CN106361732A - 二烯丙基二硫醚在制备铜绿假单胞菌群体感应猝灭剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了二烯丙基二硫醚在制备铜绿假单胞菌群体感应猝灭剂中的应用。本发明发现DDS对铜绿假单胞菌PAO1的生长不会产生明显的抑制作用，但却能够显著抑制铜绿假单胞菌PAO1的绿脓菌素的产生，具有抑制其毒力因子的群体感应猝灭活性，因此可用于制备抑制铜绿假单胞菌产绿脓菌素的药物和铜绿假单胞菌群体感应猝灭剂。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及二烯丙基二硫醚在制备铜绿假单胞菌群体感应猝灭剂中的应用。
背景技术：
群体感应(quorum sensing，简称QS)是细菌的一种细胞通讯，细菌释放一些易扩散的小分子物质到环境中，当细胞达到一定密度时，这些小分子物质累积超过一定的阈值，使细菌群体发生某种感应，激活或者抑制某些基因的表达，从而诱导了一些复杂的群体行为，比如胞外酶的分泌、生物发光、质粒的转移、抗生素的生物合成、生物膜的形成、形态的转变、色素的产生、植物-微生物的互作等。群体感应系统广泛存在于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中，但目前以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的群体感应系统的研究最为深入。铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性菌，在自然界分布广泛，它是人类的条件致病菌，是一系列严重的化脓性感染，尤其是支气管扩张、慢性支气管炎、囊性肺纤维化等基础疾病继发感染的重要致病菌。群体感应在铜绿假单胞菌的毒力、生物膜形成和存活方面起到重要作用，因此，一些抗感染的药物把群体感应的信号通路作为一个新的作用靶点，即群体感应猝灭。
大蒜是常见的食物，其用作民间医药的历史已有几千年。现代科学研究证明，大蒜精油中含硫化合物具有较强的抗菌消炎作用，对多种细菌、真菌和病毒均有抑制作用。二烯丙基二硫醚(Diallyl disulfide，DDS)是大蒜精油中一种含硫丰富的化合物。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种二烯丙基二硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌产绿脓菌素药物中的应用。
本发明通过实验表明，DDS对铜绿假单胞菌PAO1的生长不会产生明显的抑制作用，但却能够显著抑制铜绿假单胞菌PAO1的绿脓菌素的产生，具有抑制其毒力因子的群体感应猝灭活性。
因此，本发明提供二烯丙基二硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌产绿脓菌素药物中的应用。
本发明的第二个目的是提供二烯丙基二硫醚在制备铜绿假单胞菌群体感应猝灭剂中的应用。
本发明发现DDS对铜绿假单胞菌PAO1的生长不会产生明显的抑制作用，但却能够显著抑制铜绿假单胞菌PAO1的绿脓菌素的产生，具有抑制其毒力因子的群体感应猝灭活性，因此可用于制备抑制铜绿假单胞菌产绿脓菌素的药物和铜绿假单胞菌群体感应猝灭剂。
附图说明：
图1是DDS作用下铜绿假单胞菌PAO1的生长曲线；
图2是DDS抑制铜绿假单胞菌PAO1绿脓菌素的产生照片，A-对照；B-0.16μg/mLDDS；C-0.64μg/mL DDS；
图3是DDS抑制铜绿假单胞菌PAO1绿脓菌素的产生动力学曲线。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
PAO1菌[铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)]悬液的制备：将指数生长期的PAO1培养液取样，离心，用PBS缓冲液洗涤一次，重悬于PBS中，并将菌浓度稀释至108CFU/mL。
1.DDS[二烯丙基二硫醚]对铜绿假单胞菌PAO1生长的影响实验
分别向5支试管中加入LB培养基、DDS，并接入指数生长期的PAO1菌悬液，总体积均为10mL，使PAO1的菌浓度均为106CFU/mL，DDS的浓度分别为0(对照)、0.16μg/mL、0.32μg/mL、0.64μg/mL和1.28μg/mL。将几个实验组分别取样加入到自动生长曲线测定仪(Bioscreen C)专用的蜂窝培养板中，每孔加入350μL的培养液，每个实验组三个平行。将蜂窝培养板置于自动生长曲线测定仪中，37℃振荡培养3天，每小时测定一次OD600。以OD600为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制DDS作用下PAO1的生长曲线，以此研究DDS对PAO1生长的影响。结果如图1所示。
2.DDS对铜绿假单胞菌PAO1绿脓菌素产生的影响实验
取3个三角烧瓶，每瓶接入LB培养基、DDS，并接入指数生长期的PAO1菌悬液，总体积均为100mL，PAO1的菌浓度均为106CFU/mL，DDS的浓度分别为0(对照)、0.16μg/mL、和0.64μg/mL。置于摇床中37℃恒温振荡培养7天，每天取样提取绿脓菌素，每组两个平行样。提取方法如下：取培养液5mL，离心，将上清转入新管；加入3mL氯仿，剧烈振荡，抽提30min；离心，将氯仿层转入新管中；加入1mL的0.2N盐酸，剧烈振荡抽提30min；离心，将上层水相转入新管中；于紫外分光光度计上520nm波长处测定吸光值。以吸光值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制DDS作用下PAO1绿脓菌素产量的动力学变化，以此研究DDS对PAO1绿脓菌素产生的影响。并于培养3天时分别取样5mL到3支试管中，观察实验组与对照组颜色的变化，并拍照。结果如图2和图3所示。
实验结果：
从图1可以看出，不同浓度的DDS处理组与对照组中PAO1的生长曲线没有显著的差异，均呈现了典型的生长曲线，包括延滞期、指数生长期、稳定期和衰亡期，因该生长曲线是以菌液的OD600值为纵坐标，反映的是活细菌和死细菌的总吸光值，因此衰亡期不明显。
从图2可以看出，培养3天后，对照组的培养液呈现绿色，表明绿脓菌素产量较高，而0.16和0.64μg/mL的DDS处理组没有呈现绿色，表明DDS抑制了PAO1的绿脓菌素的产生。图3进一步证明了DDS抑制了PAO1的绿脓菌素的产生，对照组中绿脓菌素的产量先是随着培养时间的延长逐渐升高，在培养4天时达到了最大值，之后随着培养时间的延长，绿脓菌素产量又呈下降趋势。但0.16μg/mL的DDS处理组中，绿脓菌素的产量一直明显低于对照组，0.64μg/mL的DDS处理组几乎一直没有检测到绿脓菌素的产生。
综上的实验结果表明，低浓度的DDS不会影响铜绿假单胞菌PAO1的生长(图1)，但能够抑制铜绿假单胞菌PAO1的绿脓菌素的产生(图2-3)，具有对铜绿假单胞菌PAO1菌株的群体感应猝灭活性。
Claims (2)
1.二烯丙基二硫醚在制备抑制铜绿假单胞菌产绿脓菌素药物中的应用。
2.二烯丙基二硫醚在制备铜绿假单胞菌群体感应猝灭剂中的应用。
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