CN106243187A - 一种从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法，该方法包括以下步骤：往灭酶后的牡蛎酶解液中加入乳化剂和脂肪酶，混匀后在35～50℃下水解4～8h，得到牡蛎二次酶解产物；往二次酶解产物中加入酵母细胞壁多糖和活性炭，在50～60℃保温中振荡0.5～1.5h，采用0.5μm滤膜真空抽滤，收集滤过液，得牡蛎肽液。本发明方法利用脂肪酶对酶解体系中的脂肪进行水解，破坏酶解体系中的乳化平衡，促使水相和油相分离。该法水解条件温和、过程安全可控，可实现大规模工业生产。

Description

一种从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法
技术领域
本发明属于牡蛎深加工领域，具体涉及一种从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法。
背景技术
牡蛎是世界上第一大养殖贝类，也是我国四大海水养殖贝类之一，沿海各个省份均有分布。牡蛎不仅营养丰富，而且还具有味道鲜、功效好等特点，备受消费者的喜爱。
牡蛎肉中含有丰富的蛋白质(45～57％)、脂肪(7～11％)和糖原(19～38％)，此外，还含有充足的维生素和锌、钙、硒、铁等矿物质。牡蛎蛋白是一种优质蛋白质，含有丰富的氨基酸，必需氨基酸完全程度和质量比例优于人乳和牛乳，除了人体必需的20种常用氨基酸外，还含有β-氨基丙酸、γ-氨基丁酸、鸟氨酸、牛磺酸等多种具有重要生理价值的氨基酸。牡蛎肉中糖原含量丰富，是组织能源的一种储备形式。糖原可以被机体直接吸收，减轻胰脏负担，也具有改善心脏及血循环、抗疲劳和增强肝脏功能等功效。牡蛎中的脂肪多为具有生理活性的复合磷脂、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等不饱和脂肪酸。
《本草纲目》记载：牡蛎肉“多食之，能滋润皮肤，补肾壮阳，并能治虚，解丹毒”。牡蛎及其提取物具有降血糖、降血压、降血脂、增强免疫力、抗疲劳、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抑菌和护肝的功能等多重生理活性。
牡蛎捕捞后极易被微生物污染而腐败变质，保藏期短，且牡蛎保鲜贮运链条不完善，长时间保存和远距离运输均存在困难，导致牡蛎的开发利用受到限制。运用生物酶解加工技术处理牡蛎，能够增加产品附加值，制备的酶解产物含有丰富的小肽、多肽和氨基酸等营养成分，具有多重生理功能价值，可用于生产功能性肽等保健品。
已有研究表明牡蛎肽在壮阳、抗肿瘤、抗氧化、降血压、降血糖、增强机体免疫等方面具有特殊的生理活性。但是在实际生产中，牡蛎肽的分离提取存在极大困难。牡蛎蛋白酶解液中含有多肽和未降解的蛋白、油脂和糖类等复杂组分，形成稳定的乳化体系，单独采用离心或抽滤分离的效果均不佳。采用离心技术分离时，牡蛎蛋白酶解液水相和油相界面不清，难以分离，严重影响酶解产物的分离，目标肽得率不高。而抽滤分离牡蛎肽耗时过长，在加工过程中易发生变质，产能低。
因此，采用工艺简单、操作简便、成本低廉的方法分离提取活性物质，具有较大的经济价值和现实意义。酶解技术无需特殊设备，且其反应特异性强、高效、条件温和、易于控制、安全性较高，且有大规模工业化生产的潜力。而真空抽滤分离技术操作方便快捷，可连续不间断运作，分离效率高，将其与酶解技术结合高效快速分离牡蛎肽具有可操作性。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法，该方法的要点在于加入乳化剂促使脂肪酶与牡蛎酶解产物的充分接触，通过脂肪酶水解作用降解牡蛎酶解体系中的脂肪组分，促使牡蛎酶解产物破乳使得油脂与水相分离；然后采用细胞壁多糖和活性炭高效吸附酶解体系中的水不溶物，并在滤膜上形成滤饼，实现牡蛎肽的快速分离。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的牡蛎肽。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法，包括以下步骤：
