CN106366169A - 一种葡萄状枝瑚菌中抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葡萄状枝瑚菌中抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法及应用，本发明的抗肿瘤蛋白提取物是将葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis子实体研磨成粉末后，经浸提、盐析、透析、冻干、离子交换和凝胶层析而获得。该蛋白提取物是分子量为18.5kDa的单体蛋白，氨基酸序列与鬼伞科真菌Coprinellus Congregatus的泛素蛋白p19848有69％的相似度，是一种类泛素蛋白；对人肺腺癌细胞株A549的生长具有明显的抑制作用。本发明的葡萄状枝瑚菌(Ramaria botrytis)抗肿瘤蛋白提取物为天然提取物，对人类和环境均无害；制备方法简单，成本较低，适于工业化生产。

Description

一种葡萄状枝瑚菌中抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法。

背景技术

近年来，自从世界卫生组织提倡将传统药物与现代药物相结合应用于疾病治疗与保健之后，大型真菌作为中药或功能性食品，在食品和医药行业引起了广泛关注。从大型真菌中分离获得的许多活性成分，包括小分子、多糖、蛋白、多糖-蛋白复合物等，具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗微生物和免疫调节的作用。其中，有关多糖的研究最为广泛，然而，大型真菌中含量丰富的生物活性蛋白，包括凝集素，真菌免疫调节蛋白，核糖体失活蛋白，抗微生物蛋白，核糖核酸酶和漆酶等，在食品和医药领域的应用上展现出巨大的潜能。

葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis属担子菌门，非褶菌目，珊瑚菌科，枝瑚菌属。该菌形秀色美、质地脆嫩、鲜甜爽口、别具风味、营养丰富，含有多种对人体有益的碳水化合物、氨基酸和微量元素，是我国野生食用菌资源中不可忽视的组成部分，现已成功实现了人工栽培。

葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis被称为“野生之花”，是世界范围内常用的食用菌。它鲜甜爽口，含有亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天门各氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸等15种氨基酸，其中有6种人体必需氨基酸。除食用价值外，该菌还可以作为药用材料，据《中华本草》(1997)、《滇南本草》(1959)、《中国药用真菌图鉴》(1987)和《云南食用菌》(1984)记载该菌具有和胃现气、祛风、破血缓中等作用。同时对小白鼠肉癌S-180，艾氏癌的抑制率达到80％。其子实体多糖具有增强免疫功能、降血糖血脂、抗氧化、抗衰老等多种生理活性。

目前，除了对葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis生长特性，栽培技术的研究外，对其生物活性成分的研究较少，主要是从其粗体物、小分子代谢产物和多糖这三方面来进行研究。1、Kim H.J.等(J.Korean Soc.Food Sci.,1999,28(6):1321-1325；Korean J.FoodSci.Technol.,2003,35(2):286-290；Korean J.Mycol.,2003,31(1)：34-39)证实了Ramaria botrytis子实体甲醇提取物和乙酸乙酯萃取物具有较好的抗突变活性，并能在体外抑制结肠癌和肝癌细胞的增殖，同时，其甲醇提取物具有很高的DPPH自由基清除活性，并可以通过清除氧自由基的方式缓解由苯并芘诱导的肝损伤。Barros L.等(J.Agric.FoodChem.,2008,56,3856-3862)发现Ramaria botrytis子实体甲醇提取物无明显的抗氧化活性；Alves M.J.(J.Appl.Microbi.,2012,113:466-475)等证明Ramaria botrytis子实体的水/甲醇粗提物具有抗菌活性；李华等(食用菌学报，2012,19(3):69-72)从Ramariabotrytis子实体提取出来的粗多糖具有DPPH自由基清除活性；常正尧等(时珍国医国药，2013，24(1)：152-154)证明Ramaria botrytis子实体水煎剂对体外培养的乳腺癌细胞株有明显的抑制作用。2、Satoh Y.Y.等(J.Nat.Med.,2007,61:205–207)从其子实体分离出一种神经酰胺，并对其结构进行了解析。Barros L.等(Food Chem.Toxicol.,2009,47:1076–1079)从其子实体分离出原儿茶酸，并发现其具有很高的抗氧化活性。3、Bhanja S.K.等(Carbohyd.Res.,2013,374L:59–66)从Ramaria botrytis新鲜子实体中分离纯化得到一种具有免疫促进作用的葡聚糖。总的来说，目前对Ramaria botrytis的组成或营养成分及其药用价值研究较少，尤其是对于Ramaria botrytis中含量丰富的生物活性蛋白研究更少，仅有Lee T.H.等(Mycobiology,2001,29(3):173-175)对其新鲜子实体的水提粗品在蛋白方面做了大致研究，他们的研究表明此水提粗品有着较高漆酶活性和淀粉酶活性，但是依旧未得到并具体分析相应的蛋白。而本发明首次从Ramaria botrytis中分离纯化得到一种具有抗肿瘤活性的蛋白。

