CN106290891B - Galectin-3的检测方法及检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种表面包被苯乙烯的量子点及其制备方法、荧光免疫层析检测Galectin‑3的方法及检测试纸条。本发明所述量子点表面包被苯乙烯，能够在特殊化学试剂的作用下将蛋白、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到量子点纳米颗粒的表面，便于和抗体/抗原的偶联反应。另外减少量子点和蛋白质的直接接触，同时避免能量共振转移的发生，使检测体系更加稳定。本发明所述Galectin‑3的检测方法及检测试纸条利用表面包被苯乙烯的量子点作为指示物能够在免疫层析试纸条上实现Galectin‑3的定量检测。本发明的检测方法适于单个样本快速定量检测，操作简便，报告速度快，检测仪小型便携。

Description

Galectin-3的检测方法及检测试纸条

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，表面包被苯乙烯的量子点及其制备方法、利用表面包被苯乙烯的量子点作为指示物进行荧光免疫层析检测Galectin-3的方法及检测试纸条，用于Galectin-3的定量检测。

背景技术

心力衰竭(HF)为各种心脏疾病的终末期表现和最主要的死因，是21世纪心血管领域的两大挑战之一。随着年龄的增加，HF患病率迅速增加，70岁以上人群患病率更上升至10％以上，HF患者4年死亡率达50％，严重HF患者1年死亡率高达50％，而年龄校正的HF死亡率亦呈上升趋势。尽管HF治疗有了很大进展，HF患者死亡数仍在不算增加。据调查发现，各年龄段HF死率均高于同期其他心血管疾病。因此，如何早期识别和诊断HF，评估高危患者的近期和远期预后，针对心肌重塑的机制，积极进行治疗，防止和延缓心肌重塑的发展，从而降低心力衰竭的死亡率和住院率，成为当前HF领域的主要研究课题。寻找一种有效的生物标志物，可用于HF的诊断，严重程度的分级，治疗方案的选择，治疗效果的监测，以及预后的评估，成为医学工作者积极努力的方向。BNP和NT-proBNP是目前临床上用于HF诊断、治疗的主要生物标志物。但由于BNP和NT-proBNP易受年龄、肾功、缺氧、感染等诸多因素影响，特异性不高。最近有研究表明，Galectin-3在HF病理生理方面有一定的作用，有望成为新的HF标志物。

Galectin-3是一种可溶性凝集素，属于半乳糖凝集素家族，拥有特异性β-半乳糖苷连接区，在调节炎症和免疫反应方面具有重要作。Galectin-3具有多种功能，如参与增生、凋亡、细胞粘附、血管生成和肿瘤转移，但到目前为止其最重要的功能是促进纤维化。Galectin-3在心肌细胞的表达很低，几乎检测不到，但是，心脏成纤维细胞可表达高水平的Galectin-3。对鼠肥大的心肌进行免疫组化分析显示Galectin-3主要定位于细胞外基质、成纤维细胞和巨噬细胞。在病理性肥大的心肌和活动性心肌炎的模型中，发现表达Galectin-3的活化的巨噬细胞的显著的心肌浸润。Sharma等研究显示进行外源重组Galectin-3的心包注射，可刺激巨噬细胞的迁移、成纤维细胞增生、胶原生成和Galectin-3在成纤维细胞核内连接位点的增多。该效应可被同时注射Ac-SDKP(N乙酰丝氨酰天冬氨酰赖氨酰脯氨酸)所阻滞。Galectin-3可能通过细胞周期的重要调控因子cyclin D1诱导心肌成纤维细胞的增生。大量研究显示Galectin-3对HF患者的临床诊治和管理具有潜在价值，有望成为继BNP和NT-proBNP之后HF的又一重要生物标志物。

现有的Galectin-3检测方法主要有酶联免疫吸附法、化学发光法、酶联免疫荧光法。其中酶联免疫吸附试验(ELISA)不适于单个标本快速检测，且操作复杂，需要专业技术人员。化学发光法需要配备化学发光检测仪，大型仪器设备成本高，占地大，不够便携、简便。现有报导bioMérieux公司的应用酶联免疫荧光法在Vitek Immuno-Diagnostic AssaySystem进行检测，也是需要大型仪器，成本高，不够简便。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对上述问题，提供一种表面包被苯乙烯的量子点及其制备方法、利用表面包被苯乙烯的量子点作为指示物进行荧光免疫层析检测Galectin-3的方法及检测试纸条。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。

