CN106282166A - 一种膝关节积液的游离dna提取纯化的方法 - Google Patents

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董聪
孙成新
陈永明
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid

Abstract

本发明提供一种膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，主要特征在于两步离心法去除积液中的细胞和碎片等杂质，透明质酸酶、RNA酶、蛋白酶K联合作用，水解积液中的粘性物质和RNA杂质。通过本发明可以有效提取关节积液中的游离DNA，为研究游离DNA在关节炎相关疾病的致病机理的作用提供保障。

Description

一种膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法
技术领域
本发明涉及一种膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，属于生物医学研究领域。
背景技术
类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种对称性多关节炎慢性炎症性疾病，主要表现：滑膜细胞增生、炎性细胞浸润、关节软骨及骨破坏，大量自身抗体产生（类风湿因子、抗瓜氨酸抗体产生），后期会出现如心血管、肺部等全身系统性疾病。。
类风湿性关节炎最先受损的是关节处关节与关节周围组织，关节表面覆盖的关节软骨降低关节的摩擦。滑膜在关节腔周围，产生关节腔积液，为关节软骨提供营养，并且润滑软骨。在类风湿性关节炎中，滑膜是最先发炎部位，表现位滑膜细胞增生，血管增生，炎症细胞包括淋巴细胞、浆细胞和激活的巨嗜细胞浸润。当滑膜增生后，最终炎症组织与临近的关节软骨形成关节翳，可以看到增殖细胞入侵软骨细胞外基质。而在发炎滑膜和相邻软骨下骨，会出现矿化骨质损坏吸收，细胞出现破骨细胞形态改变：如降血钙素受体mRNA表达，组织蛋白酶K表达，及抗酒石酸酸性磷酸酶表达。类风湿性关节炎滑膜产生大量的细胞因子刺激软骨基质破坏和骨损伤，目前，对于类风湿的分类，还主要是根据临床症状。进行对不同疾病亚型进行分子分类，对于类风湿性临床和治疗有重要意义。
有研究表明类风湿性疾病与基因、环境有相互复杂作用，如人类白细胞抗原HLA-DRB1被确定和病人类风湿性因子或者瓜氨酸抗体阳性相关，在HLA-DRB1等位基因处一个普遍存在的氨基酸基序（QKRAA）具有易感性，表明偏好性T细胞选择和抗原呈递或者多肽的不同亲和力在自身免疫性疾病中有重要作用。同时，人们认为免疫反应包括获得性免疫和天然免疫在类风湿性关节炎中起重要作用。当白细胞浸润到滑膜时，引起炎症。当滑膜区的毛细血管部位内皮细胞激活时，增加粘附分子（整合素、选择素已及一些免疫蛋白超家族的分子表达）和趋化分子表达，白细胞进行迁移。由于新生血管的产生，和淋巴血管增生不充分，限制了细胞的流出，形成滑膜炎。微环境系统的改变，与进一步滑膜结构的重组和局部纤维细胞的活化，形成了类风湿性关节炎的滑膜炎。在类风湿性关节炎中，由于自身抗体的存在，使获得性免疫在其中起到重要作用。但同时，在滑膜表面存在大量的天然免疫效应细胞，包括巨嗜细胞、肥大细胞，和自然杀伤细胞，以及存在于关节腔滑液中的中性粒细胞。巨嗜细胞是引起滑膜炎的重要因素。巨嗜细胞能够被病原相关分子与损伤相关分子识别的Toll样受体激活。Toll样受体是目前被研究最透彻的分子识别受体。在人类至少有10种，鼠类大约有12种。每种Toll样受体识别不同的模式分子。Toll 样受体被激活后，激活细胞内通路，导致炎症细胞因子，免疫刺激细胞因子，趋化因子，共刺激因子表达，增强杀伤病原的能力并促进获得性免疫的形成。不恰当的toll样受体的激活，另一方面导致很多疾病的产生如：系统性红斑狼疮，浓毒血症，炎性肠炎，牛皮廯，多发性硬皮症，类风湿性关节炎，动脉粥样硬化。组织一旦收到感染或者损伤，受损的组织会释放各种细胞内因子，刺激天然免疫细胞。核酸来自于宿主细胞和细胞内微生物，能够被识别核酸的toll样受体识别。在病人中，已经发现休克、系统性红斑狼疮或者类风湿性关节炎患者中血清中的游离核酸与致病性相关。游离核酸是指无细胞状态的、游离于细胞外的部分降解了的机体内源性核酸，主要由单链或者双链DNA，及单链与双链DNA的混合物组成，片段大小不一。目前，对于游离核酸在疾病的早期诊断、预后、监测等方面的研究，已经引起极大关注。
但已有的游离DNA提取方法只是针对血液中的游离核酸提取，对于类风湿性关节炎等疾病而言，积液中的游离核酸所包含的信息对于关节炎类疾病的诊断和治疗具有非常重要的意义。但是，关节积液中含有透明质酸，蛋白聚糖，糖胺聚糖等物质，粘性较大。而且，关节腔积液中的游离核酸从量上，到大小分布上，与血液中的游离核酸极有可能完全不同，使用现有的游离DNA提取方法很难操作，提取的游离DNA收率极低，影响后续的科学研究。本专利通过本实验室的探索与实践，提供一个有效的从积液中提取核酸的方法，该方法提取的游离核酸能够以最高效率的将关节积液中全部的游离DNA提取出来，并保证其完整性，确保后续研究的顺利进行。
发明内容
本发明拟提供一种膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，可以有效分离得到膝关节积液中游离DNA，为研究游离DNA在类风湿关节炎中的作用提供保障。
本发明拟采取的具体步骤如下：
1)得到关节积液，离心，2至5℃，2800至3500转每分钟，10至20分钟；
2)弃掉沉淀，上清液转移至新的离心管中，离心，2至5℃，10000至15000转每分钟，20至30分钟；
3)弃掉沉淀，上清液0.22微米过滤至新的离心管中；
4)室温平衡5至10分钟；
5)加入透明质酸酶和RNA酶, 37℃孵育2至4小时；
6)加入蛋白酶K，60℃孵育30至45分钟；
7)加入1/5体积的CTAB缓冲液，65℃，孵育10至15分钟；
8)加入等体积的氯仿，充分混合， 20至25℃离心，10000至15000转每分钟，10至20分钟；
9)取水相层，转移至新的离心管中，使用试剂盒提取DNA，得到关节积液游离DNA。
