CN106336455A - 东北虎α干扰素及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种东北虎α干扰素及其编码基因和应用。本发明从东北虎基因组中克隆获得了东北虎α干扰素家族，其成熟肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1‑11所示，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.12‑22所示。本发明所述东北虎IFN‑α家族蛋白具有共同保守结构域，即IFabd结构域。抗病毒活性功能验证结果证明，本发明东北虎IFN‑α家族蛋白具有抗水泡性口炎病毒、犬瘟热病毒以及禽流感病毒的功能。本发明进一步公开了一种抗病毒的药物组合物，包括预防或治疗上有效量的东北虎α干扰素和药学上可接受的辅料或载体。本发明为东北虎干扰素对其他病毒性疾病的深入研究以及东北虎干扰素产品的问世奠定了理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及东北虎α干扰素，尤其涉及东北虎α干扰素家族，本发明还涉及编码所述东北虎α干扰素家族的基因序列以及所述东北虎α干扰素家族在制备抗病毒药物中的应用，属于东北虎α干扰素家族基因的克隆领域。
背景技术
虎(Panthera tigris)是世界上公认的最濒危物种，而在现存虎的5个亚种中，东北虎(Panthera tigris altaica)分布于俄罗斯远东地区、中国东北东部林区和朝鲜北部。近年来的一些研究表明，一些东北虎患有的细菌性、病毒性及寄生虫性疾病使野生东北虎和人工饲养的东北虎受到极大威胁，造成严重的损失，因此对这些疾病的防疫与治疗是不可忽视的。
干扰素(Interferon,IFN)是一种在特定诱生剂的作用下由单核细胞和淋巴细胞产生的具有抗病毒繁殖及免疫调节等功能的蛋白质。干扰素可分为I型、II型和III型。I型干扰素又称病毒干扰素或白细胞干扰素，包括IFN-α、β、ω、κ、τ、δ、和ζ等，主要功能是抑制病毒增殖。II型干扰素又称免疫干扰素，只有IFN-γ一个成员，主要起免疫调节的作用。III型干扰素包括IFN-λ或IL-28/29，在防御和治疗感染方面，对固有免疫和适应性免疫起重要作用。
迄今为止，哺乳动物的IFN-α的研究(尤其是人和鼠的研究)已取得很多成果，但是尚未有东北虎IFN-α基因的核苷酸序列及与其相对应的氨基酸序列的报道。由于至今还没有东北虎干扰素的产品问世，大多是使用猫干扰素来代替东北虎干扰素。然而猫和东北虎存在种属差异，其干扰素对东北虎的病毒性疾病的治疗效果并不是很显著，因而研究东北虎干扰素是非常有必要的。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种东北虎α干扰素；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供编码所述东北虎α干扰素的基因；
本发明所要解决的第三个技术问题是提供所述东北虎α干扰素在制备抗病毒药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种东北虎α干扰素，其氨基酸序列为(a)或(b)所示：
(a)、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；
(b)、将SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有东北虎α干扰素功能的蛋白变体。
本发明进一步公开了编码所述东北虎α干扰素的基因，其核苷酸序列为(a)、(b)、(c)或(d)所示：
(a)、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQ IDNo.22所示的多核苷酸；
(b)、编码SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11所示氨基酸序列的多核苷酸；
(c)、与SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQID No.22的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有东北虎α干扰素的功能；
(d)、与SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQID No.22所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有东北虎α干扰素的功能。
本发明还公开了一种东北虎α干扰素，其氨基酸序列为(a)或(b)所示：
(a)、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32或SEQ IDNo.33所示的氨基酸序列；
(b)、将SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32或SEQID No.33所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有东北虎α干扰素功能的蛋白变体。
本发明进一步公开了编码上述东北虎α干扰素的基因，其核苷酸序列为(a)、(b)、(c)或(d)所示：
(a)、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43或SEQ IDNo.44所示的多核苷酸；
(b)、编码SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32或SEQID No.33所示氨基酸序列的多核苷酸；
(c)、与SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ IDNo.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43或SEQID No.44的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有东北虎α干扰素的功能；
(d)、与SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ IDNo.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43或SEQID No.44所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有东北虎α干扰素的功能。
本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备东北虎α干扰素的氨基酸序列变体或片段，用于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。
