CN106324183A - 一种土壤腐殖质的提取和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及土壤中腐殖质的提取方法，具体地说是一种土壤腐殖质的提取和纯化方法。将待提取样品依次用盐酸和氢氧化钠溶液充分震荡、溶解，促进待提取有机质在酸液和碱液中的溶解，而后分离纯化，即分别获得待提取样品不同的腐殖质。本发明是基于国际腐殖质协会提供的标准方法的改进结果，技术简单、适用性强，提取产物满足国际腐殖质协会提出的要求，同时采用本发明在不影响物质结构的基础上能将产物从土壤中实现最大化分离。

Description

一种土壤腐殖质的提取和纯化方法

技术领域

本发明涉及土壤中腐殖质的提取方法，具体地说是一种土壤腐殖质的提取和纯化方法。

背景技术

土壤腐殖质的定量提取、分离与纯化是深入研究土壤腐殖质的重要前提。对于土壤中腐殖质提取的方法研究，有很多报道，包括有机溶剂提取法、无机试剂提取法和有机/无机试剂混合提取法。丙酮、DMSO、Pyridine、二氧杂环己烷等有机溶剂提取的腐殖质提取产率低，产物多为分子量小的有机质，且部分有机提取剂最终很难与有机质完全分离(Hayes、Eloff等)。混合提取剂Na₄P₂O₇和EDTA提取法，产率较有机溶剂法高，但提取产物中灰分含量很大。无机试剂KOH、NaOH提取产物产量高，分子量大，能代表土壤中的有机质的整体性质，并且提取剂易于与产物分离，故其作为提取剂提取腐殖质的研究也越来越普遍。

由于缺少标准方法，在以往的研究中，土壤腐殖质的提取方法各有不同，提取剂、提取液剂量、提取次数、纯化方法的选择各有特点，使得研究的数据可比性较低。为了使腐殖质的研究数据更具可比性，国际腐殖质协会提出了一个国际标准方法IHSS method。

发明内容

本发明的目的在于提供一种土壤腐殖质的提取和纯化方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种土壤腐殖质的提取和纯化方法，将待提取样品依次用盐酸和氢氧化钠溶液充分震荡、溶解，促进待提取有机质在酸液和碱液中的溶解，而后分离纯化，即分别获得待提取样品不同的腐殖质。

将待提取样品用盐酸溶液充分超声震荡，使样品与盐酸充分溶解，离心，上清液为FA1组分，残渣沉淀中加入氢氧化钠溶液充分超声震荡，使残渣与氢氧化钠充分溶解，静置一夜,离心残渣为Hu1，碱溶性物质上清液中再加入盐酸溶液充分超声震荡，使上清液pH＝1，而后抽滤，残渣为HA，上清液为FA2；残渣HA再在N₂气氛下加入KOH进行重溶，而后离心，进一步得到腐殖质的粗提物。

将上述重溶离心后上清碱溶性物质HA粗产物加入盐酸充分超声震荡，使溶液pH＝1，静置而后离心，收集残渣至透析袋中经水反复透析直至加入AgNO₃检验时无Cl^-冷冻干燥，即得到HA。

所述收集残渣用体积比为1:20的HCL和HF的混酸溶解，室温下震荡，离心分离收集沉淀，进行去灰度处理，离心后收集的沉淀反复进行灰度处理4-7次后移入渗析袋中透析，直至加入AgNO3检验时无Cl^-冷冻干燥，即得到DHA。

将上述收集的FA1和FA2分别过XAD-8非离子交换树脂吸附，吸附后依次用去离子水、NaOH溶液和去离子水洗脱吸附于树脂上的富里酸组分，两部分收集洗脱液并加入HCl搅动，使收集液pH＝1，而后过1/5样品体积的XAD-8树脂柱吸附，吸附后依次用水和NaOH洗脱收集洗脱液，洗脱液溶液过3倍溶液Na⁺摩尔数的氢饱和IR1200阳离子交换树脂，冷冻干燥，即得FA。

所述pH＝1的收集液中加入浓度为0.3M的HF混匀后过1/5样品体积的XAD-8树脂柱吸附，吸附后依次用去离子水和NaOH洗脱收集洗脱液，洗脱液溶液过3倍溶液Na⁺摩尔数的氢饱和IR1200阳离子交换树脂，冷冻干燥，即得DFA。

将上述所得残渣Hu1和Hu2混合，混合后加入NaOH和去离子水溶解充分震荡，而后离心收集沉淀进行纯化，反复纯化，直至离心上清液呈无色透明，收集沉淀置于透析袋中经水反复透析直至加入AgNO₃检验时无Cl^-冷冻干燥，即得Hu。

