CN106377535A - 一种人参皂苷组合物及其制备方法、应用 - Google Patents
一种人参皂苷组合物及其制备方法、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物领域，特别涉及一种人参皂苷组合物及其制备方法、应用。该人参皂苷组合物，由人参稀有皂苷Rh4、Rk3、Rk1、Rg5组成。本发明对人参蒸制过程中活性成分的变化进行系统研究，运用响应面设计试验优化人参炮制工艺，意外发现对于原药材人参皂苷类成分变化最为明显的炮制方法，尤其是意外发现高效获取稀有人参皂苷类成分的炮制方法。通过后期药理活性的筛选，发明人还意外发现，富含稀有皂苷的人参炮制产品具有显著地补肾阳功效。
Description
本申请要求于2016年06月24日提交中国专利局、申请号为201610485809.7、发明名称为“一种人参皂苷组合物及其制备方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及药物领域，特别涉及一种人参皂苷组合物及其制备方法、应用。
背景技术
人参为五加科植物人参(Panax ginseng C.A.Mey.)的干燥根和根茎，性温味甘，具有大补元气、补脾益肺、生津养血之功效。现代研究表明，人参在提高机体免疫力、改善心肌缺血等方面具有明显的作用。
人参的炮制历史源于汉代，红参是人参的最常见炮制品，由鲜人参经过筛选、晾晒、清洗、蒸制加工、烘干等炮制工艺制成。人参皂苷是人参及其各种炮制品中最主要的有效活性成分。
人参在蒸制加工过程中，随着蒸制时间、蒸制温度和蒸制次数的改变，人参皂苷种类和含量均会发生变化。而这种变化是不确定的，即蒸制参数的变化会导致皂苷种类和含量发生怎样的改变，是完全无法准确预期。
因此，提供一种人参皂苷组合物及其制备方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种人参皂苷组合物及其制备方法、应用。本发明的目的是实现人参皂苷的有效提取，解决现有工艺技术中稀有人参皂苷难以获取的缺陷，提供一种高效、稳定、附加值高的提取工艺。同时，本发明还提供一种具有显著补肾阳功效的产品。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种人参皂苷组合物，由人参稀有皂苷Rh4、Rk3、Rk1、Rg5组成。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的人参皂苷组合物还包括人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的人参皂苷组合物还包括人参皂苷Rg1、Re。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的人参皂苷组合物中，所述人参稀有皂苷Rh4、Rk3、Rk1、Rg5的总含量大于42.55mg/g；所述人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd的总含量小于10mg/g；所述人参皂苷Rg1、Re的总含量小于0.35mg/g。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的人参皂苷组合物的制备方法为：取人参经90℃～130℃蒸制1h～10h，所述蒸制的次数至少为5次。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的人参皂苷组合物的制备方法中，所述蒸制的温度为100℃～120℃，优选110℃。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的人参皂苷组合物的制备方法中，所述蒸制的次数为1～9次，优选1次、5次或9次。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的人参皂苷组合物的制备方法中，所述蒸制的时间为2h～6h，优选4h。