本发明中，使用的透明质酸酶的最终浓度范围是300至1000酶活单位每毫升。
本发明中，使用的RNA酶的最终浓度范围是10至20微克每毫升。
本发明中，使用的蛋白酶K的最终浓度范围是50至100微克每毫升。
本发明中，使用的CTAB缓冲液，配制方法为，将十六烷基三甲基溴化铵（Hexadecyltrimethyl ammonium Bromide，CTAB）溶于0.7摩尔每升的氯化钠缓冲液中，浓度为10%（w/v）， 56℃水浴搅拌，完全溶解。
本发明中，使用的游离DNA提取试剂盒是QIAGEN公司的试剂盒QIAampCirculating Nucleic Acid Kit。
本发明的有益效果是：
本发明首先通过两步离心法分别去除积液中的细胞和碎片等杂质，第一步低速离心可以防止高速离心引起细胞破裂导致细胞内DNA外溢污染样品；通过透明质酸酶水解积液中的透明质酸，降低积液的粘度；RNA酶水解积液中RNA杂质；蛋白酶K水解积液中的蛋白质，释放DNA。通过本发明的处理可以有效降低积液的粘度，并去除RNA等杂质，释放积液中的游离DNA，配合使用商业化的DNA提取试剂盒，可以得到高收率的积液游离DNA。以此方法制备的游离DNA为模版，利用PCR，可以得到目的片段，即通过本发明处理积液，得到的游离DNA可以作为后续研究中的模版，为研究游离DNA在关节炎相关疾病的致病机理提供保障。
附图说明
图1，三种方法提取得到游离DNA琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，Ａ泳道为第一种方法提取的游离DNA，B泳道为第二种方法提取的游离DNA，C泳道为第三种方法提取得到的游离DNA。
图2，类风湿性关节炎患者积液游离DNA的PCR电泳图。
图3，类风湿性关节炎患者积液游离DNA的Agilent 2100 生物分析仪结果图。
具体实施方式
实施例1
本实施例设计三种不同方法，对比提取积液游离DNA的产量，确定最佳方法，其中方法二为本发明提出的方法。
取类风湿性关节炎患者膝关节积液10毫升，离心，4℃，3000转每分钟，10分钟；弃掉沉淀，上清液转移至新的离心管中，离心，4℃，10000转每分钟，20分钟；弃掉沉淀，上清液0.22微米过滤；室温平衡5分钟。
分别采用三种不同方法步骤提取积液DNA：
方法一：取滤后上清液3毫升，加入100微升透明质酸酶，终浓度500酶活单位每毫升；10微升RNA酶，终浓度10微克每毫升， 37℃孵育2小时。加入100微升蛋白酶K，终浓度50微克每毫升，涡旋30秒，60℃孵育30分钟。室温静置10分钟，待下一步提取。
方法二：取滤后上清液3毫升，加入100微升透明质酸酶，终浓度500酶活单位每毫升；10微升RNA酶，终浓度10微克每毫升，37℃孵育2小时。加入100微升蛋白酶K，终浓度50微克每毫升，涡旋30秒，60℃孵育30分钟。加入600微升CTAB缓冲液(10%,w/v)，65℃孵育10分钟。加入3.6毫升氯仿，涡旋30秒，10000 转每分种，室温离心10分钟。取水层溶液，待下一步提取。
方法三：取滤后上清液3毫升，加入3毫升N-乙酰半胱氨酸，终浓度2.5毫克每毫升，10微升RNA酶，终浓度10微克每毫升，37℃孵育2小时；加入100微升蛋白酶K，涡旋30秒，60℃孵育30分钟。室温静置10分钟,待下一步提取。
使用GIAGEN公司的试剂盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取游离DNA。主要步骤如下：向上清液中加入ACL缓冲液2.4毫升, 涡旋30秒，60℃孵育30分钟。加入5.4毫升ACB缓冲液，涡旋15秒。过结合柱后，依次加入600微升ACW1缓冲液、750微升ACW2缓冲液、750微升无水乙醇，14000 转每分钟，离心3分钟。56℃孵育10分钟，加入50微升AVE缓冲液,室温静置3分钟；14000转每分钟，离心1分钟, 获得游离DNA。
应用PicoGreen荧光染料进行DNA精确定量。对比三种提取积液游离DNA的方法，结果显示见表1，方法二提取得到的游离DNA收率最高（约4.8微克）。
取5微升游离DNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，其结果如图1所示，方法二提取的游离DNA（B 泳道）含量最高，与荧光染料定量结果一致。
图2为类风湿性关节炎患者积液游离DNA的PCR电泳图。
本发明采取方法二的技术路线分离纯化膝关节积液的游离DNA。
表1 积液游离DNA测定结果
方法一 方法二 方法三
游离DNA(微克) 3.098 4.839 0.198
以上所述，仅为本发明在关节腔积液中较佳实施而已，故不能依次限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容在其它组织液中的提取，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
实施例2
本实施例应用PCR法验证本发明方法得到的游离DNA，参考基因选择通用的内参基因GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶），反应体系如表2所示，PCR程序如表3所示，2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果显示4例积液的游离DNA均有目标产物条带，目标条带唯一且产物分子量与预期一致。
表2 PCR反应体系（50微升）
使用量 终浓度
模板DNA（积液游离DNA） 5纳克
Primer-F 10 皮摩尔 0.2 微摩尔每升
Primer-R 10 皮摩尔 0.2 微摩尔每升
Primer STAR Max Premix (2X) 25微升 1X
GAPDH引物设计序列为
Primer-F：ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
Primer-R：GCCATCACGCCACAGTTTC
表3 PCR反应程序
应用Agilent 2100 生物分析仪分析提取得到的关节腔积液游离DNA，结果如图3所示。结果显示，积液的游离DNA分子量分布范围很宽，从150bp左右到10000bp均有分布。

