CN106244514A - 一种富含植物甾醇的大豆干细胞培养物的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种富含植物甾醇的大豆干细胞培养物的培养方法。该方法包括以下步骤：(1)获取无菌大豆；(2)取上述无菌大豆的下胚轴，将其切成长度为1.5‑2.5mm，获取无菌大豆组织；(3)将获得的无菌大豆组织进行诱导培养，获得愈伤组织；(4)高温胁迫协同稳态磁场诱导大豆干细胞培养物富集植物甾醇。利用该方法可获得安全无污染的富含植物甾醇的大豆干细胞培养物，培养周期短、安全高效，为植物甾醇的获取提供了一种新途径，可供各领域研究与应用。

Description

一种富含植物甾醇的大豆干细胞培养物的培养方法
技术领域
本发明属于植物干细胞培养领域，尤其涉及一种富含植物甾醇大豆干细胞培养物的培养技术。
背景技术
植物和人类的生活紧密相关，从衣、食、住、行各个方面都离不开植物，但其中最为重要的还是营养供给。从远古时代，人类就意识到植物的价值，流传至今的中草药文化就是最珍贵的成果。近年来，植物的营养价值被各行各业的研究者发现，从烹制加工到植物提取再到组织培养，此领域的研究层面逐渐加深。但是为了适应复杂多变的环境、人为干扰等，植物不断地调整自身器官的生长情况，导致不同时期，不同地域甚至是不同植株之间营养成分、形态结构均存在差异，导致各个领域对其相应的开发与应用均受到限制。
研究表明，植物干细胞的不断自我更新以及极强的分化能力是植物能够历经千年而不衰亡的奥秘，近些年逐渐受到重视。而如何成功培养植物干细胞确实是十分重要的研究方向，100多年来科学家一直投身于从植物中分化出植物干细胞的道路之中。植物干细胞技术已被认为是21世纪生物技术领域最具竞争力的技术之一，从此引起化妆品、保健品等众多领域的关注。概括而言，位于植物顶端分生组织和根尖分生组织的植物干细胞具有不断自我更新，分化成许多成熟的细胞或组织的特点，可将其成功培养成完整的植株。
植物甾醇比胆固醇更易形成胶束，降低胆固醇进入血液中的几率，从一定程度上限制外源胆固醇的摄入量。根据文献资料，每日植物甾醇摄入量为0.45g(折合植物甾醇酯0.73g)有降胆固醇的作用。每日摄入量为1g(折合植物甾醇酯1.6g)，降胆固醇作用明显。世界众多研究机构也曾发出过相应声明，例如，美国国家胆固醇教育项目建议：在特定人群的膳食中每日补充2g植物甾醇或甾烷醇酯可以降低血浆中LDL-C的水平，从而降低冠心病的发病风险；2000年美国食品药品监督管理局(FDA)就已经将植物甾醇及甾醇酯列入一般公认安全的名单，批准添加植物甾醇或甾醇酯的产品可以使用“有益健康”标签。2002年欧洲食品科学委员会通过了植物甾醇酯的安全性评估；2010年我国卫生部批准植物甾醇酯可作为新资源食品食用。由此可见，植物甾醇已经受到诸多国家的重视。
现有获取植物甾醇方法主要从植物油脱臭馏出物中提取精制，相应的提取方法主要有：溶剂萃取法、吸附法、溶剂结晶法、络合法、超临界流体萃取法、柱色谱法、分子蒸馏分离法及高速逆流色谱法等。为获得高含量的植物甾醇，提高提取效率成为首要的入手点，近年来相应的研究与报道也层出不穷。
获得高含量植物甾醇的原料是提高植物甾醇产量的另一个关键方法，本发明旨在利用植物干细胞培养技术培养周期短、无污染、高纯度、条件可控等优势，通过改变外界因素,培育出高植物甾醇含量的大豆干细胞培养物，供不同领域需求者使用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种富含植物甾醇的大豆干细胞培养物的培养方法，该培养方法主要利用植物干细胞培养技术，一方面通过采用高温胁迫，诱导所培养大豆干细胞培养物合成植物甾醇，另一方面，通过增加稳态磁场，增强合成植物甾醇关键酶活性，获得高植物甾醇含量的大豆干细胞培养物。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种富含植物甾醇的大豆干细胞培养物的培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)将大豆种子用乙醇溶液浸泡，无菌水冲洗后，再用次氯酸钠溶液浸泡，然后无菌水冲洗，获得无菌大豆；
(2)取上述无菌大豆的下胚轴，将其切成长度为1.5-2.5mm，获取无菌大豆组织；
(3)将获得的无菌大豆组织，接种于诱导培养基进行诱导培养，获得愈伤组织，其中，1g无菌大豆组织接种于25-35mL的诱导培养基；
(4)将上述获得的愈伤组织，接种于增殖培养基，摇床培养，同时于第2天开始进行稳态磁场干预，即可获得富含植物甾醇的大豆干细胞培养物；
所述诱导培养基为含8-28mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、15-17mg/L柠檬酸铵和0.1-0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，pH调至6.0-6.3；
所述增殖培养基为含8-28mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.5mg/L的蔗糖和0.1-0.5mg/L水解酪蛋白的MS培养基，pH调至6.8-7.0。
进一步地，上述方法中，所述乙醇溶液的质量浓度为75-90％，次氯酸钠溶液的质量浓度为2-10％。
进一步地，所述诱导培养为暗培养，温度为30-32℃，6-7天为一个培养周期，优选培养2-3个培养周期。
进一步地，所述增殖培养温度为30-32℃，光照10-12h/d，摇床培养转速为110-130r/min，7天为一个培养周期，优选培养2-3个培养周期。
进一步地，在增殖培养中，稳态磁场干预具体参数为每个培养周期中加载稳态磁场5-6天，每天曝磁6-8h，强度为0.9-3T。
如上述步骤所述，为成功获取富含植物甾醇大豆干细胞培养物，第一步获取分化能力强的组织细胞是首要任务，同时为保证后续操作顺利进行，需对该植物细胞进行彻底的杀菌清洁。诱导培养时，特在MS培养基基础上加入2,4-二氯苯氧乙酸、柠檬酸铵、萘乙酸，以促进细胞的分化；扩大培养中特使用增殖培养基，即在MS培养基基础上加入2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖、水解酪蛋白，以保证所培养大豆干细胞顺利增殖。与此同时，培养过程中特采用高温胁迫方法，诱导大豆干细胞合成植物甾醇，同时协同稳态磁场处理，增强植物甾醇合成过程中△24-甾醇-C24-甲基转移酶的活性，两种物理方法相结合，使所培养大豆干细胞培养物中植物甾醇得到富集。
本发明的有益效果如下：
本发明提供一种富含植物甾醇的大豆干细胞培养物的培养方法，利用该方法可获得安全无污染的富含植物甾醇的大豆干细胞培养物，培养周期短、安全高效，为植物甾醇的获取提供了一种新途径，可供各领域研究与应用。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1
一种富含植物甾醇大豆干细胞培养物的培养技术及其制备方法，包括如下具体步骤：
一、培养基配制
1、诱导培养基：含8-28mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、15-17mg/L柠檬酸铵和0.1-0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，pH调至6.0-6.3；
所述增殖培养基为
2、增殖培养基：含8-28mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.5mg/L的蔗糖和0.1-0.5mg/L水解酪蛋白的MS培养基，pH调至6.8-7.0。
二、获取无菌大豆
将大豆种子用75-90％的乙醇浸泡15min，无菌水洗净；
用2-10％的次氯酸钠浸泡2-5min，无菌水洗净；
取上述无菌大豆下胚轴，将其切成长度为1.5-2.5mm。
三、诱导培养
取按照上述方法获得的无菌大豆组织，放于以上所述诱导培养基中，于30-32℃条件下避光培养，按照1g样品接种于25-35mL培养液的比例进行诱导，6-7天为一个周期，培养2-3个周期，获得愈伤组织。
四、高温胁迫协同稳态磁场诱导大豆干细胞培养物富集植物甾醇
取按上述方法获得的愈伤组织，将其接种在增殖培养基中，于30-32℃，光照10-12h/d条件下，进行摇床培养，转速为110-130r/min。从培养的第2天起加载稳态磁场，每个周期(7天)加载5-6天，每天曝磁6-8h，强度为0.9-3T，培养2-3个周期，即可获得富含植物甾醇的大豆干细胞培养物。
植物甾醇测定
一、植物甾醇提取
准确称取10g大豆或大豆干细胞培养物(大豆干细胞培养物使用前先作冻干处理)，将其粉碎过60目筛，以无水乙醇为提取液，按照料液比1:20，超声波功率500W，提取温度50℃，提取时间60min的工艺参数进行超声波提取后，以4000r/min离心5分钟，冷却至室温后真空抽滤，弃去沉淀，旋转蒸发后定容，得到植物甾醇粗提液。
二、大豆甾醇含量的测定
参照GB/T25223-2010甾醇总量测定方法测定甾醇含量，测定结果如下：
名称 植物甾醇含量(mg/100g)
本发明培育大豆干细胞培养物 6025
普通大豆 310.63
大豆干细胞培养物中植物甾醇含量为6025mg/100g，普通大豆中植物甾醇含量为310.63mg/100g，二者植物甾醇含量相差近20倍，而且大豆干细胞培养周期仅为普通大豆生长周期的1/3，可见本发明所述的大豆干细胞培养物不仅富集了高含量的植物甾醇，而且缩短了生长周期，极大降低了生产成本，具有重要的实际应用价值，可供各个领域研究与应用。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (5)