一种量子点，其特征在于，量子点表面包被苯乙烯。

免疫层析技术是20世纪80年代初发展起来的一种新型免疫检测技术。目前免疫层析已经能够很方便地应用于诸如：人体及动植物疾病研究和诊断、工农业质量检验、环境卫生监测、食品卫生安全检验等各种检测领域。它的出现大大地简便了人们的检测行为。

在传统的免疫层析系统中，用作可视或可被仪器检测的指示物质通常包括胶体金，胶体硒，乳胶颗粒，碳颗粒和量子点等物质。量子点是近20年来发展起来的半导体纳米晶材料，与普通的荧光染料相比较，量子点具有以下特点：(1)量子点的激发波长的范围很宽，产生窄(半波宽约13nm)而对称的发射光谱。(2)不同粒径大小的量子点具有不同的颜色，可以用同一波长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记，是一类理想的荧光探针。(3)量子点的荧光强度强，量子点的荧光强度比最常见的有机荧光材料“罗丹明6G”高20倍，它的稳定性更是“罗丹明6G”的100倍以上。(4)抗光漂白强。(5)生物相容性好，标记后对生物大分子的生理活性影响很小，因此为研究生物大分子之间的长期作用提供了可能。(6)较大的斯托克斯位移。量子点的荧光寿命可持续长达数十纳秒(20ns-50ns)，这使得当光激发数纳秒以后，大多数的自发荧光背景已经衰减，而量子点荧光仍然存在，此时即可获得无背景干扰的荧光信号。基于量子点以上特点，用量子点代替目前的指示物质，能使得免疫层析检测实现定量，而且灵敏度高，干扰少。

本发明所述量子点表面包被苯乙烯，其表面为羧基基团，能够在特殊化学试剂(如EDC)的作用下将蛋白、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到量子点纳米颗粒的表面。另外将量子点包被在苯乙烯内部，一定程度上减少量子点和蛋白质的直接接触，同时避免能量共振转移的发生，使检测体系更加稳定。

其中，所述量子点的核心选自ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP，且可掺杂Cu、Mn和Hg。

在免疫层析技术中，指示物质的粒径大小是个很关键的参数。如果粒径太小，会大大降低免疫层析的检测灵敏度；如果粒径过大，无法在硝化纤维膜上进行正常层析或者层析速度大幅度降低，从而影响检测的快速；另外大粒径指示物质由于层析速度慢，通过硝化纤维膜的孔隙尤其是抗体固定处的时候容易导致假阳性。因此，对量子点的粒径控制在合适的范围之内以保证灵敏度与检测速度的均衡就显得极为重要。本发明所述量子点的粒径优选为50nm～500nm。

在一些实施方案，所述量子点的粒径为100nm。

本发明还提供了所述表面包被苯乙烯的量子点的制备方法，具体包括以下步骤：

1)量子点加入去离子水、苯乙烯、甲基丙烯酸和表面活性剂，超声1h；

2)在氮气存在条件下，80℃搅拌10min，加入二硫酸钾作为引发剂，在80℃搅拌反应4h。

其中，优选的，每1mL量子点溶液加入80mL去离子水、5mL苯乙烯、0.3mL甲基丙烯酸和0.5g表面活性剂，超声1h。

其中所述表面活性剂优选为Tween-20。

本发明所述表面包被苯乙烯的量子点的制备方法中所述量子点可以采用现有技术中任意一种方法合成。

在一些实施方案中，本发明采用水相法合成量子点。

在一些实施例中，所述水相法合成量子点具体包括以下步骤：

a)称取0.5g的Te粉，置于研钵中研磨成分散的细粉，加入0.5g的NaHB_4，倒入到10mL的75％的乙醇水溶液中，用胶塞密封，一面往液面下通氮气，一面在液面上抽真空半小时；

