提供参考。
本发明提供的检测海藻多酚对饼干脂质氧化抑制效果的方法，包括制备饼干样品、提取脂质、添加捕获剂和ESR检测等步骤，快速、灵敏、方便、准确。
制备饼干样品：将海藻多酚添加到饼干中，制备饼干样品。
本发明采用海藻多酚作为抗氧剂，抑制饼干脂质的氧化作用。体外实验表明，多酚含量为0.063-0.25g/100g的褐藻有明显的抗氧化能力。因此在本发明优选的实施例中，海藻多酚与饼干的质量比为0.05-0.25：100。
提取脂质：提取饼干样品中的脂质。
在本发明优选的实施例中，提取脂质步骤包括：将饼干样品破碎匀浆，加入氯仿和甲醇混合溶液，获得混合浆液；将混合浆液离心，收集溶液；往溶液中加入的NaCl溶液进行清洗，涡旋后再离心，得到两相溶液，收集下层溶液；将下层溶液用真空旋转蒸发仪旋干，获得脂质。
其中，为了能更彻底的提取饼干中的脂质，更优选地，按照1g饼干样品加入15-20ml溶剂的比例加入氯仿和甲醇混合溶液。优选地，为保证油脂充分被提取，氯仿和甲醇混合溶液中氯仿与甲醇的质量比为2-4:1。
上述提取脂质步骤中，离心时的转速不能太低，时间不能过短，以防不能得到纯净的脂质。在本发明优选的实施例中，混合浆液离心的转速为1500-2000r/min，时间为5-10min；涡旋后再离心的转速为1500-2000r/min，时间为10-15min。
混合浆液初次离心除杂后，采用质量百分数为0.5％-0.9％的NaCl溶液清洗获得的溶液，在本发明优选的实施例中，溶液与NaCl溶液的体积比为1:0.2-0.4。
涡旋后再离心，得到的两相溶液，上层溶液是样品残留物，下层溶液即含脂质溶液，收集下层溶液。
添加捕获剂：往脂质中加入自由基捕获剂POBN(α-[4-吡啶基-1-氧]-N-叔丁基氮酮)，混合均匀，获得混合样品。选用POBN捕获剂是由于它是一种常用的鉴定脂质衍生碳中心自由基的自旋捕获剂。
在本发明优选的实施例中，混合样品中POBN的浓度为20-60mM，能完全捕获脂质自由基。
ESR检测：将混合样品密封后放入密闭容器中加速老化，再离心，用毛细管吸取上清液进行ESR检测，扫描时间为55-65s。
其中，ESR检测时的扫描条件为：
中心磁场：3474-3510G，扫描宽度50-100G，频率：8.00-10.00GHz，衰减器：10.00-30.00dB，微波功率1.50-2.50mW，接收增益：1.00×105-1.00×106，调制频率：100kHz，调制幅度1.00G，相位调变：0.00deg，偏移量：0.00％，转换时间：300.00-400.00msec，时间常数：40000.00msc-6000.00msec。
在本发明优选的实施例中，加速老化的温度为60-70℃，时间为4-24h。加速老化温度过高，生成的自由基的量越大，自由基生成量开始增加的时间越短。热处理的时间较长，产生的自由基很可能已经发生淬灭，难于捕获。
在本发明优选的实施例中，ESR检测步骤中，为更加好去除油脂中杂质干扰，离心的转速为8000-13000rpm/min，时间为5-20min。
在本发明优选的实施例中，ESR检测步骤中，为更好的适应谐振腔的深度，测量更准确，用毛细管吸取的上清液的体积为40-60μl。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明。下述实施例中所取工艺条件数值均为示例性的，其可取数值范围如前述发明内容中所示，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。下述实施例所用的检测方法均为本行业常规的检测方法。
实施例1
(1)制备曲奇饼干样品：往曲奇饼干中添加0.15％的海藻多酚；为了更好的看出天然抗氧化剂海藻多酚抗氧化性，添加相同量的合成抗氧化剂BHA到另一组曲奇饼干中做阳性对照组，证明这种无毒无害的海藻多酚的天然抗氧化性；将不加提取物的曲奇饼干作为空白组进行比较。
(2)提取曲奇饼干脂质：曲奇饼干样品称重1.43g，搅碎匀浆后，加入氯仿和甲醇(质量比为2:1)混合溶液28.6ml，混匀15min后，1500r/min离心5min收集溶液。往溶液中加入5.72ml体积的0.9％NaCl溶液清洗，涡旋后以2000r/min离心10min，得到两相液面并吸取上清液。将收集的下层液用真空旋转蒸发仪旋干，得到曲奇饼干脂质0.25g。
(3)添加捕获剂：往得到的饼干脂质中加入自由基捕获剂POBN，二者混合均匀，获得混合样品，保证混合样品中POBN的终浓度为40mM。
