CN106309467B - 环二核苷酸cGAMP用于制备治疗颅脑创伤及其后遗症产品中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及cGAMP在制备预防、诊断、检测、保护、治疗和研究颅脑创伤及其后遗症的产品，尤其是药物和保健品中的新用途。经试验证实，cGAMP能够显著减少落重法致小鼠闭合性颅脑损伤后24h脑组织含水量，减轻脑水肿程度。cGAMP能够显著减少液压法致大鼠颅脑损伤后24h脑组织含水量，减轻脑水肿程度；Morris水迷宫结果显示cGAMP能够显著缩短液压法致大鼠颅脑损伤后21d的逃避潜伏期，结果表明：cGAMP对颅脑创伤急性期具有保护作用，也可改善颅脑创伤后的认知功能。

Description

环二核苷酸cGAMP用于制备治疗颅脑创伤及其后遗症产品中 的用途

技术领域

本发明是关于将环化-鸟嘌呤核苷酸-腺嘌呤核苷酸(cGAMP)用于制备治疗颅脑创伤及其后遗症的药物中的应用。

背景技术

颅脑外伤已成为发达国家青少年伤病致死的首位病因，随着国民经济和交通等发展，我国颅脑伤发生率和因颅脑伤致死残的伤员也逐年增加。2007年卫生部发布的《中国伤害预防报告》显示：我国每年约2亿人次受到各种伤害，死亡7O多万人，占死亡总人数的9％左右，成为第5位死亡原因。特别是创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)发生率逐年上升，且种类更为复杂，伤情更加严重，治疗更加困难。

《中国颅脑创伤病人脑保护药物治疗指南》(中国医师协会神经外科医师分会)为了指导我国神经外科医生正确使用脑保护药物治疗颅脑创伤病人，提出激素、钙离子拮抗剂、白蛋白、镁离子、谷氨酸拮抗剂、自由基清除剂、缓激肽拮抗剂、线粒体保护剂、神经生长因子等治疗药物。药物治疗的专家提出指导意见：1、超大剂量激素、镁制剂和超大剂量白蛋白存在增加急性颅脑创伤病人死亡率的风险，强烈不推荐使用。2、多种肽类脑神经营养药物在治疗颅脑创伤病人疗效方面，缺乏临床医学证据，建议慎用。3、钙拮抗剂(尼莫地平)、谷氨酸拮抗剂、自由基清除剂、缓激肽拮抗剂和线粒体功能保护剂治疗急性颅脑创伤病人无效，不推荐使用。临床上，颅脑创伤急性期治疗尚缺乏安全有效的药物，对颅脑创伤后遗症也缺少针对的药物，因此研发高效低毒的治疗颅脑创伤及其后遗症的药物具有重要意义。

cyclic GMP-AMP(cGAMP)是研究人员发现哺乳动物细胞的胞质提取物在有DNA存在的时候，能体外催化ATP和GTP形成cGMP-AMP,而有RNA存在时则不能。cGAMP结合干扰素基因激活蛋白(stimulator of lFN genes，STING)，使转录因子IRF3激活并产生β干扰素。研究人员指出，cGAMP是多细胞动物中第一种环二核苷酸，能充当内源第二信使，在应对胞质DNA时诱导干扰素的产生。目前，对第二信使cGAMP作用和功能的理解还非常有限。我们研究发现，cGAMP对颅脑创伤及其后遗症具有改善作用，并在实施例中公布了部分实验数据和分析结果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是公开cGAMP的一种新用途，即是明确CGAMP在治疗颅脑创伤及后遗症应用方面的活性，进而将其用于制备治疗颅脑创伤及其后遗症产品。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

(一)cGAMP活性

申请人在筛选治疗脑创伤的药物过程中，发现cGAMP具有显著的保护作用。

1、对落重法致小鼠闭合性颅脑损伤后脑水肿的影响

本发明通过20g砝码从60cm高处自由坠落砸小鼠大脑制备小鼠闭合性颅脑损伤模型，脑损伤后0.5h和12h尾静脉注射给药，脑损伤后24h测定脑组织含水量。实验发现cGAMP(10mg/kg，20mg/kg)2个剂量组能够显著减轻颅脑创伤后的脑组织含水量，表明其具有减轻颅脑创伤急性期脑水肿作用，可作为颅脑创伤的治疗药物。

