CN106265492B

CN106265492B - 一种含有帕立骨化醇的药物组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN106265492B
Application number: CN201510301222.1A
Authority: CN
Inventors: 蒋代财; 陈洋; 郭礼新; 郭晖
Original assignee: Chengdu State Bio Medicine Co ltd
Current assignee: Chengdu State Bio Medicine Co ltd
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2035-06-04
Also published as: CN106265492A

Abstract

本发明涉及一种含有帕立骨化醇的药物组合物，由帕立骨化醇、乙醇、丙二醇、注射用水四种药用成分组成，其制备方法为：将乙醇、丙二醇混合均匀，加入0.5%（w/v）活性炭吸附15分钟～75分钟后，脱炭，加入帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水，搅拌均匀，灌装，封口，121℃灭菌12分钟。本发明还涉及一种降低帕立骨化醇药物组合物的降解杂质的方法：将组合物灌封于安瓿瓶，并保持安瓿瓶中气体的残氧量为0.32 ml～2ml。所述产品制备简单快速，未出现原料析出、原料需长时间搅拌复溶的问题，并且通过对注射液容器中气体的残氧量进行控制，可更进一步的使光照后降解杂质PCL‑9的含量低至0.1%以下，产品安全性更高。

Description

一种含有帕立骨化醇的药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂，具体涉及一种含有帕立骨化醇的注射液及其制备方法。

背景技术

帕立骨化醇，又名19-去甲-1,25-(OH)₂-维生素D₂或19-去甲-1,25-二羟基维生素D₂，是一种人工合成的、选择性、第三代生物活性维生素D₂类似物，用于预防和治疗V期慢性肾脏疾病患者的继发性甲状旁腺功能亢进症（SHPT）。该药结构虽与骨化三醇相似，但与骨化三醇相比，它能够更快更持久的抑制甲状旁腺激素，对钙、磷及钙磷乘积影响小，因此较少发生持续性高血钙，并且该药在降低主动脉钙化、改善骨质方面的疗效亦优于骨化三醇，能够减少患者病死率、住院频率和住院时间。

帕立骨化醇由美国雅培（ABBOT）公司研究开发，1998年4月在美国首次获准上市，并于2002年9月在欧盟国家获得上市许可。目前，该产品已在全球60余个国家上市应用，成为治疗慢性肾病透析引起的SHPT的首选药物。

维生素D₂类似物通常是一类脂溶性化合物，例如帕立骨化醇溶于乙醇，而不溶于水，因此将其制备成制剂尤其是注射液时，面临溶解困难的问题。US6361758B公开了一种含有有机溶剂的注射液，如实施例2公开的注射液由30%（v/v）丙二醇、20%（v/v）乙醇和50%（v/v）注射用水及帕立骨化醇组成，ABBOT公司市售产品Zemplar®就是以上述成分组成，而上述组合物的制备通常是将帕立骨化醇溶于乙醇后，再与丙二醇和注射用水的混合溶液进行混合，正如US6361758B实施例2所公开的那样，然而，在实际生产过程中发现，将帕立骨化醇的乙醇溶液与丙二醇和注射用水的混合溶液进行混合时，部分帕立骨化醇会重新析出，如需要使析出物完全复溶，则需要对注射液持续搅拌4～5小时，大大延长生产周期，导致成本增加，并且增加了引入杂质的风险，降低产品安全性。而当不满足上述复溶条件时，析出的药物容易在过滤时损失，造成药物含量降低至85%～90%，从而影响产品疗效。

CN100349573C公开了一种不含缓冲剂、不含螯合剂的非胃肠道制剂，包括维生素D、0.05%～5%聚山梨醇酯20（吐温20）、亲脂性抗氧化剂、醇和水性载体，但吐温类增溶剂具有一定的毒性，尤其以吐温20的毒性最大，使用剂量过多时容易与红细胞结合而导致溶血，引起严重的副作用，在临床静脉注射使用时应慎重。