(4)ESR检测：将混合后的脂质样品密封后放在65℃的水浴锅中加速老化6h后，再在8000rpm/min，室温条件下离心15min，用毛细管吸取上清液50μl进行ESR检测，扫描时间为64s。
ESR检测时的扫描条件为：
中心磁场：3475G；扫描宽度50G；频率：9.69GHz；衰减器：20.00dB；微波功率2.00mW；接收增益：1.00×106；调制频率：100kHz；调制幅度1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；转换时间：400.00msec；时间常数：6000.00msec。
测得的ESR图谱如图1所示，其中，A为添加0.15％的海藻多酚的样品的ESR图谱，B为合成抗氧化剂BHA的ESR图谱，C为空白样品的ESR图谱。
相比于空白样品，0.15％添加量的海藻多酚改善了曲奇饼干体系的抗氧化特性。对比A和B图谱可知，A图谱的波峰振幅比B图谱小，即海藻多酚的天然抗氧化性强于合成抗氧化剂BHA的抗氧化性，且抑制脂质氧化效果更好，有益于改善人体的健康。
用A图谱中的第一组峰的两个峰振幅的平均值来代表捕获到的自由基的ESR信号强度，为6953.87，即采用该方法测得海藻多酚对曲奇饼干脂质氧化抑制率为64.37％。
实施例2
(1)制备苏打饼干样品：往苏打饼干中添加0.2％的海藻多酚；为了更好的看出天然抗氧化剂海藻多酚抗氧化性，添加相同量的合成抗氧化剂BHA到另一组曲奇饼干中做阳性对照组，证明这种无毒无害的海藻多酚的天然抗氧化性；将不加提取物的苏打饼干作为空白组进行比较。(2)提取苏打饼干脂质：苏打饼干样品称重2.3g，搅碎匀浆后，加入氯仿和甲醇(质量比为4:1)混合溶液34.5ml，混匀20min后，2000r/min离心10min收集溶液。往溶液中加入9.2ml体积的0.5％NaCl溶液清洗，涡旋后以2000r/min离心10min，得到两相液面并吸取上清液。将收集的下层液用真空旋转蒸发仪旋干，得到苏打饼干脂质0.4g。
(3)添加捕获剂：往得到的饼干脂质中加入自由基捕获剂POBN，二者混合均匀，获得混合样品，保证混合样品中POBN的终浓度为50mM。
(4)ESR检测：将混合后的脂质样品密封后放在60℃的水浴锅中加速老化7h后，再在9000rpm/min，室温条件下离心20min，用毛细管吸取上清液50μl进行ESR检测，扫描时间为65s。
ESR检测时的扫描条件为：
中心磁场：3495G；扫描宽度50G；频率：9.69GHz；衰减器：20.00dB；微波功率2.00mW；接收增益：1.00×106；调制频率：100kHz；调制幅度1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；转换时间：400.00msec；时间常数：6000.00msec。
测得的ESR图谱如图2所示，其中，D为添加0.2％的海藻多酚的样品的ESR图谱，E为合成抗氧化剂BHA的ESR图谱，F为空白样品的ESR图谱。
相比于空白样品，海藻多酚改善了苏打饼干体系的抗氧化特性；对比D和E图谱可知，海藻多酚的天然抗氧化性强于合成抗氧化剂BHA的抗氧化性且抑制脂质氧化效果更好，有益于改善人体的健康。
用D图谱的第一组峰的两个峰振幅的平均值来代表捕获到的自由基的ESR信号强度，为6554.76，即采用该方法测得海藻多酚对苏打饼干脂质氧化抑制率为70.56％。
实施例3
(1)制备巧克力饼干样品：往巧克力饼干中添加0.25％的海藻多酚；为了更好的看出海藻多酚的抗氧化性，将不加提取物的巧克力饼干作为空白组进行比较。
(2)提取巧克力饼干脂质：巧克力饼干样品称重1.6g，搅碎匀浆后，加入氯仿和甲醇(质量比为3:1)混合溶液32ml，混匀15min后，2000r/min离心5min收集溶液。往溶液中加入6.4ml体积的0.9％NaCl溶液清洗，涡旋后以1500r/min离心15min，得到两相液面并吸取上清液。将收集的下层液用真空旋转蒸发仪旋干，得到巧克力饼干脂质0.6g。
(3)添加捕获剂：往得到的饼干脂质中加入自由基捕获剂POBN，二者混合均匀，获得混合样品，保证混合样品中POBN的终浓度为60mM。
(4)ESR检测：将混合后的脂质样品密封后放在70℃的水浴锅中加速老化8h后，再在10000rpm/min，室温条件下离心10min，用毛细管吸取上清液50μl进行ESR检测，扫描时间为65s。
ESR检测时的扫描条件为：