(1)牡蛎酶解体系的破乳：往灭酶后的牡蛎酶解液中加入乳化剂，调节牡蛎酶解液pH值至7.0～8.0，加入脂肪酶，充分混匀，在35～50℃下保温水解4～8h，灭酶，得到牡蛎二次酶解产物；以牡蛎酶解液质量(干物质计)为计算基准，乳化剂的加入量占0.10～0.35％，脂肪酶的加入量占1.0～2.0％；
(2)牡蛎肽的分离：往二次酶解产物中加入酵母细胞壁多糖和活性炭，在50～60℃保温中振荡0.5～1.5h，采用0.5μm滤膜真空抽滤，收集滤过液，得牡蛎肽液；真空浓缩至固形物为35～45％，进行喷雾干燥，得到牡蛎肽；
步骤(1)中所述的牡蛎酶解液是以牡蛎肉为原料，加入蛋白酶酶解后得到的；
所述的蛋白酶优选木瓜蛋白酶、胰酶或碱性蛋白酶；蛋白酶的加入量是牡蛎肉质量的0.2-0.4％，优选在pH值6.0-7.0、温度50-60℃下酶解5-6h；
步骤(1)中所述的乳化剂优选单甘脂和/或蔗糖酯；
步骤(1)所述的调节牡蛎酶解液pH值是用0.5mol/L的NaOH溶液或HCl溶液调节；
步骤(1)中所述的脂肪酶优选诺维信公司的磷脂酶A1(Lecitase Ultra)；
步骤(1)中所述的充分混合是指采用转速120r/min以上快速搅拌酶解体系使之与脂肪酶充分接触；
步骤(1)所述的灭酶是将反应体系在95℃下加热15min；
步骤(2)中所述的酵母细胞壁多糖的加入量占牡蛎二次酶解产物质量的0.5～1.0％；
步骤(2)所述的活性炭的加入量占牡蛎二次酶解产物质量的0.5～1.5％。
由上述方法制得的牡蛎肽为乳白色或淡黄色粉末。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)由于牡蛎蛋白酶解液中的蛋白和多肽具有较强的乳化特性，在水体系中易与牡蛎中的磷脂等油脂发生相互作用形成乳浊液，使得油水难以分离，导致酶解产物难于分离：若采用离心机对牡蛎蛋白酶解液直接进行分离，由于沉淀与清液界面不清，分离效果较差，效率低下；若采用过滤法分离，乳浊液中的油脂会堵塞滤孔，导致无法分离。本发明方法利用脂肪酶对酶解体系中的脂肪进行水解，破坏酶解体系中的乳化平衡，促使水相和油相分离。该法水解条件温和、过程安全可控，可实现大规模工业生产。
(2)本发明加入的乳化剂可增加脂肪酶与脂肪的接触面积，提高脂肪酶酶解效率，充分水解脂肪，实现油水分离；
(3)本发明采用酵母细胞壁多糖和活性炭作为吸附剂和助滤剂，一方面可促使滤饼形成，加速水相的过滤，实现牡蛎肽的快速分离；另一方面可吸附牡蛎肽中的腥味和苦味，以及可起到脱色的作用。
(4)本发明工艺简单、操作简便、生产成本低、没有任何污染、蛋白回收率高，所得蛋白多肽类物质品质高，可广泛应用于保健品、调味品等食品领域中。
附图说明
图1是实施例和对比例产品的蛋白回收率对比图。
图2是实施例和对比例产品的抽真空过滤耗时对比图。
图3是实施例和对比例产品的脂肪含量对比图。
图4是实施例和对比例产品的肽含量对比图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中所涉及的试验指标其实验方法如下：
粗蛋白的测定：
凯氏定氮法测定/GB 5009.5-2010。
抽真空过滤耗时的测定：
取1kg牡蛎二次酶解液加入一定量酵母细胞壁多糖和活性炭，在50℃～60℃保温中振荡0.5～1.5h后，采用0.5μm滤膜真空抽滤时，从开始抽滤起计时，直至酶解液全部滤过，记录总耗时。
脂肪的测定：
索式抽提法测定/GB/T 5009.6-2003。
游离氨态氮含量的测定：
采用甲醛电位滴定法测定样品的游离氨态氮含量，以蒸馏水为空白对照，取2g样品，加入蒸馏水至80g，以0.1mol/L的NaOH滴定至pH值8.2，加入10mL甲醛，继续滴定至pH9.2，得空白对照组和样品加入甲醛后消耗的NaOH体积V0及Vi。产物的游离氨态氮含量为：
游离氨肽氮含量(％)＝(Vi-V0)×0.7×100％
肽含量的测定：
取2ml酶解液(蛋白含量约20mg/ml)，加入等体积的10％的TCA溶液，混合均匀后静置30min，然后4000r/min条件下离心10min，取上清液分别测定总氮含量和游离氨氮含量。则肽含量为：