进一步的，本发明提供的人参皂苷组合物的制备方法为：将蒸制后的人参打粉过100目筛；或将蒸制好的人参切片，进行水提或者乙醇提取，得到提取物。
在本发明的一些具体实施方案中，75％醇提两次，每次4小时，抽滤后药渣用200ml热回流法水提1次，醇提液减压蒸干，与水提液混合。根据原给药剂量换算水提液给药剂量。之后浓缩水提液至给药浓度。
本发明还提供了所述的人参皂苷组合物在制备提高胸腺指数或脾指数，增强血浆SOD活力和/或提高血浆内cAMP/cGMP值的药物和/或保健品中的用途。
本发明还提供了所述的人参皂苷组合物在制备治疗肾阳虚的药物和/或保健品中的用途。
在本发明的一些具体实施方案中，当给药对象为非人的动物时，所述药物的给药剂量为0.2g/kg-2g/kg，当给药对象为人时，所述药物的人体等效剂量为0.02g/kg/d-0.2g/kg/d。
本发明提供了所述的人参皂苷组合物的制备方法，取人参经90℃～130℃蒸制1h～10h，所述蒸制的次数至少为5次。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的制备方法中，所述蒸制的温度为100℃～120℃，优选110℃。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的制备方法中，所述蒸制的次数为1～9次，优选1次、5次或9次。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的制备方法中，所述蒸制的时间为2h～6h，优选4h。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的人参皂苷组合物有如下制备方法制得：取人参经120℃蒸制4h，再重复蒸制5次，制得人参皂苷组合物。
在本发明的另一些具体实施方案中，本发明提供的人参皂苷组合物有如下制备方法制得：取人参经120℃蒸制4h，再重复蒸制5次；再经打粉过100目筛得细粉，将细粉75％醇提两次，每次4小时，抽滤后药渣用200ml热回流法水提1次，醇提液减压蒸干，与水提液混合。
本发明对人参蒸制过程中活性成分的变化进行系统研究，运用响应面设计试验优化人参炮制工艺，意外发现对于原药材人参皂苷类成分变化最为明显的炮制方法，尤其是意外发现高效获取稀有人参皂苷类成分的炮制方法。
试验结果表明，保持炮制次数不变，相同炮制时间时，从100℃升至120℃，人参总皂苷含量升高。保持炮制时间不变，相同炮制次数时，从100℃升至120℃，人参总皂苷含量升高。结果表明，温度为三者中最为主要的影响因素，炮制次数和炮制时间对人参皂苷的含量有交互影响作用。
人参在蒸制过程中，人参皂苷的种类因炮制温度、时间和次数的不同而不同。极性大的人参皂苷Rg1、Re随着炮制温度的升高，炮制次数的增多，炮制时间的延长，人参皂苷Rg1、Re含量逐渐减少以致消失。中等极性皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd较为稳定。而稀有人参皂苷RK3、Rh4、Rk1、Rg5受炮制工艺的影响最大，含量变化明显。结果显示，在120℃，4h，5次的炮制工艺下，稀有人参皂苷含量变化率最大；蒸制次数越多，稀有皂苷含量变化越明显，同时也验证了九蒸九制的合理性。
通过后期药理活性的筛选，发明人还意外发现，富含稀有皂苷的人参炮制产品具有显著地补肾阳功效。
实验结果表明，胸腺指数和脾指数R3组最好；cAMP/cGMP，给药组与造模组之间P<0.01。显示R3水提液的确有一定功效；SOD结果显示阳性药组R3组均能提高机体抗氧化能力；综上所述，人参炮制品R3有效的提高了肾阳虚模型小鼠的体温、胸腺指数、脾指数，且其SOD活力较造模组明显增强，血浆内cAMP/cGMP值也显著提高。提示人参炮制品R3对肾阳虚小鼠的机体功能有改善作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示炮制时间和次数的交互因素对人参皂苷Rb1的响应曲面图；