b)停止抽真空，继续通氮气，置于40℃的水浴中搅拌反应30min。

c)将0.05g巯基乙酸和0.5gCdCl₂混合。

d)将步骤b产物加入步骤c中，搅拌下反应30min。

本领域技术人员可以通过改变步骤b)中的搅拌时间，可以更好的控制量子点粒径。

本发明还提供了一种Galectin-3的检测方法，以本发明所述表面包被苯乙烯的量子点作为指示物进行荧光免疫层析。

其中，所述荧光免疫层析中所量子点激发波长均365nm，发射波长为500nm。

进一步的，所述检测方法中所述荧光免疫层析数据采用lg-logit-4P函数数据处理程序处理。

本发明还提供了一种Galectin-3检测试纸条，包括依次设置的样品区、结合物释放区、反应区和吸水区；所述结合物释放区为包被抗人Galectin-3单克隆抗体标记的本发明所述表面包被苯乙烯的量子点和兔IgG标记的本发明所述表面包被苯乙烯的量子点的混合物的结合垫；所述反应区为分为测试区和控制区，所述反应区为测试区包被抗人Galectin-3多克隆抗体溶液、控制区包被羊抗兔IgG抗体的固体支持物。

即本发明所述结合物释放区为包被抗人Galectin-3单克隆抗体标记的量子点和兔IgG标记的量子点的混合物的结合垫。其中所述量子点为本发明所述表面包被苯乙烯的量子点。

进一步的，在一些实施方案中，本发明所述检测试纸条还包括背衬，所述样品区、结合物释放区、反应区和吸水区依次相互搭接的粘贴在背衬上。

其中，所述抗人Galectin-3单克隆抗体标记的表面包被苯乙烯的量子点的制备方法包括以下步骤：

I、取2mg苯乙烯包被的量子点于1.5mL离心管中，加入500μL活化缓冲液，洗涤量子点2次，离心后，移除上清；

II、向量子点纳米颗粒中分别加入200μL 5mg/mL的EDC与200μL5mg/mL的NHS，漩涡混均使充分悬浮，37℃活化30分钟，该期间保持量子点纳米颗粒的悬浮状态；

III、活化后，用MEST buffer洗涤除去未反应的活化剂，再更换离心管，并用MESTbuffer洗涤量子点纳米颗粒两遍；超声分散，100W，1min，3s，3s；

IV、将25μL的6mg/mL的抗人Galectin-3单克隆抗体加入到上述的离心管中，用偶联缓冲液调节总体积至500μL，轻柔混匀量子点纳米颗粒和抗体；

V、37℃偶联至少3小时，将抗体偶联于量子点纳米颗粒表面，得到免疫量子点纳米颗粒，偶联完成后收集反应上清液用BCA试剂盒检测偶联蛋白量；

VI、加入500μL的封闭液对免疫量子点纳米颗粒表面没有完全反应的活化基团进行封闭，室温下封闭反应30分钟；

VII、用偶联缓冲液洗涤封闭后的免疫量子点纳米颗粒四次(第一次需换管，一定要洗涤干净，每次洗涤时要将量子点纳米颗粒重悬)，最后将量子点纳米颗粒重悬在500μL保存液中。

按照上述抗人Galectin-3单克隆抗体标记的表面包被苯乙烯的量子点的方法制备所述兔IgG标记的表面包被苯乙烯的量子点，加入兔IgG的量为150μg。

其中，步骤I所述活化缓冲液为MEST(10mM MES，pH6.0，0.05％Tw een20)。

本发明所述步骤I中EDC和NHS优选采用活化缓冲液现配现用。

步骤IV中所述偶联缓冲液为0.05M pH 8.0硼酸缓冲液。

步骤VI中加入封闭液进行封闭以封闭其它的空间位点，降低在以后试验中可能发生的非特异性吸附。其中10倍浓缩封闭液配方为0.5M Tris-HCl缓冲液，1％Tween-20，10％BSA。