另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQID No.21或SEQ ID No.22所示的多核苷酸，或者，SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.43或SEQ ID No.44所示的多核苷酸进行优化，以增强其在重组宿主细胞或重组菌株中的表达效率。例如，可采用目标宿主细胞的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标宿主细胞中的表达效率。
本发明以东北虎基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物转化大肠杆菌获得阳性菌株。根据测序结果取氨基酸序列不同的各个菌株则为不同的亚型，分别命名为TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10。其中，东北虎TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10的成熟肽的氨基酸序列依次为SEQ ID No.1-11所示，其编码基因的核苷酸序列依次为SEQ ID No.12-22所示。所述东北虎TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10(即前肽，含有信号肽)的氨基酸序列依次为SEQID No.23-33所示；其编码基因的核苷酸序列依次为SEQ ID No.34-44所示。
本发明所述东北虎IFN-α或东北虎IFN-α10中所含信号肽的氨基酸序列为SEQ IDNo.45所示，东北虎TIFN-α1/2/3/4/5/6/7/8/9中所含信号肽的氨基酸序列为SEQ ID No.46所示。
本发明所述东北虎IFN-α家族(IFN-αs)蛋白，有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其结构具有共同保守结构域，即IFabd结构域，IFabd结构域为东北虎IFN-α家族蛋白前肽的第58～174位氨基酸，结构特征与人、小鼠的interferon相一致，在东北虎IFN-α家族(IFN-αs)蛋白所对应的IFabd结构域氨基酸序列为SEQ ID No.47-55所示。其中，SEQ IDNo.47所示氨基酸序列为东北虎TIFN-α和TIFN-α4中所对应的IFabd结构域；SEQ ID No.48-53所示氨基酸序列分别为东北虎TIFN-α1/2/3/5/6/7中所对应的IFabd结构域；SEQ IDNo.54所示氨基酸序列为东北虎TIFN-α8和TIFN-α9中所对应的IFabd结构域；SEQ ID No.55所示氨基酸序列为东北虎TIFN-α10中所对应的IFabd结构域。
本发明进一步公开了含有编码所述东北虎α干扰素的基因的重组表达载体，以及含有所述重组表达载体的重组宿主细胞。将编码所述东北虎α干扰素的基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，即得到表达东北虎α干扰素的重组表达载体。
可以采用任何转化方法将本发明所构建的重组表达载体导入到目标细胞中，得到重组宿主细胞。所述的转化方法包括：电转化法、脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法等；所述的目标细胞可为原核细胞或真核细胞，包括但不限于：大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞或病毒等。
本发明所述东北虎α干扰素及其编码基因能够应用于制备抗病毒药物。其中所述病毒包括：水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)、犬瘟热病毒(Caninedistemper virus，CDV)或禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)。
本发明进一步公开了一种抗病毒的药物组合物，包括：预防或治疗上有效量的所述东北虎α干扰素和药学上可接受的辅料或载体。其中，所述辅料或载体包括但不限于：溶剂、表面活性剂、增溶剂、助溶剂、润滑剂、填充剂、等渗调节剂、稳定剂或支持剂中的任意一种或多种。
抗病毒活性功能验证结果表明，本发明所述东北虎IFN-α家族蛋白具有抑制水泡性口炎病毒(VSV)，犬瘟热病毒(CDV)和禽流感病毒(AIV)增殖的作用，且抑制程度随着东北虎IFN-α家族蛋白浓度的增加而升高。本发明东北虎IFN-α家族蛋白对东北虎的病毒性疾病的预防或治疗的效果显著。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明从东北虎基因组中克隆了东北虎IFN-α家族基因，并通过原核表达获得了东北虎IFN-α家族蛋白。本发明所述东北虎IFN-α家族蛋白具有共同保守结构域，即IFabd结构域。抗病毒活性功能验证结果证明，本发明东北虎IFN-α家族蛋白具有抗水泡性口炎病毒、犬瘟热病毒以及禽流感病毒的功能。本发明为东北虎干扰素对其他病毒性疾病的深入研究，以及东北虎干扰素产品的问世奠定了理论基础。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
述语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
术语“可操作的连接”意指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
术语“表达”意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。
附图说明
图1为使用引物mtIFN-αS和mtIFN-αA PCR扩增IFN-α家族亚型基因的电泳结果图；其中1-11道分别为：TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10；M道：Marker；
图2为IFN-αs成熟肽序列的扩增电泳结果图；其中1-11道分别为：TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10；12道：阴性对照；
图3为蛋白的SDS-PAGE结果；其中，1道：pET32a(+)空载体诱导后；2道：TIFN-α-pET32a诱导前；3-13道：TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10-pET32a诱导后全菌体；
图4为重组IFN-α家族对VSV病毒的抑制试验的显微镜观察图；其中，A：病毒对照组；B：阴性对照-细胞对照组；C：TIFN-α9处理组；
图5为重组IFN-α家族对CDV病毒的抑制试验的显微镜观察图；其中，A：病毒对照组；B：阴性对照-细胞对照组；C：TIFN-α9处理组；
图6为重组IFN-α家族对AIV病毒的抑制试验的显微镜观察图；其中，A：病毒对照组；B：阴性对照-细胞对照组；C：TIFN-α9处理组；
图7为TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10在AIV/F81系统上的病毒增殖数量的统计图；其中，1：病毒对照组；2-12：TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10；