图2示炮制时间和次数的交互因素对人参皂苷Rb1的响应曲面图；
图3示炮制时间和次数的交互因素对人参皂苷Rb1的响应曲面图；
图4示不同极性的人参皂苷含量变化对比图；
图5示人参皂苷裂解过程示意图；
图6示小鼠胸腺指数比较图；
图7示小鼠脾脏指数比较图；
图8示小鼠血浆总SOD值图；
图9示小鼠体温比较图；
图10示四组小鼠造模第十天体温比较图；
图11示四组小鼠胸腺指数比较图；
图12示四组小鼠脾脏指数比较图；
图13示小鼠血浆cAMP/cGMP值图；
图14示小鼠血浆SOD活力测定图；
图15示小鼠血浆睾酮含量图；
图中，C为对照组、M为模型组、G为生晒参组、R1为实施例1制备的炮制品组、R2为实施例2制备的炮制品组、R3为实施例3制备的炮制品组、R6为实施例6制备的炮制品组、×为阳性药组。
具体实施方式
本发明公开了一种人参皂苷组合物及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
中药领域已知，人参在蒸制加工过程中，随着蒸制时间和蒸制温度和蒸制次数的改变，人参皂苷种类和含量均会发生变化。为此，本发明在尝试优化了人参炮制工艺的过程中，确定了相对于原药材人参皂苷类成分变化最为明显的炮制方法。本发明在此基础上，通过HPLC-MS和HPLC-UV对20种不同的炮制样品中人参皂苷含量的变化进行了分析。结果显示，三种人参皂苷含量和种类变化最明显的炮制方法分别是：①100℃，2h，1次；②100℃，6h，1次；③120℃，4h，5次。这三种方法中皂苷类成分的种类及含量各不相同。
同时，本发明还意外发现，采用高频次蒸制得到的人参的稀有皂苷含量增加，尤其是人参皂苷RK3、Rh4、Rk1和Rg5的含量有明显提高，该蒸制品能显著改善肾阳虚相关疾病。
因此，本发明第一方面提供了一种治疗肾阳虚的人参皂苷组合物，其中包含的主要活性成分为人参稀有皂苷。
本发明第一方面提供了一种治疗肾阳虚的人参皂苷组合物，所述人参稀有皂苷包括人参皂苷Rh4、Rk3、Rk1、Rg5。
本发明第一方面提供了一种治疗肾阳虚的人参皂苷组合物，还包含少量的人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd。
本发明第一方面提供了一种治疗肾阳虚的人参皂苷组合物，还可以包含少量的人参皂苷Rg1、Re。
本发明第一方面提供了一种治疗肾阳虚的人参皂苷组合物，其中包含的人参稀有皂苷Rh4、Rk3、Rk1、Rg5，以及人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd，任选还包含人参皂苷Rg1、Re。
本发明第一方面提供了一种治疗肾阳虚的人参皂苷组合物，其中包含的人参稀有皂苷Rh4、Rk3、Rk1、Rg5，其总含量大于42.55mg/g，以及人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd，其总含量小于10mg/g，人参皂苷Rg1、Re总含量小于0.35mg/g。
本发明第一方面提供了一种治疗肾阳虚的人参皂苷组合物，其中包含的人参稀有皂苷Rh4、Rk3、Rk1、Rg5，其总含量为42.55-129.8mg/g，以及人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd，其总含量为1-10mg/g，人参皂苷Rg1、Re总含量为0-0.35mg/g。
本发明第二方面提供了人参蒸制品，炮制温度为90℃-130℃，炮制时间为1h-10h，其通过高频次炮制，优选炮制至少5次。
根据本发明第二方面的人参蒸制品，其中炮制温度为100℃-120℃，优选100℃，优选110℃，优选120℃。