发明内容

本发明目的在于提供葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis中一种抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法，该蛋白提取物对人肺腺癌细胞株A549的生长具有明显的抑制作用。

本发明涉及的葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物RBUP是按照如下方法制备的：

1)将葡萄状枝瑚菌子实体50～70℃烘干并研磨成粉，溶解于0.2～0.5M的NaCl溶液中，2～6℃浸提8～16小时，4000～8000rpm离心10～20min，收集上清液；

2)向上清液中加入NH₄SO₄至饱和度为70～100％，2～6℃放置8～16小时，10000～20000rpm离心10～40min，收集沉淀，即得葡萄状枝瑚菌蛋白粗提物；

3)将葡萄状枝瑚菌蛋白粗提物用10～50mM、pH 6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液溶解，然后在2～6℃、5～10倍重量的该缓冲液中透析8～20小时，反复3～5次，透析后14000rpm离心10min收集上清液并进行冷冻干燥，即得葡萄状枝瑚菌蛋白粗粉；

4)将葡萄状枝瑚菌蛋白粗粉溶解于10～50mM、pH 6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液中，用0.15，0.3和0.5mol/L NaCl依次洗脱，收集洗脱峰；

5)将0.3mol/L NaCl洗脱峰组分上样于凝胶层析柱，用10～50mM Tris-HCl、200～500mM NaCl，pH 6.0～8.0缓冲液洗脱，收集第二个洗脱峰，获得葡萄状枝瑚菌抗肿瘤蛋白提取物。

进一步的，步骤1)中葡萄状枝瑚菌子实体粉与NaCl溶液的料液比为1:20。本发明中葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物采用SDS-PAGE进行纯度检测，证明其是分子量为18.5kDa的单体蛋白，ESI-MS/MS法测得其氨基酸序列与鬼伞科真菌Coprinellus Congregatus的泛素蛋白p19848有69％的相似度。

本发明中葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物对人肺腺癌细胞株A549的生长具有明显的抑制作用，Annexin V-FITC/PI双染色证明该蛋白提取物能够诱导肿瘤细胞凋亡。

将上述葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis中抗肿瘤蛋白提取物命名为RBUP(Ramaria botrytis ubiquitin-like protein)。

本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明中葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物为天然提取物，具有良好的安全性；(2)本发明中葡萄状枝瑚菌Ramariabotrytis抗肿瘤蛋白提取物为单一蛋白，为获得该蛋白的氨基酸序列及其编码基因提供了基础；(3)本发明中葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物具有良好的抗肿瘤效果；(4)本发明中葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物制备简单，成本低，适于大规模生产。

附图说明

图1本发明Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物的离子交换层析图。

图2本发明Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物的凝胶色谱层析图。

图3本发明Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物的SDS-PAGE图。

图4本发明Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物的氨基酸序列与鬼伞科真菌Coprinellus Congregatus的泛素蛋白p19848的比对。

图5本发明Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物对A549细胞生长的抑制作用。

图6本发明Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用(A.未加抗肿瘤蛋白提取物的A549细胞；B.4μM抗肿瘤蛋白提取物处理的A549细胞；C.12μM抗肿瘤蛋白提取物处理的A549细胞；D.20μM抗肿瘤蛋白提取物处理的A549细胞)。

具体实施例

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

以下所述实施例中所用的材料、试剂等，任何人均能从商业渠道采购。所述的葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis可从河南省栾川市当地市场获得。鬼伞科真菌CoprinellusCongregatus的泛素蛋白p19848的详细信息在NCBI数据库的蛋白质库的登记号是P19848，版本号是GI:136667。

实施例1本发明葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物RBUP的制备

(1)将葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis子实体55℃烘干并研磨成粉，浸泡于0.5M的NaCl溶液，料液比为1:20，4℃浸提12小时，4000rpm离心10min，收集上清液；

