CN106270546B - 一种蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法 - Google Patents

一种蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法，首先将一定浓度的血清蛋白与硝酸铈混合制成铈纳米材料的前驱体溶液，在氢氧化钾溶液碱性条件下成核生长，通过进一步对反应温度及时间的调控，一方面，可控的获得了铈纳米簇、铈纳米颗粒及铈纳米链材料，且都具有良好的均一性、分散性及稳定性。并对纳米材料及其表面进行了相应表征分析，另一方面，相应铈纳米材料表面修饰的BSA或HSA具有优异的生物学相容性，且具有大量可供修饰的功能基团如羧基、氨基等，可进一步嫁接修饰其他功能性分子，为其进一步在生物体内的应用奠定了基础。本发明反应绿色经济，调控方式灵活易控，重复性强。

Description

一种蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法，属于表面修饰的功能纳米材料制备技术领域。具体地说。是涉及一种利用血清蛋白类生物大分子在碱性条件下介导合成修饰铈纳米材料的新方法，特别涉及对铈纳米簇、铈纳米颗粒及铈纳米链的绿色可控合成修饰。
背景技术
铈纳米材料由于其表面Ce3+/Ce4+共存从而赋予其优异的氧化还原活性，使其在化学催化反应，辐射防护，肿瘤放化疗，抗氧化类疾病的治疗及再生医学方向都具有十分重要而广阔的应用前景(Nanoscale.2011，3，1411-1420、NPG Asia Mater.2014，6，e90、ACSNano.2016，10，2860–2870、Chem.Rev.2016，DOI:10.1021/acs.chemrev.5b00603)。而随着近年来铈纳米材料(主要是铈纳米颗粒)在生物医药领域研究的进一步的深入推进，对铈纳米材料本身的化学稳定性、生物学活性及生物相容性要求亦是越发严格。一方面，虽然前期致力于铈纳米颗粒生物学效应研究，也取得了相当大的成果，但大部分研究是在未经修饰、弱表面活性剂保护或有机高聚物修饰的铈纳米颗粒(Nano Lett.2005，5，2573-2577、Biomaterials.2007，28，1918-1925、Adv.Funct.Mate.2010，20，1617-162、Angew.Chem.Int.Ed.2009，48，2308-2312、Biomaterials.2012，33，8771-8781、ACSNano.2013，7，4855-4868)的情况下进行的，故其材料本身的稳定性，生物学活性及生物相容性都存在不同程度的问题，在一定程度上影响了其研究分析的结果，从而限制了其在生物体内的进一步应用研究；另一方面，由于前期铈纳米簇及铈纳米链的合成研究方法报道较少，近些年仅有极少数铈纳米簇在催化领域的研究报道(ACS Nano.2015，9，8617–8626、J.Phys.Chem.A.2016，120，2313–2319、Surface Science.2016，doi:10.1016/j.susc.2016.03.020)，而铈纳米簇及铈纳米链进一步的表面修饰及生物学应用更是未见报道。
因此，如何有效地解决铈纳米材料本身的化学稳定性，保证其生物学活性及提高其生物相容性是目前急待解决的问题。血清蛋白是血浆里最丰富的蛋白质。它们能够携带许多其它的不溶于水的分子，如药物分子，比如布洛芬、吲哚青绿等(Adv.Mater.2016，DOI:10.1002/adma.201600038)。其中牛血清蛋白(BSA)及人血清蛋白(HSA)是目前改善无机纳米颗粒生物相容性最为有效的手段之一，其无毒、无刺激性，且具有良好的水溶性、稳定性及生物相容性。更为重要的是BSA或HAS具有许多的活性功能基团如羧基、氨基、巯基等，故纳米材料经BSA或HAS修饰可进一步嫁接其他功能分子以推进其进一步的生物学应用研究(Journal of Controlled Release.2012，157，168–182)。
其中BSA由于其结构性质明确(～66KD，17对二硫键)，经济实惠，性质独特，目前已被广泛用于纳米材料的合成修饰研究(Adv.Funct.Mater.2009，19，1451–1458；Chem.AsianJ.2011，6，1156–1162)，例如，Prasad.et al.报道BSA直接合成金，银，铂，金-银，铂-银等纳米颗粒的方法(J.Mater.Chem.2005，15，5115–5121；Colloids Surf.B 2009，69，239–245)，而Ying et al.在BSA基础之上更是建立了一种简单，绿色的金纳米簇成成方法，且获得金纳米簇具有高的荧光产率(J.Am.Chem.Soc.2009，131，888–889)。BSA在其他纳米材料如铜，镉，钴，镍等的合成应用最近也成为研究的热点(Adv.Mater.2015，27，3874–3882；Adv.Mater.2016，DOI:10.1002/adma.201506119)。BSA之所以能参与多种金属纳米材料的合成修饰，主要是因为其本身与金属离子或纳米材料之间存在一定的相互作用，虽说有最新研究报道表明铈纳米颗粒与一些多巯基生物分子(如金属硫蛋白)之间存在氧化还原反应作用(Chem.Res.Toxicol.2015，28，2304-2312)，但尚未见用血清蛋白类分子介导合成修饰单独铈纳米簇的文献报道，更未见基于血清类蛋白介导合成修饰铈纳米颗粒及铈纳米链的任何文献报道。