1.一种富含植物甾醇的大豆干细胞培养物的培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将大豆种子用乙醇溶液浸泡，无菌水冲洗后，再用次氯酸钠溶液浸泡，然后无菌水冲洗，获得无菌大豆；
(2)取上述无菌大豆的下胚轴，将其切成长度为1.5-2.5mm，获取无菌大豆组织；
(3)将获得的无菌大豆组织，接种于诱导培养基进行诱导培养，获得愈伤组织，其中，1g无菌大豆组织接种于25-35mL的诱导培养基；
(4)将上述获得的愈伤组织，接种于增殖培养基，摇床培养，同时于第2天开始进行稳态磁场干预，即可获得富含植物甾醇的大豆干细胞培养物；
所述诱导培养基为含8-28mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、15-17mg/L柠檬酸铵和0.1-0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，pH调至6.0-6.3；
所述增殖培养基为含8-28mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.5mg/L的蔗糖和0.1-0.5mg/L水解酪蛋白的MS培养基，pH调至6.8-7.0。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述乙醇溶液的质量浓度为75-90％，次氯酸钠溶液的质量浓度为2-10％。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述诱导培养为暗培养，温度为30-32℃，6-7天为一个培养周期，培养2-3个培养周期。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述增殖培养温度为30-32℃，光照10-12h/d，摇床培养转速为110-130r/min，7天为一个培养周期，培养2-3个培养周期。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，在增殖培养中，稳态磁场干预具体参数为每个培养周期加载稳态磁场5-6天，每天曝磁6-8h，强度为0.9-3T。
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