CN103893114A公开了一种含有的帕立骨化醇注射液，所述注射液中含有帕立骨化醇、无水乙醇和非离子型增溶剂如Solutor HS15，但Solutor HS15在加入时和灭菌后均易出现浑浊现象，需通过振摇或冷却才能够逐渐恢复澄清，不利于生产应用，同时非离子型增溶剂在搅拌过程中容易产生大量泡沫，也给生产带来了一定难度。

此外，本发明申请人在研究过程中还发现，Zemplar®注射液稳定性极差，在40℃，RH75%环境下加速放置6个月后，除检测到已知的降解杂质A～I之外，还发现一个未被报道的新的降解杂质——PCL-9，且该杂质含量为0.32%～0.48%，远高于其他降解杂质，由于药品中的杂质不仅影响了药物的纯度，也可能会降低药物的疗效、影响药物的稳定性，甚至可能对人体健康产生危害或产生其他副作用，因此，为了保证病人用药安全、有效和质量可控，应该严格的将该杂质控制在最低水平。但目前尚未有专利文献报道该杂质以及相关检测方法，也没有相应的技术手段对其进行控制。

因此，开发一种含量更准确，制备更便捷的帕立骨化醇注射液的制备方法，并且，更进一步的，开发一种能将降解产物控制在低水平的注射液及其制备方法，从而保证产品更为有效、安全、稳定，是十分必要的。

发明内容

为了克服帕立骨化醇注射液现有技术存在的含量降低、生产耗时以及杂质过多等问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明公开了一种含有帕立骨化醇的药物组合物的制备方法，所述组合物组成为：

其制备方法为：将乙醇、丙二醇混合均匀，加入0.5%（w/v）活性炭吸附15分钟～75分钟后，脱炭，加入帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水，搅拌均匀，灌装，封口，121℃灭菌12分钟。

所述组合物灌封于安瓿瓶中。

所述组合物灌封后，安瓿瓶中气体的残氧量为0.32 ml～2ml。

所述安瓿瓶规格为2ml。

所述安瓿瓶规格为1ml，并且在所述组合物灌装后，在安瓿瓶中充入氧气。

所述安瓿瓶规格为1ml，并且在所述组合物灌装前和灌装后，在安瓿瓶中充入氧气。

由于采用了以上的方案，使本发明具备的有益效果在于：

本发明生产的帕立骨化醇注射液，制备简单快速，未出现原料析出、原料需长时间搅拌复溶的问题，并且通过对注射液容器中气体的残氧量进行控制，可更进一步的使光照后降解杂质PCL-9的含量低至0.1%以下，产品安全性更高。

本发明所述的帕立骨化醇注射液，其主要活性成分帕立骨化醇在水中溶解性极差，仅为0.0068mg/ml，以含有2µg/ml帕立骨化醇、30%（v/v）丙二醇、20%（v/v）乙醇和50%（v/v）注射用水的组合物为例，当产量为1000支，将帕立骨化醇投入配置好的乙醇-丙二醇-水混合溶液中，完全溶解需要搅拌7～8小时；而按照原研专利方法，将帕立骨化醇的乙醇溶液投入丙二醇-水的混合溶液中，则会导致部分药物析出，此时完全溶解仍需要持续搅拌4～5小时。为了改善上述问题，本发明申请人尝试改变体系中有机溶剂的比例，分别以乙醇:丙二醇:水体积比为2:3.5:4.5、2:4:4、2.5:3:4.5、3:3:4、4:2:4制备注射液，结果发现，增加丙二醇的比例无法改善帕立骨化醇在体系中的溶解度，将帕立骨化醇的乙醇溶液投入至丙二醇-水的混合溶液中，仍然会有药物析出，而增加乙醇的比例至40%以后，制备过程中不会出现药物析出的现象，但此时体系中有机溶剂的含量过高，并且乙醇对人体具有一定刺激作用，该体系下用药风险较大。

本发明申请人又尝试以其他潜溶剂如聚乙二醇300、聚乙二醇400替代丙二醇，或者与丙二醇联合使用，但帕立骨化醇制备过程中的析出问题仍没有得到解决，进一步尝试在注射液中加入助溶剂葡甲胺，发现在注射液中加入1.8mg/ml葡甲胺时，可以解决上述问题，但在长期放置6个月后，又出现了帕立骨化醇析出的现象，证明加入葡甲胺后的体系仍不稳定。