2.对液压仪冲击致大鼠颅脑损伤后脑水肿的影响

本发明通过液压仪冲击制备大鼠颅脑损伤模型，脑损伤后0.5h和12h尾静脉注射给药，脑损伤后24h测定脑组织含水量。实验发现cGAMP(5mg/kg，10mg/kg)2个剂量组能够显著减轻颅脑创伤后的脑组织含水量，表明其具有减轻颅脑创伤急性期脑水肿作用，可作为颅脑创伤的治疗药物。

3.对液压仪冲击致大鼠颅脑损伤后认知功能的影响

本发明通过液压仪冲击制备大鼠颅脑损伤模型，脑损伤后21d通过Morris水迷宫实验测定大鼠认知功能。脑损伤后24h开始给药，腹腔注射，每天一次，连续给药21d。实验发现cGAMP(5mg/kg，10mg/kg)2个剂量组能够显著缩短颅脑创伤大鼠的逃避潜伏期，表明其具有改善颅脑创伤后大鼠认知功能的作用，可作为防治颅脑创伤后痴呆的药物。

(二)cGAMP的药物剂型和给药途径

本发明所述的cGAMP制备的用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究脑损伤及其后遗症的产品，能够用于预防、保护和治疗脑损伤及其后遗症；按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的治疗，既能够单独直接用于制备治疗的药物，也能够与许多化学物质进行混合或组合，直接或间接用于制备治疗的药物。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。

在本发明中，所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等，均应根据实际情况和需要，采用药用级的物料。

在具体使用方面，本发明所述的cGAMP能够单独使用，还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解cGAMP的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种；优选包括医药学上可接受的载体中的一种或多种。

本文使用的“医药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一种或多种。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。医药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种，它们增强了cGAMP的有效期或效力。

从具体的分类上看，所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体，包括赋形剂，如淀粉或水等中的一种或多种；润滑剂，如甘油或硬脂酸镁等中的一种或多种；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如淀粉或乳糖等中的一种或多种；粘接剂，如预胶化淀粉、糊精、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等中的一种或多种；渗透压调节剂，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；稀释剂，如水等；崩解剂，如琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠等中的一种或多种；吸收促进剂，如季铵化合物等；表面活性剂，如十六烷醇等；吸附载体，如高岭土或皂粘土等中的一种或多种；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇等中的一种或多种；另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂或甜味剂等中的一种或多种。

本发明所述的CGAMP，可以用本领域已知的各种方法给药，尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是注射给药，喷雾剂或口服给药。但是，技术人员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些具体实施中，该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如控释制剂，包括移植物传递系统、透皮贴传递系统或微囊传递系统等中的一种或多种。此外，还可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一种或多种。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知。

本发明所述的cGAMP用于治疗颅脑创伤后急性期脑损伤，通常是通过静脉，肌肉等注射给药，包括静脉注射，静脉滴注，静脉推注，肌肉注射等方式，因此制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它可注射制剂中的一种或多种，如粉针剂；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等中的一种或多种。

cGAMP的药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该CGAMP与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该cGAMP加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在该组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐或明胶)可以达到注射组合物的延长吸收。

本发明所述的cGAMP用于防治颅脑创伤后遗症如痴呆，通常通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药等中的一种或多种方式，施用于需要这种治疗的患者。

用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂或胶囊等中的一种或多种。在实施时，本发明cGAMP可以与惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。该cGAMP(和共它成分，如果需要)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药，可以将所述cGAMP与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、悬液、糖浆或糯米纸囊剂等等中的一种或多种形式使用。

为了以非肠道给药之外给予本发明cGAMP，可能需要用防止其失活的材料对该cGAMP包衣或与该cGAMP一同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在具体实施时，将本发明cGAMP与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配制和/或共给予。这种联合使用，可以优越地利用较低剂量的该给予的治疗药物，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。

以上药物或药物组合物可以各种途径使用，在所述的使用形式中，优选的形式是口服制剂(如片剂、包衣片剂、胶囊、溶液或混悬液等中的一种或多种)、非肠道给予剂型(如注射剂、软膏或贴剂等中的一种或多种)等中的一种或多种，进一步优选片剂、胶囊或注射剂等中的一种或多种，特别优选片剂或注射剂中的一种。

综上所述，本发明cGAMP或其组合物可用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究脑损伤及其直接相关疾病的产品，优选药物。

本发明的cGAMP具有安全低毒，药理作用较强的特点，可用于制备预防、诊断、检测、保护、治疗和研究颅脑创伤及其后遗症的产品。

通过实施例的方式进一步说明本发明，并不因此将本发明限制内在所述的实施例范围之中。

具体实施方式

实施例1：cGAMP的制备方法

cGAMP(环化-鸟嘌呤核苷酸-腺嘌呤核苷酸)按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化二核苷酸合成酶(cGAS)催化合成，纯度在98％以上。(Pingwei Li，et al.,Immunity,2013,39(6),1019-1031.)