上述直至离心上清液呈无色透明所收集得沉淀用体积比为1:20的HCL和HF的混酸溶解，室温下震荡，离心分离收集沉淀，进行去灰度处理，离心后收集的沉淀反复进行灰度处理4-7次后移入渗析袋中透析，直至加入AgNO3检验时无Cl^-冷冻干燥，即得到DHu。

本发明所具有的优点：

1.本发明流体运输装置提取腐殖质原材料其结构简单、适用性能强，有效避免人力物力的耗费，工厂大规模分离纯化腐殖质时，将装置放大，调节至合适的高度，可通过大气压力自动过非离子交换树脂柱纯化FA组分，降低生产成本。

2.本发明分别对腐殖酸、富里酸和胡敏素产物纯化分别进行灰化和未灰化处理，方便实验室理论研究灰分与有机质之间的作用。

3.采用本发明技术提取腐殖质，通过调节空瓶空隙体积和简单的抽滤，提高腐殖质提取产率，避免其中某一组分被另一组分的污染。

4.将胡敏素残留在土壤中进行纯化分析，克服用常规有机溶剂(DMSO/H₂SO₄)提取胡敏素破坏或改变胡敏素结构的缺陷，保证后期分析结果的准确性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的输液管处理示意图。

图2为本发明实施例提供的富里酸组分溶液靠输液管恒速转移至树脂中吸附的装置图。

图3为本发明实施例提供的同一土壤提取出HA、DHA、FA、DFA的红外光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

提取内蒙古草原地区土壤中的腐殖质，实施方式如下：

草原土壤预处理，将风干后的土样研磨过2mm孔径的筛子，混匀以备实验使用。

1)草原土壤腐殖质三组分的粗分离:

称取上述过2mm筛子的土样55g，置于600ml离心瓶中，再加入550mL0.13M的HCl充分摇匀，离心瓶中空出50mL的空瓶体积，震荡过程中促进瓶内液体剧烈震动，有利于土与提取剂充分接触，提高提取产率。室温下150W超声清洗仪中超声30min，然后在25℃恒温下以150rpm速率震荡1h，再于3500rpm转速下离心30min，下层残渣含有腐殖酸、富里酸和胡敏素的腐殖质。

上清液为土壤中部分被酸溶解的富里酸，标记该上清液为FA1；往残渣中加入2.86gNaOH固体和550mL去离子水混匀，室温下150W超声清洗仪中超声30min，25℃恒温下以120rpm速率震荡6h，静置一夜，于3500rpm转速下离心30min，残渣含有胡敏素组分标记为Hu1，碱溶性溶液中有腐殖酸(HA)、富里酸(FA)和部分通过腐殖酸和富里酸作为桥梁而转移到液相中的胡敏素(Hu)；碱性溶液中加入6MHCl，持续搅动使溶液pH＝7，震荡4h，析出溶液中的腐殖酸和胡敏素，3500rpm转速下离心30min分离，0.45um醋酸纤维素滤膜抽滤上清液，滤液为酸溶的富里酸标记为FA2；用0.3MKOH洗涤截留在滤纸上的腐殖酸，洗涤液继续用于溶解离心分离在瓶底的腐殖酸，将溶解在KOH的腐殖酸溶液转移至50mL离心管中，3500rpm转速下离心30min，上清液为腐殖酸粗产物HA1，离心管底部的残渣中含有胡敏素组分标记为Hu2。

2)腐殖质三组分的纯化分离：

腐殖酸HA1纯化：向上述腐殖酸粗产物HA1溶液里滴加6MHCl,持续搅动使pH＝1，悬浮液静置12h，使腐殖酸从溶液里充分析出，3500rpm转速下离心30min，上清液弃去，析出的残渣为HA组分。将腐殖酸组分分为两份，其中一份直接转移至透析袋中，在去离子水中渗析至无Cl^-，冷冻干燥，该部分产物标记为产物HA；另一份经去灰分处理，加入按体积比为1:20的浓度0.1M的HCL与浓度为0.3M的HF混酸，25℃下震荡7h，离心分离，上清液弃去，而后再加入浓度0.1M的HCL与浓度为0.3M的HF混酸反复去灰分过程重复3次，保证灰分被彻底去除。去灰分残渣移入渗析袋中，在去离子水中渗析至无Cl^-，冷冻干燥，该部分产物标记为产物DHA。