发明内容
本发明针对目前铈纳米材料合成修饰中存在的化学稳定性，生物学活性及生物相容性难以得到有效保证的关键问题，建立了一种蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法，通过一步法实现了铈纳米簇的合成修饰，同时通过简易体系调控，成功实现了铈纳米颗粒及铈纳米链的合成修饰，提供了一种简单绿色，多功能的铈纳米材料合成方法，为铈纳米材料在生物医学领域的进一步应用提供了技术保障。
该方法首先通过血清蛋白与铈盐简单搅拌混合得到铈纳米材料合成前驱体，进一步的在碱性条件下，通过调控反应的用量，时间，温度等条件，成功的合成得到了均一性，稳定性及生物相容性好的铈纳米簇、纳米颗粒及纳米链。且铈纳米材料表面的血清蛋白修饰，赋予了其进一步功能分子嫁接修饰的可能性。这将对推进铈纳米颗粒的进一步生物学研究，开展铈纳米簇及铈纳米链新的生物学应用意义重大，作用深远。
本发明的蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法所采用的工艺步骤如下：
(1)将血清蛋白加入到蒸馏水溶液当中，取硝酸铈[Ce(NO3)3.6H2O]加入其中，在600r/min磁力搅拌下，反应10～30min后加碱溶液至以上反应体系中调控pH，于室温反应10～30min后停止反应，将以上反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中二次蒸馏水透析24～48h，其中每5～8小时换水一次，换水量在3～5L/次。以除掉未反应的铈盐酸、氢氧根(OH-)及其他无机离子。最后置于100kd(4～15mL)套筒离心管中3000～4500r/min多次离心洗涤纯化除掉多余未反应的蛋白，得到粒径为1～2nm大小的铈纳米簇(ceriananoclusters)；
(2)将血清蛋白加入到蒸馏水溶液当中，控温让血清蛋白维持在较高的温度水平，待温度稳定后，在800r/min磁力搅拌下，快速将硝酸铈[Ce(NO3)3.6H2O]加入其中，反应10～30min后加碱溶液至以上反应体系中调控pH，并精确控温反应1～4h后停止反应，待体系冷却至室温后，将以上反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中二次蒸馏水透析24～48h，其中每5～8小时换水一次，换水量在3～5L/次。以除掉未反应的铈盐酸、氢氧根(OH-)及其他无机离子。最后置于100kd(4～15mL)套筒离心管中3000～4500r/min多次离心洗涤纯化除掉多余未反应的蛋白，得到粒径为3～4nm大小的铈纳米颗粒(ceriananoparticles)；
(3)将血清蛋白加入到蒸馏水溶液当中，取硝酸铈[Ce(NO3)3.6H2O]加入其中，在600r/min磁力搅拌下，反应10～30min后加碱溶液至以上反应体系中调控pH，于室温反应1～12h后停止反应，待冷却至室温后，将以上反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中二次蒸馏水透析24～48h，其中每5～8小时换水一次，换水量在3～5L/次。以除掉未反应的铈盐酸、氢氧根(OH-)及其他无机离子。最后置于100kd(4～15mL)套筒离心管中3000～4500r/min多次离心洗涤纯化除掉多余未反应的蛋白。根据反应时间的不同可控的得到链长约为20～120nm的铈纳米链(ceria nanochains)；
其中，步骤(1)、(2)、(3)中所述中的血清蛋白包括人血清蛋白(HSA)及牛血清蛋白(BSA)，用量为0.25～1.0g；Ce(NO3)3.6H2O用量为100～500uL 0.1mol/L；步骤(1)、(2)、(3)所述碱溶液包括氢氧化钠(NaOH)及氢氧化钾(KOH)；用量为200～600uL 1mol/L；反应均为10mL体系；步骤(1)、(2)、(3)中所述血清蛋白、铈盐、碱溶液的摩尔比为0.5～2：1～5：25～75；
步骤(1)、(2)、(3)中所述ceria nanoclusters、ceria nanoparticles、ceriananochains中Ce元素浓度均为0.4～1.0mg/mL；步骤(1)、(3)中所述室温范围为5～40℃。步骤(2)中所述较高温度范围为50～90℃。