(2)向上清液中加入硫酸铵至饱和度为80％，4℃放置12小时，10000rpm离心20min，收集沉淀，即葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis蛋白粗提物；

(3)将葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis蛋白粗提物用10mM、pH 7.0的Tris-HCl缓冲液溶解，然后在4℃、5倍重量的该Tris-HCl缓冲液中透析20小时，其中反复5次，透析后14000rpm离心10min收集上清液并进行冷冻干燥，即得葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis蛋白粗粉；

(4)将葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis蛋白粗粉溶解于10mM、pH 7.0的Tris-HCl缓冲液中，用0.15、0.3和0.5mol/L NaCl依次洗脱，收集洗脱峰；

(5)将0.3mol/L NaCl洗脱峰组分上样于分子筛，用10mM Tris-HCl、300mM NaCl，pH 7.0缓冲液洗脱，获得抗肿瘤蛋白提取物RBUP。

实施例2本发明抗肿瘤蛋白提取物的氨基酸序列测定

(1)SDS-PAGE电泳：15％胶浓度，加预染marker，上样20μg，上样量10μL；

(2)电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色10min，随即用脱色液进行脱色；

(3)脱色结束后，将目的条带切下并置于洁净1.5mL离心管中，用蒸馏水清洗3次后，加入1mL胶内脱色液(50％乙腈，25mM NH₄HCO₃)脱色10min，弃去脱色液，重复2次；

(4)加入乙腈脱水至胶粒完全变白，真空抽干乙腈；

(5)向管内加10mM DTT，让胶粒吸收完全，放入56℃水浴锅内，孵育1h；

(6)孵育完毕后，移除多余DTT液体，加入55mM IAM，暗室室温孵育45min；

(7)孵育完毕后，移除多余IAM液体，加入25mM NH₄HCO₃，清洗10min，并重复清洗一次；

(8)移除NH₄HCO₃，加入脱色液清洗10min，并重复一次。

(9)乙腈脱水至胶粒完全变白，真空抽干乙腈。

(10)1μg/μL的胰蛋白酶储液以25mM NH₄HCO₃稀释15倍，加入脱水后的胶粒中，让胶粒充分吸收。然后加入25mM NH₄HCO₃没过胶粒，放入37℃水浴锅，消化过夜。

(11)过夜后，加入终浓度0.1％的FA终止消化。

(12)取10μL样品上HPLC，使用质谱仪检测。

如图4，ESI-MS/MS测得本发明葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物RBUP的氨基酸序列与鬼伞科真菌Coprinellus Congregatus的泛素蛋白p19848有69％的相似度。

实施例3本发明抗肿瘤蛋白提取物对A549细胞的抗增殖作用

(1)将A549细胞按5×10⁴cfu/孔的浓度接种于96孔板中，37℃培养24小时；

(2)每孔加入10μL用培养基依次梯度稀释的浓度为40μM、80μM、120μM、160μM、200μM的抗肿瘤蛋白提取物，每个浓度3个平行，并设空白对照，37℃培养48h。