富里酸FA1和FA2纯化：上清液FA1、FA2组分分别过XAD-8非离子交换树脂，使富里酸分子吸附于XAD-8树脂上，废弃流出柱子的液体；依次用0.65倍柱体积去离子水、1倍体积0.1MNaOH溶液、2-3倍柱体积去离子水洗脱吸附于树脂上的富里酸组分，收集洗脱液；洗脱液中加HCl持续搅动，使pH＝1，洗脱液分两份，其中一份进行去灰分处理，向洗脱液中加入HF使其总浓度达到0.3M，标记为DFA洗脱液，另一份不经灰化处理标记为FA洗脱液；FA、DFA洗脱液分别过1/5样品体积的XAD-8树脂，废弃流出柱子的液体；依次用0.65倍柱体积去离子水、1倍体积0.1MNaOH洗脱树脂上的FA和DFA；FA和DFA洗脱液溶液过3倍溶液Na⁺摩尔数的氢饱和阳离子交换树脂，冷冻干燥，分别得到产物FA和DFA。

其中，富里酸组分输送到XAD-8非离子交换柱纯化的装置参见2，所述输送装置是将由图1所示的输送连接装置分别与XAD-8非离子交换柱以及承装富里酸组分的容器连接；

输送连接装置包括滴壶、导管和流速调节器组成，滴壶1两端连接有导管，任意一边与滴壶相连接的导管上设有流速调节器；其中，输送连接装置长度为35cm，导管为PVC材质的输液管，管外径4.2mm，内径3mm，截管长大于35cm。

流速调节器控制流体流速，通过滴壶里液滴的流速确定液体流速快慢。

使用发明的装置前需要一个特定的实验员持续往树脂漏斗里加富里酸酸溶液，通过使用发明的装置，调节特定的流速流体会恒速流过柱子，待吸附达到树脂承受容量时即进行洗脱。该装置在大批量提取实验中可减少人力的耗费。

胡敏素Hu1和Hu2纯化：混合粗分离产物中的残渣Hu1和Hu2，加0.1MNaOH溶液(土：水＝1:10)，恒温震荡4h，离心分离，弃去上清液；所得沉淀再加入NaOH溶液震荡离心，反复10-20次，直至上清液呈无色透明，使残留在土壤中的腐殖酸和富里酸组分充分析出；将Hu沉淀分为两份，其中一份直接移入透析袋，用去离子水透析直至滴入AgNO₃使溶液无AgCl沉淀生成，离心分离，将沉淀冷冻干燥得到Hu产物；另一份去灰分处理，加入按体积比为1:20的浓度0.1M的HCL和浓度为0.3M的HF的混酸洗脱液溶液过3倍溶液Na⁺摩尔数的氢饱和IR1200阳离子交换树脂，25℃下震荡7h，离心分离，上清液弃去，去灰分过程重复6次，保证灰分被彻底去除。去灰分残渣移入渗析袋中，在去离子水中渗析至透析直至滴入AgNO₃使溶液无AgCl沉淀生成，冷冻干燥，该部分产物标记为DHu产物。

实施例2

将上述实施例提取所得腐殖质有去灰分(DHA、DFA和DHu)和不去灰分(HA、FA和Hu)的产物，通过FTIR和滴定实验对其进行性质分析。

分别取DHA、HA、DFA和FA各1mg样品，将各样品分别和100mg的KBr混合，充分研磨后压片并放入红外干燥箱中干燥以去除样品中水分子的影响。在傅里叶变换红外光谱仪上测定，测定参数为：分辨率4cm^-1，测定范围4000-400cm^-1(参见图3)。

由图3可见，腐殖酸和富里酸分子都有相同的特征吸收峰，其中3600-3100cm^-1的宽峰为-OH(游离或缔合)、-NH的伸缩震动吸收峰，2960cm^-1、2850cm^-1分别为甲基或亚甲基的对称伸缩震动吸收峰，1725cm^-1为羰基伸缩震动吸收峰，1600-1580cm^-1为苯环骨架震动吸收峰，1460cm^-1处为甲基的反对称变形震动和亚甲基的变形震动吸收峰。由于腐殖质分子结构的复杂性，红外指纹区辅助定性准确性不是很高，故至考察了官能团区。对比HA、FA与DHA、DFA红外谱图发现，灰化前后产物均具有相同的特征吸收峰，但出峰强度确不相同，灰化产物弱于未灰化产物，进一步表明有机质中灰分的存在会影响有机质的化学行为。

腐殖酸和富里酸分子上羧基和酚羟基官能团含量滴定实验流程如下：

1)以0.1M NaCl作为背景电解质，用0.002M NaOH分散实施例1中提取的腐殖酸和富里酸，去离子水稀释分别配制0.08±0.01g.L^-1的腐殖酸和富里酸储备液；

2)取100mL储备液于250mL玻璃烧杯中用于滴定实验，滴定前加入2.27g0.0881MHCl准确中和储备液中用于分散腐殖酸和富里酸的NaOH(盐酸的加入使滴定液体积变化小于2％，即△V<2％)；

3)滴定体系浸于25℃恒温水浴，N₂鼓动下，以0.05MNaOH滴定体系，记录滴定过程中滴定液PH值随NaOH加入体积的变化，滴定剂加入体系pH稳定7s，pH变化不超过0.1时读取pH值。PH滴定范围：3-10.7，通过ModifiedHenderson Hasselbach model计算体系中羧基和酚羟基官能团的含量，方程如下：