图8为TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10在AIV/F81系统上的病毒增殖数量的统计图；其中，1：病毒对照组；2-12：TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10；
图9为TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10在AIV/F81系统上的病毒增殖数量的统计图；其中，1：病毒对照组；2-12：TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1 东北虎IFN-α家族基因序列的扩增
1、按照全血基因组DNA的简单快速提取方法，从东北虎的血液中提取基因组DNA；
2、以东北虎基因组DNA为模板，引物mtIFN-αS和mtIFN-αA为引物，PCR扩增IFN-α基因，其中引物mtIFN-αS的核苷酸序列为：5’-GATCCCCAATGGCGCTGCCCT-3’，引物mtIFN-αA的核苷酸序列为：5’-TCCATGTTGAACAGGTCTCATTTCT-3’；反应体系和反应条件如下所示：
PCR反应体系：
反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58.2℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃终止反应。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳的结果如图1所示。
回收目的片段，将胶回收产物连入pEASY-Blunt载体，25℃连接10min后，转化到大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，37℃培养12h。
挑取单克隆菌落，经菌液PCR鉴定(mtIFN-αS和mtIFN-αA为引物)阳性后送哈尔滨博仕生物技术有限公司测序，测序结果中取氨基酸序列不同的各个菌株则为不同的亚型，分别命名为TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10。
所述东北虎TIFN-α/1/2/3/4/5/6/7/8/9/10(即前肽，含有信号肽)的氨基酸序列为SEQ ID No.23-33所示；其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.34-44所示。
本发明所述东北虎IFN-α或东北虎IFN-α10中所含信号肽的氨基酸序列为SEQ IDNo.45所示，东北虎TIFN-α1/2/3/4/5/6/7/8/9中所含信号肽的氨基酸序列为SEQ ID No.46所示。
实施例2 东北虎IFN-α家族基因的原核表达
原核表达的过程中，东北虎IFN-α家族的信号肽部分要去除，因此首先要设计东北虎IFN-α家族表达成熟肽的引物TIFN-αS和TIFN-αA，TIFN-αS：5’-ACGGGATCCTGTGACCTGCCTCAGACCCA-3’(下划线：BamH I酶切位点)，TIFN-αA：5’-CGTCTCGAGTCATTTCTCGCTCCTTAACCT-3’(下划线：Xho I酶切位点)。
PCR扩增编码东北虎IFN-α家族成熟肽的核苷酸序列，反应体系如下：
反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58.2℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃终止反应。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳的结果如图2所示。
3、目的片段回收后，分别连入平端载体pEASY-Blunt-Simple，得到pEASY-IFN-α，转化大肠杆菌Trans1-T1，37℃培养12h，经菌液PCR鉴定，BamH I、Xho I单双酶切鉴定为阳性的菌液送博仕测序，测序结果显示克隆得到的编码东北虎IFN-α家族成熟肽的核苷酸序列为SEQ ID No.12-22所示，与预期一致。
4、重组表达载体pET32a-IFN-α的构建：pEASY-IFN-α和pET32a经BamH I、Xho I双切后，将IFN-α和线性表达载体pET32a在T4DNA连接酶的作用下连接成pET32a-IFN-α。
5、将重组表达载体pET32a-IFN-α转化到BL21大肠杆菌中，待OD值在0.5左右加IPTG诱导表达。表达后的重组蛋白的SDS-PAGE结果如图3所示，氨基酸序列为SEQ ID No.1-11所示。
6、蛋白的镍柱纯化：将重组蛋白溶解在6M的盐酸胍溶液，按纯化说明操作，10mM咪唑，100mM咪唑分别上柱洗涤杂带白，250mM洗脱干扰素蛋白。
7、包涵体的透析复性：本发明尝试用2M盐酸胍透析纯化后的重组干扰素给包涵体复性，最后用PBS透析以备研究其生物学功能。
实施例3 重组东北虎IFN-α家族的抗病毒活性功能验证
1、制备猫肾细胞，37℃、5％CO2培养24h；
2、换细胞培养液，同时向猫肾细胞中接入100μL 0.3mg/ml的重组东北虎IFN-α家族蛋白(本发明实施例2制备)，培养24h；
3、换细胞培养液，同时分别加入100μL水泡性口炎病毒(VSV)，犬瘟热病毒(CDV)，禽流感病毒(AIV)，100pfu\孔，培养24h，在显微镜下观察，并对病毒受到的抑制情况(抑制率)进行统计，结果如图4-图9所示。
结果表明，本发明制备得到的东北虎IFN-α家族蛋白，其结构具有共同保守结构域，即IFabd结构域(其氨基酸序列为SEQ ID No.47-55所示；其中，SEQ ID No.47所示氨基酸序列为东北虎TIFN-α和TIFN-α4中所对应的IFabd结构域；SEQ ID No.48-53所示氨基酸序列分别为东北虎TIFN-α1/2/3/5/6/7中所对应的IFabd结构域；SEQ ID No.54所示氨基酸序列为东北虎TIFN-α8和TIFN-α9中所对应的IFabd结构域；SEQ ID No.55所示氨基酸序列为东北虎TIFN-α10中所对应的IFabd结构域。)，IFabd结构域为东北虎IFN-α家族蛋白前肽第58～174位氨基酸，结构特征与人、小鼠的interferon相一致，具有抑制水泡性口炎病毒(VSV)，犬瘟热病毒(CDV)，禽流感病毒(AIV)增殖的作用(参见Himmler A,Hauptmann R,Adolf G R,et al.Molecular cloning and expression in Escherichia coli ofequine type I interferons.[J].Dna,1986,5(5):345-356)。
Claims (10)
1.一种东北虎α干扰素，其特征在于，其氨基酸序列为(a)或(b)所示：
(a)、SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11所示的氨基酸序列；
(b)、将SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有东北虎α干扰素功能的蛋白变体。
2.编码权利要求1所述东北虎α干扰素的基因。
3.按照权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列为(a)、(b)、(c)或(d)所示：