(3)每孔加入25μL预冷的50％三氯乙酸溶液，4℃放置1h；

(4)蒸馏水洗涤5次，室温干燥后每孔加入100μL SRB染液(SRB 4g/L，1％乙酸)染色30min；

(5)1％乙酸溶液洗涤5次,室温干燥后每孔加入150μL,10mmol/L Tris缓冲液，用酶联免疫检测仪测定490nm处吸光值。

该蛋白提取物对A549细胞的抗增殖作用如图5，RBUP处理A549细胞48小时后对A549细胞抗增殖作用的IC₅₀值约为16μM。

实施例4本发明抗肿瘤蛋白提取物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

(1)将A549细胞按2×10⁵cfu/孔的浓度接种于6孔板中，37℃培养24小时后加入相同体积的RBUP溶液，使之终浓度为4μM、12μM和20μM；

(2)孵育48小时后，用不含EDTA的胰酶消化液消化细胞，消化时间不宜过长，终止消化后将细胞悬液加至相应的离心管，1000rpm离心3min，弃培养基；

(2)用3mL预冷的PBS洗涤两次；1000rpm离心3min，弃上清，重复2次；

(3)用预冷的Binding Buffer轻轻悬浮细胞至5×10⁵～1×10⁶cfu/mL；

(4)取0.5mL细胞悬液至流式细胞管内，加入5μL Annexin V-FITC混匀后，避光，室温温育15min；

(5)加入5μL PI；

(6)过200目细胞筛后上流式细胞仪检测。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。通过FITC单阳和双阳染色可以很容易地将磷脂酰丝氨酸(PS)外翻的细胞(即凋亡细胞)和正常细胞(双阴)、坏死细胞(PI单阳)区分开来。图6是A549细胞用Annexin V-FITC/PI染色经流式细胞仪检测的结果，其象限图中的右象限代表Annexin V-FITC染色的细胞，即凋亡细胞。4μM、12μM、20μM葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物处理的A549细胞，凋亡细胞的比率分别为17.63％、36.22％、79.65％。从图中可以看出随着葡萄状枝瑚菌Ramaria botrytis抗肿瘤蛋白提取物浓度的增加，凋亡细胞的比率逐渐增加，表明本发明的葡萄状枝瑚菌Ramariabotrytis抗肿瘤蛋白提取物对肿瘤细胞凋亡具有诱导作用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.葡萄状枝瑚菌中抗肿瘤蛋白提取物，其特征在于所述的抗肿瘤蛋白提取物来自葡萄状枝瑚菌，是分子量为18.5kDa的单体蛋白，氨基酸序列与鬼伞科真菌的泛素蛋白p19848有69％的相似度。

2.一种权利要求1所述的葡萄状枝瑚菌中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将葡萄状枝瑚菌子实体50～70℃烘干并研磨成粉，溶解于0.2～0.5M的NaCl溶液中，2～6℃浸提8～16小时，4000～8000rpm离心10～20min，收集上清液；

2)向上清液中加入NH₄SO₄至饱和度为70～100％，2～6℃放置8～16小时，10000～20000rpm离心10～40min，收集沉淀，即得葡萄状枝瑚菌蛋白粗提物；

3)将葡萄状枝瑚菌蛋白粗提物用10～50mM、pH 6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液溶解，然后在2～6℃、5～10倍重量的该缓冲液中透析8～20小时，反复3～5次，透析后14000rpm离心10min收集上清液并进行冷冻干燥，即得葡萄状枝瑚菌蛋白粗粉；

4)将葡萄状枝瑚菌蛋白粗粉溶解于10～50mM、pH 6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液中，用0.15，0.3和0.5mol/L NaCl依次洗脱，收集洗脱峰；

5)将0.3mol/L NaCl洗脱峰组分上样于凝胶层析柱，用10～50mM Tris-HCl、200～500mM NaCl，pH 6.0～8.0缓冲液洗脱，收集第二个洗脱峰，获得葡萄状枝瑚菌抗肿瘤蛋白提取物。

3.根据权利要求2所述的葡萄状枝瑚菌中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将葡萄状枝瑚菌子实体55℃烘干并研磨成粉，浸泡于0.5M的NaCl溶液，4℃浸提12小时，4000rpm离心10min，收集上清液；

2)向上清液中加入硫酸铵至饱和度为80％，4℃放置12小时，10000rpm离心20min，收集沉淀，即得葡萄状枝瑚菌蛋白粗提物；

3)将葡萄状枝瑚菌蛋白粗提物用10mM、pH 7.0的Tris-HCl缓冲液溶解，然后在4℃、5倍重量的该Tris-HCl缓冲液中透析20小时，其中反复5次，透析后14000rpm离心10min收集上清液并进行冷冻干燥，即得葡萄状枝瑚菌蛋白粗粉；

4)将葡萄状枝瑚菌蛋白粗粉溶解于10mM、pH 7.0的Tris-HCl缓冲液中，用0.15、0.3和0.5mol/L NaCl依次洗脱，收集洗脱峰；

5)将0.3mol/L NaCl洗脱峰组分上样于分子筛，用10mM Tris-HCl、300mM NaCl，pH 7.0缓冲液洗脱，收集第二个洗脱峰，获得葡萄状枝瑚菌抗肿瘤蛋白提取物。

4.根据权利要求2或3所述的葡萄状枝瑚菌中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于：步骤1)中葡萄状枝瑚菌子实体粉与NaCl溶液的料液比为1:20。

5.葡萄状枝瑚菌抗肿瘤蛋白提取物的应用，其特征在于：用于对人肺腺癌细胞株A549的生长的抑制作用，Annexin V FITC/PI双染色证明该蛋白提取物能够诱导肿瘤细胞凋亡。