步骤VII中用PBST洗涤封闭后的免疫量子点纳米颗粒，其中第一次需换管，以保证洗涤干净，且每次洗涤时要将量子点纳米颗粒重悬。

步骤VII中所述保存液的配方为0.05M硼酸缓冲溶液10mL，Tween-20 0.05ml，BSA0.02g。

优选的，本发明Galectin-3检测试纸条中所述样品区、结合物释放区的结合垫均为玻璃纤维素膜。

本发明Galectin-3检测试纸条中所述反应区的固体支持物优选为硝酸纤维素膜。

本发明Galectin-3检测试纸条中所述吸水区为吸水纸。

本发明还提供了所述Galectin-3检测试纸条的制备方法，包括：

步骤1：将人Galectin-3单克隆抗体标记的包被苯乙烯的量子点和兔IgG标记的包被苯乙烯的量子点混合，喷涂在结合物释放垫上获得结合物释放区；

步骤2：将抗人Galectin-3多克隆抗体和羊抗兔IgG抗体喷涂在反应区的固体支持物上，分别形成测试区、控制区获得反应区；

步骤3：将样品区、结合物释放区、反应区和吸水区依次相互搭接粘贴即得。

优选的，所述样品区、结合物释放区、反应区和吸水区依次相互搭接粘贴在背板上。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种表面包被苯乙烯的量子点及其制备方法、利用表面包被苯乙烯的量子点作为指示物进行荧光免疫层析检测Galectin-3的方法及检测试纸条。本发明所述量子点表面包被苯乙烯，能够在特殊化学试剂(如EDC)的作用下将蛋白、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到量子点纳米颗粒的表面，便于和抗体/抗原的偶联反应。另外将量子点包被在苯乙烯内部，一定程度上减少量子点和蛋白质的直接接触，同时避免能量共振转移的发生，使检测体系更加稳定。本发明所述Galectin-3的检测方法及检测试纸条利用表面包被苯乙烯的量子点作为指示物能够在免疫层析试纸条上实现Galectin-3的定量检测。本发明的检测方法，适于单个样本快速定量检测，操作简便，报告速度快，检测仪小型便携，非专业人员经简单培训即可操作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1没有包被苯乙烯CdTe量子点和BSA混合前后的荧光强度，横坐标是波长/nm，线条1为CdTe量子点(没有包被苯乙烯)本身，线条2是CdTe量子点(没有包被苯乙烯)本身和BSA混合后的荧光强度，说明偶联蛋白荧光会变；

图2示实施例2不同内径量子点对检测结果的影响图；

图3示实施例4抗体加入量对偶联结果的影响图；

图4示实施例6中的免疫层析试纸条的结构示意图，其中A为主视图，B为侧视图；

图5示实施例7中的血浆Galectin-3量子点免疫层析标准曲线；

图6示实施例8中血浆Galectin-3量子点免疫层析试纸条的线性测定结果图；

图7示实施例8中Galectin-3量子点免疫层析试剂盒与ELISA试剂盒的相关性实验结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中MES、NHS、EDC均购自PIERCE公司，Tween-20购自BBI公司，氯化钾购自上海化学试剂有限公司，四硼酸钠、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均购自国药集团化学试剂有限公司，硼酸、BCA蛋白定量检测试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，牛血清白蛋白(BSA)购自北京鼎国生物技术有限公司，抗人Galectin-3多克隆抗体和抗人Galectin-3单克隆抗体由R&D Systems，Inc公司提供。Galectin-3 ELISA检测试剂盒由Affymetrix,Inc提供。HF患者的异常高值血浆1份Galectin-3浓度为163.97ng/mL，由青岛大学附属医院提供。

实施例1：量子点的包被

苯乙烯包被CdTe/Polyrene量子点的制备方法：

1、称取0.5g的Te粉，置于研钵中研磨成分散的细粉。

2、加入0.5g的NaHB₄。

3、倒入到10mL的75％的乙醇水溶液中，用胶塞密封。一面往液面下通氮气，一面在液面上抽真空半小时。

4、停止抽真空，继续通氮气，置于40℃的水浴中搅拌反应30min。

5、将0.05g巯基乙酸和0.5gCdCl₂混合。

6、将步骤4产物加入步骤5中，搅拌下反应30min。

7、取步骤6的产物1mL，加入80mL去离子水，5mL苯乙烯，0.3mL甲基丙烯酸，0.5g的表面活性剂，超声1h。

8、通氮气，置于80℃的水浴中搅拌10min。

9、加入0.03g的二硫酸钾作为引发剂，在80℃的水浴中搅拌反应4h。

如下图1所示：没有包被苯乙烯CdTe量子点和BSA结合前、后荧光强度会发生变化，说明偶联蛋白荧光会变。

实施例2：量子点粒径的选择

选用100nm、220nm、500nm的三种不同内径的实施例1制备的苯乙烯包被CdTe/Polyrene量子点建立荧光免疫层析方法，检测0.47ng/mL的血浆Glectin-3检测20次，观察其检测的CV，确定不同内径量子点的检测灵敏度。结果显示，3种量子点的灵敏度0.47ng/mL，CV没有显著性差异。

对HF患者的Galectin-3异常高值血浆(163.97ng/mL)进行稀释，得到不同血浆浓度的Glectin-3，进行检测，观察不同内径的量子点对检测的影响。实验结果见表1和图2。