实施例1
一种从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法，包括以下步骤：
(1)新鲜牡蛎肉清洗干净，按质量比1:1加水搅拌混合，过胶体磨得到牡蛎浆液；然后调节体系pH值至7.0，加入牡蛎肉质量0.2％的木瓜蛋白酶，在55℃下水解6小时，然后在90℃下加热15min灭酶，得牡蛎酶解液；
(2)往灭酶后的牡蛎酶解液中加入牡蛎酶解液质量(干物质计)0.15％的蔗糖酯和0.15％的单甘脂，调节牡蛎酶解液pH值至8.0，加入牡蛎酶解液质量(干物质计)1.0％的脂肪酶，充分混匀，在35℃下保温水解8h，然后在95℃下加热15min灭酶，得到牡蛎二次酶解产物；
(2)往二次酶解产物中加入牡蛎二次酶解产物质量1.0％的酵母细胞壁多糖和0.5％的活性炭，在55℃保温中振荡1.0h，采用0.5μm滤膜真空抽滤，收集滤过液，得牡蛎肽液；真空浓缩至固形物为35％，进行喷雾干燥，得到牡蛎肽1。
实施例2
一种从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法，包括以下步骤：
(1)新鲜牡蛎肉清洗干净，按质量比1:1加水搅拌混合，过胶体磨得到牡蛎浆液；然后调节体系pH值至6.0，加入牡蛎肉质量0.2％的胰酶，在50℃下水解5小时，然后在90℃下加热15min灭酶，得牡蛎酶解液；
(2)牡蛎酶解体系的破乳：往灭酶后的牡蛎酶解液中加入牡蛎酶解液质量(干物质计)0.08％的蔗糖酯和0.12％的单甘脂，调节牡蛎酶解液pH值至7.0，加入牡蛎酶解液质量(干物质计)1.5％的脂肪酶，充分混匀，在40℃下保温水解6h，然后在95℃下加热15min灭酶，得到牡蛎二次酶解产物；
(2)往二次酶解产物中加入牡蛎二次酶解产物质量0.8％的酵母细胞壁多糖和1.0％的活性炭，在60℃保温中振荡0.5h，采用0.5μm滤膜真空抽滤，收集滤过液，得牡蛎肽液；真空浓缩至固形物为40％，进行喷雾干燥，得到牡蛎肽2。
实施例3
一种从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法，包括以下步骤：
(1)新鲜牡蛎肉清洗干净，按质量比1:1加水搅拌混合，过胶体磨得到牡蛎浆液；然后调节体系pH值至6.5，加入牡蛎肉质量0.4％的碱性蛋白酶，在60℃下水解5小时，然后在90℃下加热15min灭酶，得牡蛎酶解液；
(2)往灭酶后的牡蛎酶解液中加入牡蛎酶解液质量(干物质计)0.05％的蔗糖酯和0.05％的单甘脂，调节牡蛎酶解液pH值至7.5，加入牡蛎酶解液质量(干物质计)2.0％的脂肪酶，充分混匀，在35℃下保温水解4h，然后在95℃下加热15min灭酶，得到牡蛎二次酶解产物；
(2)牡蛎肽的分离：往二次酶解产物中加入牡蛎二次酶解产物质量1.0％的酵母细胞壁多糖和1.5％的活性炭，在50℃保温中振荡1.5h，采用0.5μm滤膜真空抽滤，收集滤过液，得牡蛎肽液；真空浓缩至固形物为45％，进行喷雾干燥，得到牡蛎肽3。
对比例1
一种从牡蛎酶解液中分离牡蛎肽的方法，包括以下步骤：
(1)新鲜牡蛎肉清洗干净，按质量比1:1加水搅拌混合，过胶体磨得到牡蛎浆液；然后调节体系pH值至7.0，加入牡蛎肉质量0.2％的木瓜蛋白酶，在55℃下水解6小时，然后在90℃下加热15min灭酶，得牡蛎酶解液；
(2)将灭酶后的牡蛎酶解液在4℃的条件下5000r/min下离心15min，取上清液，得牡蛎肽液；真空浓缩至固形物为35％，进行喷雾干燥，得到牡蛎肽A。
对比例2
一种从牡蛎酶解液中分离牡蛎肽的方法，包括以下步骤：
(1)新鲜牡蛎肉清洗干净，按质量比1:1加水搅拌混合，过胶体磨得到牡蛎浆液；然后调节体系pH值至7.0，加入牡蛎肉质量0.2％的木瓜蛋白酶，在55℃下水解6小时，然后在90℃下加热15min灭酶，得牡蛎酶解液；
(2)往牡蛎酶解液中加入其质量1.0％的酵母细胞壁多糖和0.5％的活性炭，在55℃保温中振荡1.0h，采用0.5μm滤膜真空抽滤，收集滤过液，得牡蛎肽液；真空浓缩至固形物为35％，进行喷雾干燥，得到牡蛎肽B。