根据本发明第二方面的人参蒸制品，其中炮制时间为2h-6h，优选2h，优选4h，优选6h。
根据本发明第二方面的人参蒸制品，其中炮制至少5次，优选5次，优选9次。
根据本发明第二方面的人参蒸制品，炮制温度为90℃-130℃，炮制时间为1h-10h，其特征在于：炮制至少5次，优选5次，优选9次。
本发明第三方面提供了制备人参蒸制品的方法，其按照第一方面提供的炮制条件制备。
本发明第四方面提供了利用人参蒸制品在制备治疗肾阳虚药物中的用途，其中人参蒸制品如第一方面所述。
下面对本发明作进一步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中所引用的文献，它们的全部内容通过引用并入本文。
在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。
本发明提供的人参皂苷组合物及其制备方法、应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1人参皂苷组合物的炮制
取人参经100℃蒸制2h，再重复蒸制1次，制得人参皂苷组合物。
实施例2人参皂苷组合物的炮制
取人参经100℃蒸制6h，再重复蒸制1次，制得人参皂苷组合物。
实施例3人参皂苷组合物的炮制
取人参经120℃蒸制4h，再重复蒸制5次，制得人参皂苷组合物。
实施例4人参皂苷组合物的炮制
取人参经90℃蒸制10h，再重复蒸制9次，制得人参皂苷组合物。
实施例5人参皂苷组合物的炮制
取人参经130℃蒸制1h，再重复蒸制4次，制得人参皂苷组合物。
实施例6人参皂苷组合物的炮制
取实施例3制得的人参打粉过100目筛得细粉，将细粉75％醇提两次，每次4小时，抽滤后药渣用200ml热回流法水提1次，醇提液减压蒸干，与水提液混合。
实施例7炮制工艺对人参中皂苷的影响
1.1皂苷类成分的分析
取相同批次的生晒参原药材，采用响应面法制成了20种正常炮制品(见表7)，考察炮制方式对人参炮制品化学成分的影响。通过HPLC-MS和HPLC-UV的方法，动态跟踪人参皂苷种类和含量的变化，鉴定新生人参皂苷的成分，揭示人参皂苷的变化规律。
1.1.1供试品溶液的配制
分别将干燥生晒参原药材、干燥炮制品粉碎至粉末状，过80目筛。精密称取干燥生晒参原药材和实施例1至实施例3制备的干燥炮制品粉末各2g(与 原药材相比，炮制品烘干后质量基本不变)，置于100ml具塞锥形瓶中，加入40ml 70％乙醇在冰水浴中超声60min(100Hz)，提取液用普通滤纸过滤。于45℃下用旋转蒸发仪减压浓缩除去乙醇至近干状态，用70％乙醇复溶至6ml。以13000rpm离心10min，取上清液用于色谱分析。
1.1.2对照品溶液的制备
本实验中共采用13种人参标准品，按结构分类可分为两类：原人参二醇(PPD)型，包括人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rd、20(R)-Rg3、20(S)-Rg3、Rk1、Rg5；原人参三醇(PPT)类型的Rg1、Re、Rf、Rk3、Rh4。精密称取这13种人参皂苷对照品各1.00mg，溶于1ml的容量瓶中，配成1mg/ml的混合标准溶液。
1.1.3色谱分析条件
色谱分析采用安捷伦1260高效液相系统(Agilent科技有限公司，美国产)，含在线真空脱气机、高压四元泵、盘式自动进样器和柱温箱。色谱分离采用Agilent ZorbaxExtend-C18柱(4.6×250mm，5μm)，梯度洗脱条件如下：流动相A为纯水，B为乙腈，梯度洗脱条件如下：0-13min，19-21％B；13-17min，21-26％B；17-20min，26％B；20-24min，26-30％B；24-37min，30-45％B；37-46min，45-49％B；46-51min，49-52％B；51-54min，52-53％B；54-56min，53-55％B。流速：1ml/min，波长：203nm，柱温：25℃，进样量：20μl。