表1：不同内径的量子点对检测结果范围的影响

结果显示500nm的苯乙烯包被量子点出现了hoke现象，而100nm的量子点的检测范围最好。实验结果表明三种量子点中100nm的量子点检测性能最好，所以本实验选用100nm的量子点进行下一步的实验。

实施例3：免疫量子点纳米颗粒的制备

1、取2mg苯乙烯包被的量子点纳米颗粒于1.5mL离心管中，加入500μL活化缓冲液(10mM MES，pH6.0，0.05％Tween20)，洗涤量子点2次，离心后，移除上清；

2、向量子点纳米颗粒中分别加入200μL(5mg/mL)EDC(活化缓冲液现配现用)与200μL(5mg/mL)NHS(活化缓冲液现配现用)，漩涡混均使充分悬浮，37℃活化30分钟，该期间保持量子点纳米颗粒的悬浮状态；

3、活化后，用MEST buffer洗涤除去未反应的活化剂，再更换离心管，并用MESTbuffer洗涤量子点纳米颗粒两遍。

4、将25μL的6mg/mL的抗Galectin-3单克隆抗体加入到上述的离心管中，用偶联缓冲液(0.05M pH 8.0硼酸缓冲液)调节总体积至500μL，轻柔混匀量子点纳米颗粒和抗体；

5、37℃偶联至少3小时，将抗体偶联于量子点纳米颗粒表面，得到免疫量子点纳米颗粒。

6、加入500μL的封闭液对免疫量子点纳米颗粒表面没有完全反应的活化基团进行封闭，封闭其它的空间位点，以降低在以后试验中可能发生的非特异性吸附。室温下封闭反应30分钟。

7、用偶联缓冲液洗涤封闭后的免疫量子点纳米颗粒四次(第一次需换管，一定要洗涤干净，每次洗涤时要将量子点纳米颗粒重悬)，最后将量子点纳米颗粒重悬在500μL保存液(0.05M硼酸缓冲溶液10mL，Tween-20 0.05ml，BSA0.02g)中。

兔IgG标记的包被苯乙烯的量子点制备同上，加入兔IgG的量为150μg。

实施例4：抗体加入量对实验结果的影响

在相同的包被苯乙烯的量子点纳米颗粒被活化后，加入不同的抗Galectin-3抗体量(80μg、160μg、320μg)进行偶联，考察抗体加入量对线性和灵敏度的影响。结果见表2和图3。

表2抗体加入量对实验结果的影响

结果显示，随着加入抗体量的增加，线性和灵敏度都有所提高，但加入抗体量的增加会增加实验成本，所以实验选用320μg抗体进行偶联。

实施例5：质控量子点的制备

质控量子点的制备同实施例3，其中偶联的蛋白为兔IgG，加入量为150μg。

实施例6：免疫层析试纸条的制备

1、部件的剪裁

用裁切机将NC膜、结合垫、样品垫、吸收垫裁成长度为2.5cm、0.5cm、1.5cm、1.5cm的长条。

2、包被抗体的喷点

用划膜仪以1μL/cm的量将1.5mg/mL的抗人Galectin-3多克隆抗体溶液(抗体溶解于PBS中，溶液中蔗糖含量为0.1-1％)点于检测线(T线)上；所有的膜均放于干燥密闭的37℃真空烘箱中烘烤30分钟，取出后放于干燥皿中待用。

将1.5mg/mL的羊抗兔Ig抗体溶液点于质控线(C线)上。

3、结合垫的制备

结合垫预处理：将玻璃纤维浸泡在结合垫处理液(PBS：0.01M；BSA：2％(w/v)；Tween20：1.0％(w/v)；蔗糖：2.5％(w/v)；PVP-K30：0.3％(w/v))，然后干燥密闭的37℃真空烘箱中烘烤30分钟备用。

Galectin-3单克隆抗体标记的包被苯乙烯的量子点和兔IgG标记的包被苯乙烯的量子点等量混合。

用自动划膜仪喷嘴按9μL/cm移液枪吸取20μL免疫微球稀释液(BST buffer；蔗糖：10％(w/v)；海藻糖：2.0％(w/v)1.0％Tween20)稀释后的上述量子点混合物(稀释度800倍)均匀点于结合垫上，将结合垫放于干燥密闭的37℃真空烘箱中烘烤30分钟，取出后放于干燥皿中，即为可用的结合垫。4、样品垫的处理