本发明申请人在大量的实验研究过程中发现，在乙醇:丙二醇:水（体积比2:3:5）体系中加入其它的潜溶剂或助溶剂，并不能显著改善帕立骨化醇在溶液中的溶解性，并且，无论是将帕立骨化醇直接投入至乙醇-丙二醇-水溶液中，还是将帕立骨化醇的乙醇溶液加入至丙二醇-水的混合溶液中，或者将帕立骨化醇的乙醇-水溶液加入至丙二醇-水的混合溶液中，又或者在溶液混合时采用少量多次添加混合的方法，均无法解决帕立骨化醇的析出和需要长时间搅拌才能溶解完全的问题，但是，令人惊讶地，当先将帕立骨化醇溶解于乙醇和丙二醇的混合溶液中，然后与水直接混合，虽然未添加任何具有增溶效果的辅料，仅仅只是改变了液体的配制添加顺序，但此法却并未发生帕立骨化醇析出的现象，从而解决了因药物析出而需要搅拌复溶的问题，并且大大缩短了配液时间，并且此法制备的注射液具有良好的稳定性，长期放置36个月也不会发生药物重复析出的问题。

本发明所述帕立骨化醇可以是盐、异构体、溶剂化物、水合物或多晶型物等形式。

本发明所述注射液可灌装于西林瓶、安瓿瓶或预装注射器中，优选灌装于安瓿瓶中。

本领域技术人员已知，维生素D类化合物对氧气敏感，当其暴露在空气中时会被氧化，并且因此而丧失完整性，避免该问题的途径是添加抗氧化剂至药物的制剂中或者充入惰性气体如氮气以减缓此类化合物的氧化作用，例如CN102772364A公开的帕立骨化醇的脂肪乳制备过程中就需要充入氮气，以减少杂质（经研究分别是氧化杂质A和杂质B）的产生。但是，本发明申请人在研究过程中却意外地发现，原研Zemplar®注射液在40℃，RH75%环境下加速放置6个月后，产生了大量的降解产物PCL-9（含量为0.32%-0.48%），并且还发现，该杂质随着注射液中氧气含量的减少而递增，也即是按照本领域技术人员惯常做法，将氮气充入帕立骨化醇注射液后，其产生的降解产物PCL-9，反而比未充入氮气的注射液更多，原因可能在于，帕立骨化醇在放置过程中不可避免的受到光源中紫外线的影响，发生了光学反应，这种光学反应随着注射液容器中氧气的减少，反应更为剧烈。因此，一方面注射液容器中残氧量过高，将导致氧化杂质A和B增多，而残氧量过低时，则会加速光学反应，刺激杂质PCL-9的产生。本发明申请人经过大量的实验研究，发现将注射液容器中气体的残氧量控制在0.32 ml～2ml是最适宜的，能够同时将氧化杂质A和B以及杂质PCL-9的量均控制在较低水平，大大提高产品的稳定性和安全性，降低了用药风险。

对于本发明所述的单位体积为1ml的帕立骨化醇注射液，一种方法是可以选择规格为2ml的注射用容器，例如安瓿瓶进行灌装，此时不必对注射用容器冲氧，就可以满足残氧量在0.32 ml～2ml，另一种方法是选择规格为1ml的注射用容器，例如安瓿瓶进行灌装，此时则需要在制备过程中，如在注射液灌装后，或者在注射液灌装前和灌装后，在注射用容器，如安瓿瓶中充入氧气以实现残氧量在0.32 ml～2ml，优选在注射液灌装前和灌装后充入氧气，以获得更高的残氧量，达到更好的减缓光学反应的效果。