$Q_{TOT}=\frac{Q_1}{1+{(H/K_1)}^{1/n_1}}+\frac{Q_2}{1+{(H/K_2)}^{1/n_2}}---\left(1\right)$

其中：Q₁、Q₂代指羧基和酚羟基含量；

logK₁、logK₂为分子中两类质子的logK平均值计算而来；

n₁、n₂为经验常数。

滴定数据在origin中拟合，最终求出腐殖酸和富里酸分子单位质量所含的羧基和酚羟基的量。

实验过程中分别对腐殖酸和胡敏素产物灰化前后量进行对比，灰化后总量损失1/4-1/3，通过酸碱滴定实验羧基和酚羟基官能团滴定结果见表-1。从滴定结果对比发现FA、HA产物未经灰化处理，产物中夹杂着大量无机矿物质，致使其单位质量羧基和酚羟基的含量比灰化产物含量低。

表-1产物滴定结果

Claims (8)

1.一种土壤腐殖质的提取和纯化方法，其特征在于：将待提取样品依次用盐酸和氢氧化钠溶液充分震荡、溶解，促进待提取有机质在酸液和碱液中的溶解，而后分离纯化，即分别获得待提取样品不同的腐殖质。

2.按权利要求1所述的土壤腐殖质的提取和纯化方法，其特征在于：将待提取样品用盐酸溶液充分超声震荡，使样品与盐酸充分溶解，离心，上清液为FA1组分，残渣沉淀中加入氢氧化钠溶液充分超声震荡，使残渣与氢氧化钠充分溶解，静置一夜,离心残渣为Hu1，碱溶性物质上清液中再加入盐酸溶液充分超声震荡，使上清液pH＝1，而后抽滤，残渣为HA，上清液为FA2；残渣HA再在N₂气氛下加入KOH进行重溶，而后离心，进一步得到腐殖质的粗提物。

3.按权利要求2所述的土壤腐殖质的提取和纯化方法，其特征在于：将上述重溶离心后上清碱溶性物质HA粗产物加入盐酸充分超声震荡，使溶液pH＝1，静置而后离心，收集残渣至透析袋中经水反复透析直至加入AgNO₃检验时无Cl^-冷冻干燥，即得到HA。

4.按权利要求3所述的土壤腐殖质的提取和纯化方法，其特征在于：所述收集残渣用体积比为1:20的HCL和HF的混酸溶解，室温下震荡，离心分离收集沉淀，进行去灰度处理，离心后收集的沉淀反复进行灰度处理4-7次后移入渗析袋中透析，直至加入AgNO3检验时无Cl^-冷冻干燥，即得到DHA。

5.按权利要求2所述的土壤腐殖质的提取和纯化方法，其特征在于：

将上述收集的FA1和FA2分别过XAD-8非离子交换树脂吸附，吸附后依次用去离子水、NaOH溶液和去离子水洗脱吸附于树脂上的富里酸组分，两部分收集洗脱液并加入HCl搅动，使收集液pH＝1，而后过1/5样品体积的XAD-8树脂柱吸附，吸附后依次用水和NaOH洗脱收集洗脱液，洗脱液溶液过3倍溶液Na⁺摩尔数的氢饱和IR1200阳离子交换树脂，冷冻干燥，即得FA。

6.按权利要求4所述的土壤腐殖质的提取和纯化方法，其特征在于：所述pH＝1的收集液中加入浓度为0.3M的HF混匀后过1/5样品体积的XAD-8树脂柱吸附，吸附后依次用去离子水和NaOH洗脱收集洗脱液，洗脱液溶液过3倍溶液Na⁺摩尔数的氢饱和IR1200阳离子交换树脂，冷冻干燥，即得DFA。

7.按权利要求2所述的土壤腐殖质的提取和纯化方法，其特征在于：将上述所得残渣Hu1和Hu2混合，混合后加入NaOH和去离子水溶解充分震荡，而后离心收集沉淀进行纯化，反复纯化，直至离心上清液呈无色透明，收集沉淀置于透析袋中经水反复透析直至加入AgNO₃检验时无Cl^-冷冻干燥，即得Hu。

8.按权利要求7所述的土壤腐殖质的提取和纯化方法，其特征在于：上述直至离心上清液呈无色透明所收集得沉淀用体积比为1:20的HCL和HF的混酸溶解，室温下震荡，离心分离收集沉淀，进行去灰度处理，离心后收集的沉淀反复进行灰度处理4-7次后移入渗析袋中透析，直至加入AgNO3检验时无Cl^-冷冻干燥，即得到DHu。