与现有铈纳米颗粒合成修饰技术相比，本发明有着极大的原创性和显著的技术进步：
基于蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法，一方面，通过对体系的简易调控，成功实现了铈纳米簇，铈纳米颗粒及铈纳米链的合成修饰，且铈纳米材料的均一性，稳定性及生物相容性都得到了相应的保障；另一方面，相应铈纳米材料表面修饰的BSA或HSA具有优异的生物学相容性，且具有大量可供修饰的功能基团如羧基、氨基等，可进一步嫁接修饰其他功能性分子，为其进一步在生物体内的应用奠定了基础。最后，本发明反应绿色经济，调控方式灵活易控，重复性强。
本发明方法所得到的铈纳米材料在药物靶向输送、抗氧化疾病治疗及再生医学领域具有重大的推动作用及应用前景。
附图说明
图1是本发明提供的蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法示意图。
图2是本发明提供的Ceria nanoclusters的DLS分析图。
图3是本发明提供的Ceria nanoparticles的DLS分析图。
图4是本发明提供的Ceria nanocchains(短链)的DLS分析图。
图5是本发明提供的Ceria nanocchains(长链)的DLS分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例的蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法包括以下步骤：
(1)将血清蛋白加入到蒸馏水溶液当中，取硝酸铈[Ce(NO3)3.6H2O]加入其中，在600r/min磁力搅拌下，反应10～30min后加碱溶液至以上反应体系中调控pH，于室温反应10～30min后停止反应，将以上反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中二次蒸馏水透析24～48h，其中每5～8小时换水一次，换水量在3～5L/次。以除掉未反应的铈盐酸、氢氧根(OH-)及其他无机离子。最后置于100kd(4～15mL)套筒离心管中3000～4500r/min多次离心洗涤纯化除掉多余未反应的蛋白，得到粒径为1～2nm大小的铈纳米簇(ceriananoclusters)；
(2)将血清蛋白加入到蒸馏水溶液当中，控温让血清蛋白维持在较高的温度水平，待温度稳定后，在800r/min磁力搅拌下，快速将硝酸铈[Ce(NO3)3.6H2O]加入其中，反应10～30min后加碱溶液至以上反应体系中调控pH，并精确控温反应1～4h后停止反应，待体系冷却至室温后，将以上反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中二次蒸馏水透析24～48h，其中每5～8小时换水一次，换水量在3～5L/次。以除掉未反应的铈盐酸、氢氧根(OH-)及其他无机离子。最后置于100kd(4～15mL)套筒离心管中3000～4500r/min多次离心洗涤纯化除掉多余未反应的蛋白，得到粒径为3～4nm大小的铈纳米颗粒(ceriananoparticles)；
(3)将血清蛋白加入到蒸馏水溶液当中，取硝酸铈[Ce(NO3)3.6H2O]加入其中，在600r/min磁力搅拌下，反应10～30min后加碱溶液至以上反应体系中调控pH，于室温反应1～12h后停止反应，待冷却至室温后，将以上反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中二次蒸馏水透析24～48h，其中每5～8小时换水一次，换水量在3～5L/次。以除掉未反应的铈盐酸、氢氧根(OH-)及其他无机离子。最后置于100kd(4～15mL)套筒离心管中3000～4500r/min多次离心洗涤纯化除掉多余未反应的蛋白。根据反应时间的不同可控的得到链长约为20～120nm的铈纳米链(ceria nanochains)；
其中，步骤(1)、(2)、(3)中所述中的血清蛋白包括人血清蛋白(HSA)及牛血清蛋白(BSA)，用量为0.25～1.0g；Ce(NO3)3.6H2O用量为100～500uL 0.1mol/L；步骤(1)、(2)、(3)所述碱溶液包括氢氧化钠(NaOH)及氢氧化钾(KOH)；用量为200～600uL 1mol/L；反应均为10mL体系；步骤(1)、(2)、(3)中所述血清蛋白、铈盐、碱溶液的摩尔比为0.5～2：1～5：25～75；
步骤(1)、(2)、(3)中所述ceria nanoclusters、ceria nanoparticles、ceriananochains中Ce元素浓度均为0.4～1.0mg/mL；步骤(1)、(3)中所述室温范围为5～40℃。步骤(2)中所述较高温度范围为50～90℃。