1.1.4质谱条件
采用液相条件，柱后分流使50％的洗脱液进入Q-TOF-MS，进行检测；检测器采用Agilent 6520Q-TOF-MS系统(Agilent科技有限公司，美国产)，电喷雾(ESI)离子源。检测条件为：干燥气(N2)流速，10l/min；干燥气温度，320℃；雾化器压力，35psig；毛细管电压，3500V；OCT RFV，750V；碎片电压，120V。用负离子模式采集数据，离子扫描范围为m/z 100-1500。二级碰撞能量(collision energy，CE)设定为15-70V。进样量为1μl。
数据采集及处理分别采用Agilent Mass Hunter Acquisition SoftwareVersion B.04.00和Mass Hunter Workstation Software Version B.05.00软件(Agilent科技有限公司)。
2.实验结果与讨论
2.1皂苷类成分的分析结果
根据炮制温度、炮制时间、炮制次数的不同，考察炮制温度有100℃、110℃、120℃，炮制时间有2h、4h、6h，炮制次数有1、5、9次。采用Box-Behnken的中心组合试验设计原理，设计三因素三水平的响应面分析法，生成二十组炮制工艺，比较不同蒸制工艺对相同批次的生晒参中人参活性成分的影响。研究结果表明，炮制工艺引起部分化学成分含量的降低。因此炮制工艺显著改变生晒参的皂苷类成分。
以单个人参皂苷Rb1为代表，对人参炮制品进行化学成分分析。结果如图1，2，3所示，表示炮制时间和次数的交互因素对人参皂苷Rb1的响应曲面图。
检测指标以人参总皂苷含量为代表，对人参炮制品进行化学成分分析。如表1，表2，表3和表4，表5，表6所示，保持炮制次数不变，相同炮制时间时，从100℃升至120℃，人参总皂苷含量升高。如表4，表5，表6所示，保持炮制时间不变，相同炮制次数时，从100℃升至120℃，人参总皂苷含量升高。结果表明，温度为三者中最为主要的影响因素，炮制次数和炮制时间对人参皂苷的含量有交互影响作用。
表1炮制1次时，不同炮制温度和不同炮制时间对比表
| 炮制温度 | 炮制时间 | 炮制次数 | 人参总皂苷含量(mg/g) |
| 100℃ | 2h | 1 | 30.0775 |
| 100℃ | 6h | 1 | 32.021 |
| 120℃ | 2h | 1 | 47.2815 |
| 120℃ | 6h | 1 | 76.8015 |
| 110℃ | 4h | 1 | 52.1035 |
表2炮制5次时，不同炮制温度和不同炮制时间对比表
表3炮制9次时，不同炮制温度和不同炮制时间对比表
| 炮制温度 | 炮制时间 | 炮制次数 | 人参总皂苷含量(mg/g) |
| 100℃ | 2h | 9 | 54.4050 |
| 100℃ | 6h | 9 | 44.7260 |
| 120℃ | 2h | 9 | 118.1585 |
| 120℃ | 6h | 9 | 92.8790 |
| 110℃ | 4h | 9 | 94.6395 |
表4炮制时间为2h时，不同炮制温度和不同炮制次数对比表
| 炮制温度 | 炮制时间 | 炮制次数 | 人参总皂苷含量(mg/g) |
| 100℃ | 2h | 1 | 30.0775 |
| 100℃ | 2h | 9 | 54.4050 |
| 120℃ | 2h | 1 | 47.2815 |
| 120℃ | 2h | 9 | 118.1585 |
| 110℃ | 2h | 5 | 70.8705 |
表5炮制时间为6h时，不同炮制温度和不同炮制次数对比表
表6炮制时间为4h时，不同炮制温度和不同炮制次数对比表
| 炮制温度 | 炮制时间 | 炮制次数 | 人参总皂苷含量(mg/g) |