(a)、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQ ID No.22所示的多核苷酸；
(b)、编码SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11所示氨基酸序列的多核苷酸；
(c)、与SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQ IDNo.22的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有东北虎α干扰素的功能；
(d)、与SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21或SEQ IDNo.22所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有东北虎α干扰素的功能。
4.一种东北虎α干扰素，其特征在于，其氨基酸序列为(a)或(b)所示：
(a)、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32或SEQ ID No.33所示的氨基酸序列；
(b)、将SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32或SEQ IDNo.33所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有东北虎α干扰素功能的蛋白变体。
5.编码权利要求4所述东北虎α干扰素的基因。
6.按照权利要求5所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列为(a)、(b)、(c)或(d)所示：
(a)、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43或SEQ ID No.44所示的多核苷酸；
(b)、编码SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32或SEQ IDNo.33所示氨基酸序列的多核苷酸；
(c)、与SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43或SEQ IDNo.44的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有东北虎α干扰素的功能；
(d)、与SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、SEQ ID No.41、SEQ ID No.42、SEQ ID No.43或SEQ IDNo.44所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸，且该多核苷酸所编码蛋白质仍具有东北虎α干扰素的功能。
7.含有权利要求2或5所述基因的重组表达载体或重组宿主细胞。
8.权利要求1或4所述东北虎α干扰素或者权利要求2或5所述基因在制备抗病毒药物中的应用。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，所述病毒包括：水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus)或禽流感病毒(Avian influenza virus)。
10.一种抗病毒的药物组合物，其特征在于，包括：预防或治疗上有效量的权利要求1或4所述的东北虎α干扰素和药学上可接受的辅料或载体。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109776669A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-05-21 | 广州动物园 | 虎γ干扰素及其表达基因、制备方法和应用 |
| CN109929024A (zh) * | 2017-12-19 | 2019-06-25 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 羊λ3干扰素突变体及其制备方法和应用 |
| CN112661860A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-16 | 河南大学 | 一种虎长效干扰素及其制备方法和在抗流感病毒中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6482403B1 (en) * | 1998-05-29 | 2002-11-19 | Heska Corporation | Caniney IL-13 immunoregulatory proteins and uses thereof |
-
2016
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6482403B1 (en) * | 1998-05-29 | 2002-11-19 | Heska Corporation | Caniney IL-13 immunoregulatory proteins and uses thereof |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ANONYMOUS: "AIF73154.1", 《GENBANK》 * |
| ANONYMOUS: "ALN66631.1", 《GENBANK》 * |
| ANONYMOUS: "KJ790197.1", 《GENBANK》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109929024A (zh) * | 2017-12-19 | 2019-06-25 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 羊λ3干扰素突变体及其制备方法和应用 |
| CN109929024B (zh) * | 2017-12-19 | 2021-02-19 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 羊λ3干扰素突变体及其制备方法和应用 |
| CN109776669A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-05-21 | 广州动物园 | 虎γ干扰素及其表达基因、制备方法和应用 |
| CN112661860A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-16 | 河南大学 | 一种虎长效干扰素及其制备方法和在抗流感病毒中的应用 |
| CN112661860B (zh) * | 2020-12-25 | 2023-06-23 | 河南大学 | 一种虎长效干扰素及其制备方法和在抗流感病毒中的应用 |
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