与现有铈纳米颗粒合成修饰技术相比，本发明有着极大的原创性和显著的技术进步：
基于蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法，一方面，通过对体系的简易调控，成功实现了铈纳米簇，铈纳米颗粒及铈纳米链的合成修饰，且铈纳米材料的均一性，稳定性及生物相容性都得到了相应的保障；另一方面，相应铈纳米材料表面修饰的BSA或HSA具有优异的生物学相容性，且具有大量可供修饰的功能基团如羧基、氨基等，可进一步嫁接修饰其他功能性分子，为其进一步在生物体内的应用奠定了基础。最后，本发明反应绿色经济，调控方式灵活易控，重复性强。
本发明方法所得到的铈纳米材料在药物靶向输送、抗氧化疾病治疗及再生医学领域具有重大的推动作用及应用前景。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1 铈纳米簇的制备
取0.25g BSA加入到9mL蒸馏水溶液当中，取500uL 0.1mol/L Ce(NO3)3.6H2O L加入其中，在600r/min磁力搅拌下，室温(37℃)反应15min后体系少许浑浊，取500uL 1mol/L的KOH加入以上体系中调控pH～13左右，于室温(37℃)反应15min后停止反应，将以上反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中二次蒸馏水透析24h，其中每6小时换水一次，换水量在3L/次。以除掉未反应的铈盐、氢氧根(OH-)及其他无机离子。最后置于100kd(15mL)套筒离心管中4500r/min离心洗涤5次，除掉多余未反应的BSA，得到平均水合粒径为21nm大小的铈纳米簇(ceria nanoclusters，8mL，CCe＝0.55mg/mL～ICP-MS，TEM测定平均大小约为1.2nm)；其水合粒经(DLS)分析图如图2所示。
实施例2 铈纳米颗粒的制备
取0.25g BSA加入到9mL蒸馏水溶液当中，置于80℃油浴稳定10min，在800r/min磁力搅拌下，快速加入500uL 0.1mol/L Ce(NO3)3.6H2O溶液，体系立即浑浊，取500uL1mol/L的KOH一次性加入以上体系中调控pH～13左右，80℃油浴反应5min后体系澄清(淡黄色)，继续控温反应2h后停止反应，冷至25℃后，将以上反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中二次蒸馏水透析24h，其中每6小时换水一次，换水量在3L/次。以除掉未反应的铈盐、氢氧根(OH-)及其他无机离子。最后置于100kd(15mL)套筒离心管中4500r/min离心洗涤5次，除掉多余未反应的BSA，得到平均水合粒径为25nm大小的铈纳米颗粒(ceria nanoparticles，8mL，CCe＝0.72mg/mL～ICP-MS，TEM测定平均粒径大小约为3.7nm)；其DLS分析图如图3所示。
实施例3 铈纳米链的制备(短链～70nm，DLS)
取0.25g BSA加入到9mL蒸馏水溶液当中，取500uL 0.1mol/L Ce(NO3)3.6H2O L加入其中，在600r/min磁力搅拌下，室温(37℃)反应15min后体系少许浑浊，取500uL 1mol/L的KOH加入以上体系中调控pH～13左右，于室温(37℃)反应4h后停止反应，将以上反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中二次蒸馏水透析24h，其中每6小时换水一次，换水量在3L/次。以除掉未反应的铈盐、氢氧根(OH-)及其他无机离子。最后置于100kd(15mL)套筒离心管中4500r/min离心洗涤5次，除掉多余未反应的BSA，得到平均水合粒径为65nm大小的铈纳米链(ceria nanochains，8mL，CCe＝0.65mg/mL～ICP-MS)；其DLS分析图如图4所示。
实施例4 铈纳米链的制备(长链～140nm，DLS)
取0.25g BSA加入到9mL蒸馏水溶液当中，取500uL 0.1mol/L Ce(NO3)3.6H2O L加入其中，在600r/min磁力搅拌下，室温(37℃)反应15min后体系少许浑浊，取500uL 1mol/L的KOH加入以上体系中调控pH～13左右，于室温(37℃)反应12h后停止反应，将以上反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中二次蒸馏水透析24h，其中每6小时换水一次，换水量在3L/次。以除掉未反应的铈盐、氢氧根(OH-)及其他无机离子。最后置于100kd(15mL)套筒离心管中4500r/min离心洗涤5次，除掉多余未反应的BSA，得到平均水合粒径为145nm大小的铈纳米链(ceria nanochains，8mL，CCe＝0.78mg/mL～ICP-MS)；其DLS分析图如图5所示。