| 100℃ | 4h | 5 | 57.4650 |
| 120℃ | 4h | 5 | 132.4870 |
| 110℃ | 4h | 1 | 52.1035 |
| 110℃ | 4h | 9 | 94.6395 |
| 110℃ | 4h | 5 | 83.9730 |
| 110℃ | 4h | 5 | 84.0215 |
| 110℃ | 4h | 5 | 84.1415 |
| 110℃ | 4h | 5 | 87.2540 |
| 110℃ | 4h | 5 | 86.3705 |
| 110℃ | 4h | 5 | 86.8680 |
人参在蒸制过程中，人参皂苷的种类因炮制温度、时间和次数的不同而不同。对于同一个炮制品，根据人参皂苷的极性的划分，分为三组。如表7所示，对比不同极性的人参皂苷含量变化。如图4所示，极性大的人参皂苷Rg1、Re随着炮制温度的升高，炮制次数的增多，炮制时间的延长，人参皂苷Rg1、Re含量逐渐减少以致消失。中等极性皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd较为稳定。而稀有人参皂苷RK3、Rh4、Rk1、Rg5受炮制工艺的影响最大，含量变化明显。
通过HPLC-UV对原药材和生晒参炮制品进行定量分析，最终筛选出了三种炮制方式对成分差异影响最大，依次是①100℃，2h，1次(图5)、②100℃，6h，1次(图6)、③120℃，4h，5次(图7)。选择此三种炮制方式的原因如下：在炮制过程①中，极性较大的人参皂苷Rg1、Re含量较高，同时相对于生晒参原药材，此炮制工艺开始出现了含量较少、极性较小的稀有人参皂苷Rk3、Rh4、Rk1、Rg5等。在炮制过程②中，极性大的人参皂苷Rg1、Re、部分通过分步裂解转化成新的极性小的稀有皂苷Rh4等。由极性较大的人参 皂苷Rb1，Rc，Rb2，Rd逐步脱糖脱水，最终生成Rg5，Rk1等。这是向极性较小的人参皂苷转化的过度，研究的13种皂苷均含有。在炮制过程③中，极性较大的人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc逐渐消失，新生成的稀有人参皂苷Rh4、Rk3、Rk1、Rg5相对含量最高。炮制品中活性成分种类和含量的变化理论上会直接影响人参的药理活性，故在后续活性研究中针对这三种炮制品进行研究。
结果也显示，在120℃，4h，5次的炮制工艺下，稀有人参皂苷含量变化率最大；蒸制次数越多，稀有皂苷含量变化越明显，同时也验证了九蒸九制的合理性。
表7不同极性的人参皂苷含量变化对比表
与生晒参原药材相比，经过蒸制后人参皂苷种类和含量发生变化，经研究证实，生晒参中原有人参皂苷在蒸制过程中结构不稳定，主要生脱糖和脱水反应，生成极性较小的皂苷，其中稀有人参皂苷20S/20R-Rg3是代表性的水解产物，而Rk3/Rh4和Rk1/Rg5是去糖基后C-20进一步脱水的产物，如图5显示的裂解过程。
取实施例4至实施例6制备的人参皂苷组合物进行上述试验，实验结果与上述试验结果相近，无显著差异(P＞0.05)。
实施例8炮制工艺对人参壮阳活性的影响
1、实验方法
将小鼠分为6组，每组12只：
(1)对照组，每天灌胃纯水0.4ml，连续10天；
(2)模型组，每天灌胃氢化可的松0.5mg，连续10天；
(3)生晒参组，生晒参打粉过100目筛。实验开始前三天即开始灌胃给药，连续13天，给药量1g/kg生药材/d，同时给药三天后给造模剂氢化可的松0.5mg/d，连续10天。
(4)实施例1制备的炮制品R1(表7中生晒参100℃蒸制2h，1次)组，打粉过100目筛，实验开始前三天即开始灌胃给药，连续13天，给药量1g/kg生药材/d；同时给药三天后给造模剂氢化可的松0.5mg/d，连续10天。