本发明所述的残氧量，可以使用通过电化学或光谱分析或超声波等原理，对单位氧分压测定的仪器进行测定，例如通过光学原理测定氧含量的OxytransM-E便携式测氧仪，采用极谱法原理和覆膜测氧电极测定氧含量的OX-12B携式测氧仪等，可以根据使用的注射用容器和测定的精度要求进行选择。本发明测定的残氧量是指注射用容器内顶部聚集的气体成分中的氧气含量，而非注射用容器内液体中的氧气含量。

本发明所述降解产物PCL-9以及氧化杂质A和B的含量，是通过高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录Ⅴ D）进行检测，具体方法如下：

精密量取帕立骨化醇对照贮备液（精密称取帕立骨化醇对照品约12.5mg置25ml棕色量瓶中，加入无水乙醇溶解并稀释成每1ml中约含帕立骨化醇500μg的溶液）2ml，置10ml量瓶中，加稀释溶液至刻度，摇匀，作为降解产物对照贮备液。精密量取降解产物对照贮备液1ml，置西林瓶中，充氮后密封，放置在能量为1w /m2的近紫外光源下中24h后，全量转移至置20ml量瓶中，加稀释溶液至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液（1）；精密量取降解产物对照贮备液1ml，置5ml量瓶中，加30%过氧化氢溶液0.1ml，摇匀，室温放置1小时，加稀释溶液至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液（2）。

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Kromasil 100-5C18，25cm×4.6mm，5μm分析柱适用）；流动相A为水-乙腈（85:15），流动相B为乙腈；流速：1.0ml/min，按下表进行梯度洗脱。检测波长252nm。量取帕立骨化醇注射液、系统适用性溶液（1）和（2）各100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。其中系统适用性溶液（1）测得的色谱图共有两个峰，分别为帕立骨化醇和杂质PCL-9前后出峰；系统适用性溶液（2）测得的色谱图共有三个峰，分别为氧化杂质A、B和帕立骨化醇依次前后出峰。

杂质PCL-9的百分含量=（A_PCL-9/∑_A）×100%

杂质A的百分含量=（A_杂质A/∑_A）×100%

杂质B的百分含量=（A_杂质B /∑_A）×100%

式中：A_PCL-9为帕立骨化醇注射液中PCL-9杂质的峰面积；

A_杂质A为帕立骨化醇注射液中A杂质的峰面积；

A_杂质B为帕立骨化醇注射液中B杂质的峰面积；

∑_A为帕立骨化醇注射液中所有峰面积之和。

对比例

对比例1

按US6361758B所述方法，在配液罐1中，将150ml注射用水与300ml丙二醇进行混合，在配液罐2中将处方量的帕立骨化醇溶于150ml乙醇中，然后与配液罐1中的溶液混合均匀；剩余的乙醇润洗配液罐2后将其并入配液罐1，加入注射用水至全量，搅拌混合，每30min取样1ml测定帕立骨化醇的含量，直至其含量为97%～103%时，灌装于1ml安瓿瓶，封口，121℃灭菌12min。

对比例2

在配液罐1中，将150ml注射用水与200ml丙二醇进行混合，在配液罐2中将处方量的帕立骨化醇溶于300ml乙醇中，然后与配液罐1中的溶液混合均匀；剩余的乙醇润洗配液罐2后将其并入配液罐1，加入注射用水至全量，搅拌混合，每30min取样1ml测定帕立骨化醇的含量，直至其含量为97%～103%时，灌装于1ml安瓿瓶，封口，121℃灭菌12min。

对比例3

在配液罐1中，将150ml注射用水与300ml PEG400进行混合，在配液罐2中将处方量的帕立骨化醇溶于150ml乙醇中，然后与配液罐1中的溶液混合均匀；剩余的乙醇润洗配液罐2后将其并入配液罐1，加入注射用水至全量，搅拌混合，每30min取样1ml测定帕立骨化醇的含量，直至其含量为97%～103%时，灌装于1ml安瓿瓶，封口，121℃灭菌12min。