牡蛎酶解液的工业化生产要求分离效果好、生产效率高，且能够连续操作。蛋白回收率是评价酶解液生产能力的重要指标。
由图1可知，采用本发明方法对牡蛎酶解液进行分离时，获得的牡蛎肽(牡蛎肽1、2、3)的蛋白回收率显著高于对比例的牡蛎肽(牡蛎肽A和B)，实现了对原料的高值利用。主要是因为本发明中，通过乳化剂的辅助使脂肪酶与酶解系统中的油脂充分接触，利用脂肪酶酶解牡蛎蛋白酶解液中的磷脂等脂肪，破坏蛋白和脂肪的相互作用，降低乳状液的稳定性，从而使油水分离开，利于牡蛎肽的分离。而对比例1中，采用离心技术可以去除牡蛎酶解液的主要杂质，但是沉淀与清液界面不清，分离效果较差，蛋白回收率低。对比例2中采用尽管采用本发明专利中的活性炭和酵母细胞壁多糖吸附辅助过滤，但由于牡蛎酶解产物中乳化稳定性较好，分离仍不理想，仍有部分油脂通过滤纸进入牡蛎肽中，从而降低了牡蛎肽的蛋白回收率。表明采用本专利中的脂肪酶水解结合吸附过滤分离在分离牡蛎肽中具有显著的优势。
牡蛎酶解液中含有丰富的营养物质，在生产中长时间加工处理易感染微生物导致腐败变质。因此，简化分离工艺，缩短分离提取时间具有重要意义。
如图2所示，实施例1-3的分离时间较对比例2显著缩短。实施例与对比例最大的区别在于实施例采用了本发明中的乳化剂辅助脂肪酶水解牡蛎酶解液中脂肪组分，促使乳液失稳，分离速度加快，提高抽滤效率，降低开发和加工成本。对比例2中牡蛎蛋白酶解液乳化稳定性好，在过滤过程中，乳浊液中的油脂会堵塞滤孔，水分被锁在乳液体系中难以分离出来，随着时间的延长分离难度越大，甚至导致无法分离。因此，单独采用真空抽滤分离牡蛎肽(牡蛎肽B)，分离时间过长，不适于工业生产。
目标牡蛎肽的纯度直接反映了产品的品质，决定了产品的销售价格。由图3和图4可看出，本发明中分离方法获得的牡蛎肽(牡蛎肽1、2、3)含量肽含量高，脂肪含量低。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)牡蛎酶解体系的破乳：往灭酶后的牡蛎酶解液中加入乳化剂，调节牡蛎酶解液pH值至7.0～8.0，加入脂肪酶，充分混匀，在35～50℃下保温水解4～8h，灭酶，得到牡蛎二次酶解产物；以牡蛎酶解液质量(干物质计)为计算基准，乳化剂的加入量占0.10～0.35％，脂肪酶的加入量占1.0～2.0％；
(2)牡蛎肽的分离：往二次酶解产物中加入酵母细胞壁多糖和活性炭，在50～60℃保温中振荡0.5～1.5h，采用0.5μm滤膜真空抽滤，收集滤过液，得牡蛎肽液；
酵母细胞壁多糖的加入量占牡蛎二次酶解产物质量的0.5～1.0％；
活性炭的加入量占牡蛎二次酶解产物质量的0.5～1.5％。
2.根据权利要求1所述的从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法，其特征在于：步骤(2)中，将牡蛎肽液真空浓缩至固形物为35～45％，进行喷雾干燥，得到牡蛎肽。
3.根据权利要求1所述的从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的牡蛎酶解液是以牡蛎肉为原料，加入蛋白酶酶解后得到的。
4.根据权利要求3所述的从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法，其特征在于：所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰酶或碱性蛋白酶；蛋白酶的加入量是牡蛎肉质量的0.2-0.4％，在pH值6.0-7.0、温度50-60℃下酶解5-6h。
5.根据权利要求1所述的从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的乳化剂为单甘脂和/或蔗糖酯。
6.根据权利要求1所述的从牡蛎酶解液中快速分离牡蛎肽的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的脂肪酶为诺维信公司的磷脂酶A1。
7.一种牡蛎肽，其特征在于：是由权利要求1-6任一项所述的方法制备得到。
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