(5)实施例2制备的炮制品R2(表7中生晒参100℃蒸制6h，1次)组，打粉过100目筛，实验开始前三天即开始灌胃给药，连续13天，给药量1g/kg生药材/d；同时给药三天后给造模剂氢化可的松0.5mg/d，连续10天。(6)实施例3制备的炮制品R3(表7中生晒参120℃蒸制4h，5次)组，打粉过 100目筛同，实验开始前三天即开始灌胃给药，连续13天，给药量1g/kg生药材/d；同时给药三天后给造模剂氢化可的松0.5mg/d，连续10天。。
第11天将实验动物经摘眼球取全血处死，摘取各脏器并对实验动物的脾脏、胸腺指数，血浆SOD值进行检测，取其平均值，结果列于图6-9，从而筛选出壮阳效果最好的炮制工艺。其中，图6-9中，C组为对照组，M为模型组，G为生晒参组，R1，R2，R3分别为实施例1制备的炮制品R1组，实施例2制备的炮制品R2组，实施例3制备的炮制品R3组。
2、实验结果
2.1脏器指数比较
由图6、7可知，模型组脏器指数显著降低，而给药组与模型组相比虽有所改善，但并无显著性差异。分析原因，可能与药物细粉灌胃给药导致小鼠不适应或不能有效吸收有关。下一步可以考虑用醇提加水提的方式提取后，用其冻干粉的水溶液灌胃给药，可以有效减少小鼠不消化或不吸收所导致的误差。
2.2小鼠血浆总SOD活力比较
由图8可见，与对照组相比，模型组小鼠血浆中SOD活力降低，给药后，各组小鼠血浆中SOD值均有所增加，且炮制品R1和R3与模型组有显著性差异(P＜0.05)，其中炮制品R3与模型组差异最为明显。
2.3不同组别小鼠体温的比较
由图9可见，对照组小鼠的体温在37℃上下，模型组小鼠体温降低，给药后各组小鼠体温普遍升高，甚至高出正常水平。炮制品R2和生晒参组小鼠的体温高于正常组，炮制品R1组体温与模型组相似，炮制品R3的效果较好。
3、实验结论
综合上述结果，R3组与造模组有显著性差异(P＜0.05)。
取实施例4至实施例6制备的人参皂苷组合物进行上述试验，实验结果与实施例1至实施例3制备的人参皂苷组合物的试验结果相近，无显著差异(P＞0.05)。
实施例9炮制工艺对人参壮阳活性的影响
1、实验方法
在实施例8的实验中，由于给药方式为药材细粉水混悬液灌胃给药。故可能存在药物有效成分吸收不完全以及影响小鼠消化系统正常功能的情况。从而使小鼠体重及脾脏功能受损。
因为脾指数为该实验指标之一，故决定对药材细粉提取(75％醇提两次，每次4小时，抽滤后药渣用200ml热回流法水提1次，醇提液减压蒸干，与水提液混合。根据原给药剂量换算水提液给药剂量。之后浓缩水提液至给药浓度)。之后的给药方式为灌胃给药材提取液。
本实验中设置了阳性对照组，对照药材为海狗丸(主要成分：人参、枸杞子、花椒、补骨脂、桑螵蛸、核桃仁、川芎、鹿鞭、牛膝、蛤蚧、复盆子、菟丝子、泽泻、牡丹皮、狗鞭、黄狗肾、黄柏、肉桂、白芍、淫羊藿、山药、杜仲、鹿茸、海马、熟地黄、当归、茯苓、巴戟天、阳起)。该药温肾助阳，用于肾阳虚引起的腰膝酸软，神疲乏力，肢体困倦，怕冷，夜尿频多，气短作喘。根据其成人用法用量换算为小鼠用量，由于是丸剂故研磨成粉后用CMC-Na溶解，超声10分钟给药，现用现配。
小鼠随机分为四组，每组12只：
(1)对照组(C)：每天灌胃纯水0.4ml，连续10天；
(2)模型组(M)：每天灌胃氢化可的松0.5mg，连续10天；
(3)本发明制备的人参炮制品R6组(R6)：将实施例3所得的人参打粉过100目筛得细粉，将细粉75％醇提两次，每次4小时，抽滤后药渣用200ml热回流法水提1次，醇提液减压蒸干，与水提液混合。根据原给药剂量换算水提液给药剂量。之后浓缩水提液至给药浓度0.2g/kg/d～2g/kg/d。
实验开始前三天即开始灌胃给药，连续13天，灌胃给药材提取液量按生药材计为0.65g/kg/d；同时给药三天后给造模剂氢化可的松0.5mg/d，连续10天。
(4)阳性药组(×)：采用上述给药方式，实验开始前三天即开始灌胃给药，连续13天，灌胃给药以药丸重量计为0.65g/kg/d；同时给药三天后给造模剂氢化可的松0.5mg/d，连续10天。