对比例4

在配液罐1中，将150ml注射用水与300ml丙二醇进行混合，加入葡甲胺搅拌溶解，在配液罐2中将处方量的帕立骨化醇溶于150ml乙醇中，然后与配液罐1中的溶液混合均匀；剩余的乙醇润洗配液罐2后将其并入配液罐1，加入注射用水至全量，搅拌混合，每30min取样1ml测定帕立骨化醇的含量，直至其含量为97%～103%时，灌装于1ml安瓿瓶，封口，121℃灭菌12min。

对比例5

在配液罐1中，将150ml注射用水与300ml丙二醇进行混合，在配液罐2中将处方量的帕立骨化醇溶于150ml乙醇和70ml注射用水的混合溶液中，然后与配液罐1中的溶液混合均匀；剩余的乙醇润洗配液罐2后将其并入配液罐1，加入注射用水至全量，搅拌混合，每30min取样1ml测定帕立骨化醇的含量，直至其含量为97%～103%时，灌装于1ml安瓿瓶，封口，121℃灭菌12min。

对比例6

将200ml乙醇、300ml丙二醇混合均匀，加入0.5%（w/v）活性炭吸附75min后，脱炭，加入处方量的帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水至全量，搅拌混合，每30min取样1ml测定帕立骨化醇的含量，直至其含量为97%～103%时，灌装于1ml安瓿瓶，封口，121℃灭菌12min。

将对比例1～6制备的注射液于20℃，RH60%环境下长期放置6个月，并检测帕立骨化醇的含量，其结果与对比例1～6注射液配制过程中各时间段帕立骨化醇含量的检测结果见下表。

对比例1～2在制备方法上，均以帕立骨化醇的乙醇溶液加入至丙二醇-水的混合溶液中的方式，并且以不同比例的乙醇-丙二醇-水体系制备注射液，结果发现只有当乙醇含量等于或高于40%（v/v），采用上述配制方法才能在30分钟内快速溶解药物；对比例3以PEG400替代丙二醇，依然采用上述加入顺序制备，结果仍然需要5h才能将药物完全溶解；对比例4加入葡甲胺后，虽然能够使帕立骨化醇在2h内溶解，但制备的注射液放置6个月后又出现了药物析出的现象，证明该体系下的制剂稳定性较差；对比例5在制备方法上，以帕立骨化醇的乙醇-水溶液加入至丙二醇-水的混合溶液中，但药物溶解时间仍然需5h；而对比例6仅仅改进了配制过程中各溶液的混合方式和加入顺序，结果出人意料的，帕立骨化醇在30分钟内即完全溶解，并且放置6个月后该体系仍然稳定，大大缩短了药物制备的时间，并且由于先将乙醇和丙二醇进行混合而并未过早的加入药物，因此此时可以加入活性炭进一步吸附有机溶剂中的杂质，并且避免了活性炭对药物的吸附，进而提高了注射液的质量。

将对比例1～6制备的注射液于0天及在40℃，RH75%环境下加速6个月后，检测其降解杂质的含量，结果见下表。

结果表明，上述制备方法制得的注射液放置后均容易降解产生大量的杂质PCL-9，相较于杂质A和B，其含量是杂质A和B含量十倍多，严重影响了产品的安全性。

对比例7

将200ml乙醇、300ml丙二醇混合均匀，加入0.5%（w/v）活性炭吸附75min后，脱炭，加入处方量的帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水至全量，搅拌均匀，灌装于1ml安瓿瓶，冲入氮气，封口，121℃灭菌12min。

对比例8

按照对比例8所述处方，将200ml乙醇、300ml丙二醇混合均匀，加入0.5%（w/v）活性炭吸附75min后，脱炭，加入处方量的帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水至全量，搅拌均匀，灌装于1ml安瓿瓶，冲入氧气，封口，121℃灭菌12min。

按照对比例7～8所述方法制备注射液，使用OX-12B便携式测氧仪检测对比例6～8安瓿瓶中气体的残氧量，然后将对比例7～8于0天及在40℃，RH75%环境下加速6个月后，检测降解杂质的含量，结果见下表。