Claims (5)

1.一种膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，其特征在于采取如下步骤：
1)得到关节积液，离心，2至5℃，2800至3500转每分钟，10至20分钟；
2)弃掉沉淀，上清液转移至新的离心管中，离心，2至5℃，10000至15000转每分钟，20至30分钟；
3)弃掉沉淀，上清液0.22微米过滤至新的离心管中；
4)室温平衡5至10分钟；
5)加入透明质酸酶和RNA酶, 37℃孵育2至4小时；
6)加入蛋白酶K，60℃孵育30至45分钟；
7)加入1/5体积的CTAB缓冲液，65℃，孵育10至15分钟；
8)加入等体积的氯仿，充分混合， 20至25℃离心，10000至15000转每分钟，10至20分钟；
9)取水相层，转移至新的离心管中，使用试剂盒提取DNA，得到关节积液游离DNA。
2.根据权利要求1所述的膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，其特征在于，使用的透明质酸酶的终浓度范围是300至1000酶活单位每毫升。
3.根据权利要求1所述的膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，其特征在于，使用的RNA酶的最终浓度范围是10至20微克每毫升。
4.根据权利要求1所述的膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，其特征在于，使用的蛋白酶K的最终浓度范围是50至100微克每毫升。
5.根据权利要求1所述的膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，其特征在于，使用的CTAB缓冲液，配制方法为，将十六烷基三甲基溴化铵溶于0.7摩尔每升的氯化钠缓冲液中，浓度为10%（w/v）， 56℃水浴搅拌，完全溶解。
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