中心磁场：3500G；扫描宽度50G；频率：9.69GHz；衰减器：20.00dB；微波功率2.00mW；接收增益：1.00×106；调制频率：100kHz；调制幅度1.00G；相位调变：0.00deg；偏移量：0.00％；转换时间：400.00msec；时间常数：6000.00msec。
测得的ESR图谱如图3所示，其中，G为添加0.25％的海藻多酚的样品的ESR图谱，H为空白样品的ESR图谱。
相比于空白组，0.15％海藻多酚的添加增强了巧克力饼干的抗氧化活性，降低了样品的脂质氧化速率。
用G图谱的第一组峰的两个峰振幅的平均值来代表捕获到的自由基的ESR信号强度，为5998.23，即采用该方法测得海藻多酚对巧克力饼干脂质氧化抑制率为75.34％。
从上述实施例可知，相比于空白组，海藻多酚对饼干脂质自由基形成起到了抑制作用。而且，采用ESR技术对海藻多酚进行抗氧化实验，与商业抗氧化剂(BHA)相比，海藻多酚具有更好的抗氧化活性，且海藻多酚更安全、健康。并且，从上述实施例还可看出，采用ESR技术能快速、准确的检测出饼干脂质氧化抑制率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种检测海藻多酚对饼干脂质氧化抑制效果的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备饼干样品：将海藻多酚添加到饼干中，制备饼干样品；
提取脂质：提取所述饼干样品中的脂质；
添加捕获剂：往所述脂质中加入自由基捕获剂POBN，混合均匀，获得混合样品；
ESR检测：将所述混合样品密封后放入密闭容器中加速老化，再离心，用毛细管吸取上清液进行ESR检测，扫描时间为55-65s；
ESR检测时的扫描条件为：
中心磁场：3474-3510G，扫描宽度50-100G，频率：8.00-10.00GHz，衰减器：10.00-30.00dB，微波功率1.50-2.50mW，接收增益：1.00×105-1.00×106，调制频率：100kHz，调制幅度1.00G，相位调变：0.00deg，偏移量：0.00％，转换时间：300.00-400.00msec，时间常数：40000.00msc-6000.00msec。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述海藻多酚与所述饼干的质量比为0.05-0.25：100。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取脂质步骤包括：
将所述饼干样品破碎匀浆，加入氯仿和甲醇混合溶液，获得混合浆液；
将所述混合浆液离心，收集溶液；
往所述溶液中加入质量百分数为0.5-0.9％的NaCl溶液进行清洗，涡旋后再离心，得到两相溶液，收集下层溶液；
将所述下层溶液用真空旋转蒸发仪旋干，获得所述脂质。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，按照1g所述饼干样品加入15-20ml溶剂的比例加入所述氯仿和甲醇混合溶液；所述氯仿和甲醇混合溶液中氯仿与甲醇的质量比为2-4:1。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述混合浆液离心的转速为1500-2000r/min，时间为5-10min；涡旋后再离心的转速为1500-2000r/min，时间为10-15min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶液与所述NaCl溶液的体积比为1:0.2-0.4。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，添加捕获剂步骤中，所述混合样品中POBN的浓度为20-60mM。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，ESR检测步骤中，加速老化的温度为60-70℃，时间为4-24h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，ESR检测步骤中，离心的转速为8000-13000rpm/min，时间为5-20min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，ESR检测步骤中，用毛细管吸取的上清液的体积为40-60μl。
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