实施例5 铈纳米链的制备(HSA法)
取0.25g HSA加入到9mL蒸馏水溶液当中，取500uL 0.1mol/L Ce(NO3)3.6H2O L加入其中，在600r/min磁力搅拌下，室温(37℃)反应15min后体系少许浑浊，取500uL 1mol/L的KOH加入以上体系中调控pH～13左右，于室温(37℃)反应12h后停止反应，将以上反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中二次蒸馏水透析24h，其中每6小时换水一次，换水量在3L/次。以除掉未反应的铈盐、氢氧根(OH-)及其他无机离子。最后置于100kd(15mL)套筒离心管中4500r/min离心洗涤5次，除掉多余未反应的HSA，得到平均水合粒径为150nm大小的铈纳米链(ceria nanochains，8mL，CCe＝0.62mg/mL～ICP-MS)；
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法，其特征在于，所述蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法包括下述步骤：
(1)将血清蛋白加入到蒸馏水溶液当中，取硝酸铈加入血清蛋白水溶液中，在600r/min磁力搅拌下，反应10min～30min后加碱溶液至以上反应体系中调控pH13，于室温反应10min～30min后停止反应，将加碱溶液后的混合溶液置于转入截留分子量为10000透析袋中超纯水透析24h～48h，每5小时～8小时换水一次，换水量在3L/次～5L/次，除掉未反应的铈盐酸、氢氧根，最后置于100kd套筒离心管中3000～4500r/min离心3次～6次洗涤纯化除掉多余未反应的蛋白，得到粒径为1nm～2nm大小的铈纳米簇；
(2)将血清蛋白加入到蒸馏水溶液当中，控温让血清蛋白维持在较高的温度水平，待温度稳定后，在800r/min磁力搅拌下，快速将硝酸铈加入血清蛋白水溶液中，反应10min～30min后加碱溶液至将硝酸铈加入血清蛋白水溶液反应体系中调控pH13，并精确控温反应1～4h后停止反应，待体系冷却至室温后，将加碱溶液后的反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中超纯水透析24～48h，每5～8小时换水一次，换水量在3L/次～5L/次，以除掉未反应的铈盐酸、氢氧根及其他无机离子，最后置于100kd套筒离心管中3000r/min～4500r/min离心3次～6次洗涤纯化除掉多余未反应的蛋白，得到粒径为3nm～4nm大小的铈纳米颗粒；
(3)将血清蛋白加入到蒸馏水溶液当中，取硝酸铈加入血清蛋白水溶液中，在600r/min磁力搅拌下，反应10min～30min后加碱溶液至将硝酸铈加入血清蛋白水溶液反应体系中调控pH13，于室温反应1h～12h后停止反应，待冷却至室温后，将加碱溶液后的反应液置于转入截留分子量为10000透析袋中超纯水透析24h～48h，每5小时～8小时换水一次，换水量在3L/次～5L/次，除掉未反应的铈盐酸、氢氧根，最后置于100kd套筒离心管中3000r/min～4500r/min离心3次～6次洗涤纯化除掉多余未反应的蛋白，根据反应时间的不同可控的得到链长为20nm～120nm的铈纳米链；
步骤(1)、(2)、(3)中的血清蛋白用量为0.25～1.0g；Ce(NO3)3.6H2O用量为100uL0.1mol/L～500uL 0.1mol/L；碱溶液用量为200～600uL 1mol/L；反应均为10mL总体系；所述步骤(2)控温让血清蛋白维持在较高的温度水平中，让血清蛋白维持10min；
步骤(1)、(3)中所述室温范围为5℃～40℃；步骤(2)中所述较高温度范围为50℃～90℃。
2.根据权利要求1所述的蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法，其特征在于，步骤(1)、(2)、(3)中所述中的血清蛋白包括人血清蛋白及牛血清蛋白；步骤(1)、(2)、(3)所述碱溶液包括氢氧化钠及氢氧化钾。
3.根据权利要求1所述的蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法，其特征在于，步骤(1)、(2)、(3)中所述血清蛋白、铈盐、碱溶液的摩尔比为0.5～2：1～5：25～75。
4.根据权利要求1所述的蛋白介导合成修饰铈纳米材料的方法，其特征在于，步骤(1)、(2)、(3)中所述铈纳米簇、铈纳米颗粒、铈纳米链中Ce元素浓度均为0.4mg/mL～1.0mg/mL。
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