实施例2：cGAMP在预防、诊断、保护和治疗颅脑创伤疾病方面的试验

1、动物

健康雄性ICR小鼠，体重18～20g；SD大鼠，体重220-250g。购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，质量合格证号(动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005)。饲养于清洁级动物房。

2、方法

①对落重法致小鼠颅脑损伤的影响

20g砝码从60cm高处自由坠落砸小鼠大脑，造成小鼠颅脑损伤模型。损伤后0.5h和12h尾静脉注射各给药1次，给药体积为20ml/kg。cGAMP组2组剂量分别为10、20mg/kg,阳性对照组给予单唾液酸四己糖神经节苷脂钠盐40mg/kg，模型组和正常对照组给予同等体积生理盐水。脑损伤24h存活小鼠用3％水合氯醛生理盐水溶液(10ml/kg小鼠体重)麻醉后取大脑。测定脑含水量：取脑组织称湿重后，置于160℃电热恒温鼓风干燥箱中24h烤干至恒重，称干重，按公式计算脑组织含水量(含水量＝(湿重-干重)/湿重×100)。

②对液压仪冲击致大鼠颅脑损伤后脑含水量的影响

方法：采用液压冲击法建立大鼠颅脑损伤模型。以10％水合氯醛生理盐水溶液(0.3ml/100g)腹腔注射将大鼠麻醉后，固定于立体定位仪上，于中线切开头皮，剥离骨膜，在前囟与人字缝尖中点偏左4mm处将颅骨钻孔，暴露硬脑膜，用牙科钻开一直径约4.8mm的骨窗，且保持硬脑膜完整，埋置打击管，聚羧酸锌水门汀将打击管固定后，连接液压打击仪，实施液压打击致伤，致伤能量为(174.01±9.09)kpa，致大鼠中度颅脑损伤。假手术组仅埋置打击管不实施打击，其他各组大鼠均实施打击。造模后0.5h和12h尾静脉注射各给药1次(1ml/100g大鼠体重)。cGAMP组2组剂量分别为5、10mg/kg,阳性对照组给予单唾液酸四己糖神经节苷脂钠盐20mg/kg，模型组和假手术组给予同等体积生理盐水。脑损伤24h存活大鼠用10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉各组大鼠后取大脑，测定含水量：取脑组织称湿重后，置于160℃电热恒温鼓风干燥箱中烤干至恒重，称干重，按公式计算脑组织含水量(含水量＝(湿重-干重)/湿重×100)。

③对液压仪冲击致大鼠颅脑损伤后认知功能的影响

采用液压冲击法建立大鼠颅脑损伤模型，Morris水迷宫实验测定大鼠的认知功能。以10％水合氯醛生理盐水溶液(0.3ml/100g)腹腔注射将大鼠麻醉后，固定于立体定位仪上，于中线切开头皮，剥离骨膜，在前囟与人字缝尖中点偏左4mm处将颅骨钻孔，暴露硬脑膜，用牙科钻开一直径约4.8mm的骨窗，且保持硬脑膜完整，埋置打击管，聚羧酸锌水门汀将打击管固定后，连接液压打击仪，实施液压打击致伤，致伤能量为(174.01±9.09)kpa，致大鼠中度颅脑损伤。假手术组仅埋置打击管不实施打击，其他各组大鼠均实施打击。造模后24h后腹腔注射给药(1ml/100g大鼠体重)，每天一次，连续给药30d。cGAMP组2组剂量分别为5、10mg/kg,模型组和假手术组给予同等体积生理盐水。Morris水迷宫实验测定脑损伤后21d存活大鼠的逃避潜伏期。大鼠脑缺血再灌注第25至30d进行大鼠Morris水迷宫实验。Morris水迷宫实验水迷宫由一黑色正圆形水槽(d＝160cm)组成，水槽中有一圆形平台(d＝12cm)，可供大鼠站立。实验前，水槽中灌水，水深没过平台2cm，水温24±1℃。在训练的第一天将大鼠置于平台上10s，使其了解此安全区域的存在。在定位航行实验中，将大鼠头朝水槽按顺序依次从4个象限放入水中，计时3min，大鼠找到平台并在其上停留10s后，计时自动停止，在3min内未找到平台的，将其引至平台，放置10s，引导其学习记忆。记录第五天大鼠从入水到爬上平台的时间为大鼠逃避潜伏期。