将不同效应物质(包括调节量子点纳米颗粒稳定性的高分子物质如：EG/PVP/BSA，表面活性剂，盐类等)溶解于PBS溶液中，作为样品垫处理液，取一定数量的样品垫浸泡于处理液中一段时间，将浸泡后的样品垫放于干燥密闭的37℃真空烘箱中烘烤2小时后取出放于干燥皿中，为可用的样品垫。

5、试纸条的组装

根据免疫层析试纸条的结构示意图按次序组装试纸条，NC膜、吸水垫、结合垫和样品垫被依次固定在粘性背板上，并且相邻的垫子部分互相重叠，然后切割成每条0.4cm宽的试纸，装入塑料卡即可进行测试，亦可密封保存于防潮柜(25℃，25-30％RH)，备用。

实施例7：Galectin-3的检测

配制30.00ng/mL、15.00ng/mL、7.50ng/mL、3.75ng/mL、1.88ng/mL、0.94ng/mL、0.47ng/mL的一系列不同浓度的待检溶液和空白溶液，取60μL，加入到实施例6制得的试纸卡上的加样孔内，立即插入荧光定量分析仪，反应3-15min，具体时间根据C线上的读数达到设定的预置即可读取结果，每个浓度测两遍取平均；通过对每个荧光信号对应浓度做标准曲线(见图5)，建立荧光信号-被测物浓度之间的数学模型，再将待检未知样品进行同样处理，从而得出Galactin-3的定量结果。数学模型选用lg-logit 4P拟合曲线。

实施例8：精密度实验

用0.47、3.75、30.00ng/mL的校准液连续测定20d，每天测定三次，计算日内及日间精密度。测定结果表明0.47ng/mL日内不精密度为9.74％，日间不精密度为8.92％。3.75ng/mL日内不精密度为5.08％，日间不精密度为6.60％。30.00ng/mL日内不精密度为3.18％，日间不精密度为4.66％，这些测定结果表明此试剂盒的精密度可满足临床要求。

实施例9：线性实验

取患者的异常高值血浆1份(163.97ng/mL)和正常人血浆1份(16.28ng/mL)，取等体积的异常高值血浆和正常人血浆混合构成第一混合物，取等体积的异常高值血浆和第一混合物混合构成第二混合物，取等体积的第一混合物和正常人血浆混合构成第三混合物。按照实施例7的方法测定异常高值血浆、正常人血浆、第一混合物、第二混合物和第三混合物中Galectin-3的含量，结果如图6所示。测定结果表明，该试剂盒血浆稀释效应不明显，具有良好的线性。

实施例10：抗干扰性实验

在正常人血浆(16.28ng/mL)中各自添加一定量的胆红素、牛血红蛋白、脂肪乳剂和类风湿因子，使其达到表3中所示的浓度，同时加入同等体积的去离子水作为无干扰物血浆，按照实施例7的方法同时测定这些标本的浓度，结果见表3。

表3血浆Galectin-3量子点免疫层析试剂盒抗干扰检测

表1的结果表明以干扰程度为10％作为该测定系统对干扰物的最高忍受限，血浆中抗坏血酸在4.5g/L，胆红素在500μM以下，血红蛋白在5g/L以下，脂肪乳剂在0.3％以下，肝素钠在62.5U/mL以下，类风湿因子在100IU/mL以下，均不影响测定。

实施例11：回收实验

在200μL正常人血浆(16.28ng/mL)中分别添加20、50、100μL的30.00ng/mL的高标校准液和水(去离子水)，计算回收率。其中回收率计算公式如下：

理论回收量(ng/mL)＝30×高标校准液体积/(血浆体积+高标校准液体积)实际回收量(ng/mL)＝添加一定体积高标校准液的测定值-添加相应体积去离子水的血浆测定值

表4回收实验测定结果

上述结果显示在16.28ng/mL的血浆中添加不同体积的线性高标校准液，在不同的测值水平都具有较好的回收率(89.3％～112.8％)，表明本发明所述检测方法的准确度良好。

实施例12：加速稳定性实验

取实施例6制备的量子点Galectin-3免疫层析试纸条放入30℃温箱，分别在第3d、7d、10d、14d取出，按照实施例7的方法测定定值质控中血浆Galectin-3的含量。结果见表5。