造模10天，造模前3天开始给药进行预保护。造模第10天测肛温；第11天眼眶取全血，离心取血浆，解剖测其胸腺指数和脾指数。之后测其血浆SOD值，血浆cAMP/cGMP值，列于图10-15中，其中C为对照组，M为模型组，R6为实施例6制备的人参炮制品R6组，×为阳性药组。
2、实验结果
2.1不同组别小鼠体温的比较
第十天小鼠体温有明显差异，造模组较低，给药及阳性组高，且与造模组之间P<0.01。结果见图10。
2.2脏器指数比较
胸腺指数R6组最好，与造模组相比阳性药和R6组均有升高，且P<0.01。
脾指数R6组最好，且有显著性差异，但阳性药组与造模组差别较小，P<0.05。考虑原因可能是给药不是药丸的水提液，或所选阳性药效果较差。实验结果见图11、图12。
2.3小鼠血浆cAMP/cGMP值
cAMP/cGMP是肾阳虚模型中一个评价药效的重要指标。
阳性药与造模组无显著差异。而给药组与造模组之间P<0.01。显示R6水提液的确有一定功效。实验结果见图13。
2.4小鼠血浆总SOD活力
SOD结果显示阳性药组R3组均能提高机体抗氧化能力，实验结果见图14。
2.5小鼠血浆睾酮含量测定四组小鼠睾酮含量未见明显差异。可能原因是本实验实际造模剂量较小，为文献剂量的0.5倍，且由文献中的腹腔注射改为灌胃给药。故造模程度较轻，且该造模剂及人参皂苷均为间接影响性腺功能，所以可能因此导致睾酮含量无明显差异。具体实验结果如图15所示。
3、实验总结
综上所述，人参炮制品R6有效的提高了肾阳虚模型小鼠的体温、胸腺指数、脾指数，且其SOD活力较造模组明显增强，血浆内cAMP/cGMP值也显著提高。提示人参炮制品R6对肾阳虚小鼠的机体功能有改善作用。
取实施例1至5制备的人参皂苷组合物进行上述试验，实验结果与实施例6制备的人参皂苷组合物的试验结果相近，无显著差异(P＞0.05)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种人参皂苷组合物，其特征在于，由人参稀有皂苷Rh4、Rk3、Rk1、Rg5组成。
2.根据权利要求1所述的人参皂苷组合物，其特征在于，还包括人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd。
3.根据权利要求1或2所述的人参皂苷组合物，其特征在于，还包括人参皂苷Rg1、Re。
4.根据权利要求3所述的人参皂苷组合物，其特征在于，所述人参稀有皂苷Rh4、Rk3、Rk1、Rg5的总含量大于42.55mg/g；所述人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd的总含量小于10mg/g；所述人参皂苷Rg1、Re的总含量小于0.35mg/g。
5.根据权利要求1至4任一项所述的人参皂苷组合物，其特征在于，其制备方法为：取人参经90℃～130℃蒸制1h～10h，所述蒸制的次数为1-9次。
6.根据权利要求5所述的人参皂苷组合物，其特征在于，所述人参皂苷组合物的制备方法为：将蒸制后的人参打粉过100目筛。
7.根据权利要求5所述的人参皂苷组合物，其特征在于，所述人参皂苷组合物的制备方法为：将蒸制好的人参切片，进行水提或者乙醇提取，得到提取物。
8.根据权利要求1至7任一项所述的人参皂苷组合物在制备提高胸腺指数或脾指数，增强血浆SOD活力和/或提高血浆内cAMP/cGMP值的药物和/或保健品中的用途。
9.根据权利要求1至7任一项所述的人参皂苷组合物在制备治疗肾阳虚的药物和/或保健品中的用途。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，当给药对象为非人的动物时，所述药物的给药剂量为0.2g/kg/d～2g/kg/d，当给药对象为人时，所述药物的人体等效给药剂量为0.02g/kg/d～0.2g/kg/d。
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