3、统计分析：实验数据以_x±SD表示，用SPSS10.0软件采用方差分析，进行差异的显著性检验。

4、实验结果：

①对落重法致小鼠颅脑损伤的影响

与假手术组相比，模型组小鼠脑含水量显著增加(P<0.01)，表明颅脑损伤后小鼠出现脑水肿；与模型组比较，cGAMP低剂量组和高剂量组和阳性对照单唾液酸四己糖神经节苷脂组均能显著降低脑组织含水量(P＜0.05,P<0.01)，表明cGAMP具有改善颅脑损伤脑水肿作用，提示其可作为颅脑创伤急性期的治疗药物。具体见表1。

②对液压仪冲击致大鼠颅脑损伤后脑含水量的影响

与假手术组相比，模型组大鼠脑含水量显著增加(P<0.01)，表明颅脑损伤后大鼠出现脑水肿；与模型组比较，cGAMP低剂量组和高剂量组和阳性对照单唾液酸四己糖神经节苷脂组均能显著降低颅脑创伤24h后脑含水量(P＜

0.05,P<0.01)，表明cGAMP具有改善颅脑损伤脑水肿作用，提示其可作为颅脑创伤急性期的治疗药物。结果见表2。

③对液压仪冲击致大鼠颅脑损伤后认知功能的影响

在Morris水迷宫进行的定位航行实验中，与假手术组相比，模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P<0.01)，表明大鼠颅脑创伤后认知功能降低；cGAMP低剂量组和高剂量组均能明显缩短逃避潜伏期，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，表明cGAMP具有改善颅脑创伤大鼠的学习记忆能力的作用，显示其具有防治颅脑创伤后痴呆的作用。详细数据见表3。

表1小鼠颅脑创伤24h后脑组织含水量(n＝10，_x±SD)

组别	剂量(mg/kg)	脑含水量(％)
			假手术组	-	70.1±0.5
模型组	-	73.1±0.4<sup>##</sup>
			cGAMP低剂量组	10	71.6±0.6<sup>*，#</sup>
cGAMP高剂量组	20	70.7±0.7<sup>**，#</sup>
			神经节苷脂组	40	71.4±0.6<sup>*，#</sup>

*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较；#P＜0.05，##P＜0.01与假手术组比较

表2大鼠颅脑创伤24h后脑组织含水量(n＝10，_x±SD)

组别	剂量(mg/kg)	脑含水量(％)
			假手术组	-	73.2±1.4
模型组	-	78.3±1.2<sup>##</sup>
			cGAMP低剂量组	5	76.7±1.3<sup>*，##</sup>
cGAMP高剂量组	10	75.4±0.9<sup>**，#</sup>
			神经节苷脂组	20	76.2±1.1<sup>**，#</sup>

*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较；#P＜0.05，##P＜0.01与假手术组比较

表3大鼠颅脑创伤后Morris水迷宫实验测定逃避潜伏期(n＝10，_x±SD)

组别	剂量(mg/kg)	逃避潜伏期(秒)
			假手术组	-	15.2±7.3
模型组	-	61.4±16.5<sup>##</sup>
			cGAMP低剂量组	5	42.7±12.6<sup>*，##</sup>
cGAMP高剂量组	10	33.6±13.8<sup>**，##</sup>
			神经节苷脂组	20	40.2±14.1<sup>*，##</sup>

*P＜0.05，**P＜0.01与模型组比较；#P＜0.05，##P＜0.01与假手术组比较

二、cGAMP在制备治疗颅脑创伤及后遗症产品方面的剂型

实施例1 cGAMP注射剂的制备

取cGAMP 10g，加入新鲜注射用水配成10000ml，加热至40℃，加入活性炭5g，充分搅拌，调节pH 5.5-7.5，经砂芯减压过滤，微孔滤膜精滤。半成品检查合格后灌封，灭菌，即得。每支注射剂(2ml)含cGAMP 20mg。

实施例2cGAMP片剂的制备

取cGAMP 30g、淀粉6g、乳糖8g,粉碎过80目筛，混匀。加入适量50％乙醇拌匀，制成颗粒，60℃以下干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁混匀，压片。可制成1000片(每片含30mgcGAMP)的片剂。

实施例3cGAMP胶囊的制备

取处方量cGAMP 30g，粉碎过80目筛，加入处方量的淀粉14g、微粉硅胶1g中，混匀，直接装入胶囊，可制成1000粒。每粒含30mg cGAMP。

Claims (1)

1.cGAMP在制备防治颅脑创伤后脑水肿及改善其认知功能药品中的应用。