表5 30℃加速稳定性

表5结果显示在30℃温箱中放置14d后，仍可获得准确的测定结果。由此可推断该量子点Galectin-3免疫层析试纸条的正常储存期可达12个月。

实施例13：相关性实验

收集80例血浆，其中50例为正常人血浆，30例HF患者血浆，Galectin-3量子点免疫层析检测结果与Affymetrix,Inc的Galectin-3ELISA检测试剂盒检测结果进行相关性比较。

结果显示本发明所述Galectin-3量子点免疫层析检测法与传统的ELISA试剂盒的相关性(n＝80，r＝0.998)良好，两者对血浆Galectin-3的检测准确性相同(图7)。

实施例14：正常参考值范围

选取100名年龄在19～52岁健康献血员标本用实施例7所述检测方法进行血浆Galectin-3测定，表观正常人群第90百分位数、第95百分位数、第97.5百分位数分别是16.50ng/mL、19.18ng/mL和23.10ng/mL。

实施例15：临床检测的灵敏度与特异性

选择21例HF患者(HF组)和36例正常体检病人(正常组)血浆，按照实施例7所述检测方法检测血浆中的Galectin-3，以0～23.10ng/mL为参考值范围确定阳性数和阴性数，结果如表6。

表6灵敏度与特异性检测

分组	例数	Galectin-3(mg/L)	阳性数	阴性数	灵敏度(％)	特异性(％)
							HF组	21	39.66±2.76	21	0	100	-
正常组	36	19.1±0.15	1	99	-	99.17

实验结果显示HF组的测定值显著高于正常组(P<0.01)，表明本发明所述检测方法的灵敏度达100％，特异性为96.96％。

Claims (10)

1.一种量子点，其特征在于，量子点表面包被聚苯乙烯；所述量子点的粒径为50nm ~500nm；

所述量子点的制备方法，包括以下步骤：

1）量子点加入去离子水、苯乙烯、甲基丙烯酸和表面活性剂，超声1h；

2）在氮气存在条件下，80℃搅拌10min，加入二硫酸钾作为引发剂，在80℃搅拌反应4h。

2.根据权利要求1所述的量子点，其特征在于，所述量子点的核心选自ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs或InP。

3.根据权利要求1所述的量子点，其特征在于，所述量子点的核心选自ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs或InP，且掺杂Cu、Mn 和Hg。

4.权利要求1-3任意一项所述量子点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）量子点加入去离子水、苯乙烯、甲基丙烯酸和表面活性剂，超声1h；

2）在氮气存在条件下，80℃搅拌10min，加入二硫酸钾作为引发剂，在80℃搅拌反应4h。

5.根据权利要求4所述量子点的制备方法，其特征在于，每1 mL水相法合成的量子点溶液加入80mL去离子水、5mL苯乙烯、0.3mL甲基丙烯酸和0.5g表面活性剂，超声1h。

6.一种Galectin-3的检测方法，其特征在于，以权利要求1-3任意一项所述量子点作为指示物进行荧光免疫层析。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，荧光免疫层析数据采用lg-logit法函数和四参数lg-logit-4P 函数数据处理程序处理。

8.一种Galectin-3检测试纸条，其特征在于，包括依次设置的样品区、结合物释放区、反应区和吸水区；所述结合物释放区为包被抗人Galectin-3单克隆抗体标记的权利要求1-3任意一项所述量子点和兔IgG标记的权利要求1-3任意一项所述量子点的混合物的结合垫；所述反应区为分为测试区和控制区，所述反应区为测试区包被抗人Galectin-3多克隆抗体溶液、控制区包被羊抗兔IgG抗体的固体支持物。

9.根据权利要求8所述的Galectin-3检测试纸条，其特征在于，所述样品区、结合物释放区的结合垫均为玻璃纤维素膜；所述反应区的固体支持物为硝酸纤维素膜；所述吸水区为吸水纸。

10.权利要求8-9任意一项所述Galectin-3检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：将抗人Galectin-3单克隆抗体标记的权利要求1或2所述量子点和兔IgG标记的权利要求1或2所述量子点的混合物喷涂在结合物释放垫上获得结合物释放区；

步骤2：将抗人Galectin-3多克隆抗体和羊抗兔IgG抗体喷涂在反应区的固体支持物上，分别形成测试区、控制区获得反应区；

步骤3：将样品区、结合物释放区、反应区和吸水区依次相互搭接粘贴即得。