对比例6～8表明，随着注射液容器中氧气的含量降低，制剂产生的杂质PCL-9更多，因此，传统的适用于骨化三醇等维生素D类似物的制备方法，如商品名为“溉纯”的骨化三醇注射液中含有抗坏血酸钠等抗氧化剂以及惰性气体氮气来进行绝氧保护的方法并不能应用于帕立骨化醇注射液，相反的，必须保证帕立骨化醇注射液中具有0.32ml～2ml的含氧量，才能保证其杂质PCL-9处于0.1%以下的水平，提高产品的安全性。

附图说明

图1为本发明对比例6加速6月时的降解杂质的检测图谱。

图2为本发明对比例7加速6月时的降解杂质的检测图谱。

图3为本发明对比例8加速6月时的降解杂质的检测图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不是对本发明的保护范围的进一步限定。

实施例1

将200ml乙醇、300ml丙二醇混合均匀，加入0.5%（w/v）活性炭吸附15min后，脱炭，加入处方量的帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水至全量，搅拌均匀，灌装于1ml安瓿瓶，封口，121℃灭菌12min。

实施例2

将200ml乙醇、300ml丙二醇混合均匀，加入0.5%（w/v）活性炭吸附60min后，脱炭，加入处方量的帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水至全量，搅拌均匀，灌装于1ml安瓿瓶，封口，121℃灭菌12min。

实施例3

按照实施例1所述处方，将200ml乙醇、300ml丙二醇混合均匀，加入0.5%（w/v）活性炭吸附50min后，脱炭，加入处方量的帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水至全量，搅拌均匀，灌装于2ml安瓿瓶，封口，121℃灭菌12min。

实施例4

按照实施例1所述处方，将200ml乙醇、300ml丙二醇混合均匀，加入0.5%（w/v）活性炭吸附50min后，脱炭，加入处方量的帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水至全量，搅拌均匀，灌装于2ml安瓿瓶，冲入氧气，封口，121℃灭菌12min。

实施例5

按照实施例1所述处方，将200ml乙醇、300ml丙二醇混合均匀，加入0.5%（w/v）活性炭吸附75min后，脱炭，加入处方量的帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水至全量，搅拌均匀，在空置的2ml安瓿瓶中冲入氧气，然后将注射液灌装，再次冲入氧气，封口，121℃灭菌12min。

实施例6

按照实施例1所述处方，将200ml乙醇、300ml丙二醇混合均匀，加入0.5%（w/v）活性炭吸附75min后，脱炭，加入处方量的帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水至全量，搅拌均匀，灌装于1ml安瓿瓶，冲入氧气，封口，121℃灭菌12min。

实施例7

按照实施例1所述处方，将200ml乙醇、300ml丙二醇混合均匀，加入0.5%（w/v）活性炭吸附75min后，脱炭，加入处方量的帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水至全量，搅拌均匀，在空置的1ml安瓿瓶中冲入氧气，然后将注射液灌装，再次冲入氧气，封口，121℃灭菌12min。

按实施例1～7所述方法制备的注射液，记录制备过程中加入注射用水后的搅拌时间，并在0天时检测其降解杂质的含量，同时使用OX-12B便携式测氧仪检测其安瓿瓶中气体的残氧量；然后在40℃，RH75%环境下加速6个月后，检测降解杂质的含量，结果见下表。

Claims

1.一种含有帕立骨化醇的药物组合物的制备方法，其中药物组合物组成为：

帕立骨化醇 2μg或5μg 乙醇 0.2ml 丙二醇 0.3ml 注射用水 0.5ml

其特征在于，包括下述制备步骤：将乙醇、丙二醇混合均匀，加入0.5％(w/v)活性炭吸附15分钟～75分钟后，脱炭，加入帕立骨化醇，搅拌使溶解完全，然后加入注射用水，搅拌均匀，使用安瓿瓶灌装，充入氧气，封口，控制安瓿瓶中气体的残氧量为0.32mL～2mL，121℃灭菌12分钟。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述安瓿瓶规格为2mL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述安瓿瓶规格为1mL，并且在灌装后，在安瓿瓶中充入氧气。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述安瓿瓶规格为1mL，并且在灌装前和灌装后，在安瓿瓶中充入氧气。