CN1203175C - 植物蛋白水解复合酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明阐述了一种在分解植物蛋白时能使之变成更容易被人体吸收的小分子量的蛋白、多肽、氨基酸的复合酶，以及该复合酶的制备方法，它包括内切酶、外切酶、风味酶，用该复合酶分解植物蛋白，其蛋白质利用率为88-92%，氨基酸生成率为65-75%，植物蛋白水解度大于65%，水解液氨基酸含量大于1.32克/100毫升，游离氨基酸总量在8.5克/100毫升以上，植物蛋白水解液具有特有的大豆风味及浓郁的酱香味、很好的营养性及食品安全性，绝不含三氯丙醇等对人体有害物质。

Description

植物蛋白水解复合酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种能分解植物蛋白、使之变成更容易被人体吸收的小分子量的蛋白、多肽、氨基酸的复合酶，以及该复合酶的制备方法。

背景技术

植物蛋白占世界蛋白供应总量的70％以上，其营养价值观与动物蛋白接近，且胆固醇含量低，含有人体必需氨基酸，是人类食用蛋白质的重要来源，但植物蛋白还存在的不足之处是蛋白质分子量较大，人体吸收不完全，有的植物蛋白含有一些毒素成分，如棉酚、抗消化因子等，有的味觉不好，如豆腥味、涩味、苦味等，所以目前许多技术人员都在研究如何对植物蛋白进行水解，使之能将大分子的各种植物蛋白水解生成蛋白胨、多肽及氨基酸等物质，降低植物蛋白分子量，提高溶解性，改善营养价值和食用风味等特性，以拓宽人们的食品结构和营养成分。

目前所知的植物蛋白分解法主要有化学法和生物法。化学法常用的是酸法和碱法，酸法水解易产生胺、吡啶等含氮化合物和硫化氢等有毒物质，还会发生氨基酸褐变、焦化、破坏以及香气挥发等弊病，而且需要中和所加入的酸，副产大量盐份，对设备的防腐性要求也高；而碱法水解易产生外消旋作用，降低其营养价值；生物方法是近代人们用来分解植物蛋白最为活跃研究的课题，众所周知，中华民族是最早使用微生物来分解植物蛋白的民族，早在一千多年前，我国古代已经懂得了制作豆腐乳、酱油和一些豆制品。现代生物分解植物蛋白的方法已经得到了一定的应用，经检索，我国的中文科技期刊和专利公报公开了某些生物酶酶法水解蛋白的方法，如中国专利90106858公开的方法是先将植物蛋白加入到至少含一种蛋白酶的水解液中水解，然后将水解的可溶性蛋白分离，将酸加入到水解的可溶性蛋白中，并加热混合物使水解产物基本脱除酰氨基，最后中和脱除酰氨基的产物，得到不含氯丙醇的植物蛋白；中国专利94191903公开的水解蛋白的方法是用来自米曲霉且含有五种蛋白水解成分，达到水解度高、风味好、蛋白质溶解性强的目的；另一份中国专利97199321是通过制取植物蛋白和不溶性植物材料的浆料，用蛋白酶处理该浆料使蛋白质水解，再熟化，分离出不溶性材料，其中所用的酶采用蛋白酶和糖酶。《山东科学》1997年第一期介绍植物蛋白的酶法水解是用中性蛋白酶添加纤维素酶和淀粉酶对豆粕进行水解，取得了较好的效果；《粮食与油脂》1999年第二期介绍了酶法制取棉籽水解蛋白的研究，它是选用中性蛋白酶对棉籽水解，可以去除有毒棉酚，蛋白质的水解更好。

以上所述的植物蛋白酶法水解基本上局限于某种单一的酶，虽然蛋白质可以得到水解，但得到的水解物氨基酸含量较低，营养价值不高，风味较差，达不到实际应用要求，所以人们对植物蛋白加工和利用的研究还在探索阶段，以满足日益增长的蛋白质需求。

技术内容

为了更好地利用植物蛋白，本发明人在深入研究传统微生物发酵工艺与现代生物酶水解机理基础上，结合植物蛋白质结构特点，对能水解植物蛋白的多种酶进行研究，发现了新的方法，也开拓了另一种思路。本发明的技术方案如下：

植物蛋白水解复合酶包括内切酶、外切酶、风味酶。

所述的内切酶包括木瓜酶或菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶等，其中内切酶的酶活为20000～2000000u/g，内切酶在总的植物蛋白水解复合酶中占10-75％，也可以选用这些内切酶的混合物；

所述的外切酶包括米曲霉或米根霉、黑曲霉等发酵制备的生物酶，外切酶的酶活为2500～250000u/g，外切酶在总的植物蛋白水解复合酶中占10-70％，也可以选用这些外切酶的混合物；

所述的风味酶包括乳酸菌、酵母菌等发酵制备的生物酶，风味酶的酶活为500～50000u/g，风味酶在总的植物蛋白水解复合酶中占5-30％；

为了使本发明的植物蛋白水解复合酶能够在常温下保存，还需要在其中加入一些保护剂，所述的保护剂可以选用硫酸盐，例如硫酸钠、焦亚硫酸钠，也可以选用L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐，保护剂在总的植物蛋白水解复合酶中占0.5-5％。

以上所述的植物蛋白水解复合酶是将内切酶、外切酶、风味酶混合或经过发酵制备才能得到，其制备方法是按常规方法制取内切酶，和利用发酵法制取外切酶和风味酶，再按比例混合得到，具体步骤为：

(1)内切酶的制备，以木瓜蛋白酶制备为例，从木瓜树或果实取下新鲜木瓜浆，先用蒸馏水或去离子水冲稀或溶解木瓜胶乳，加入无机酸使杂质沉淀，离心、过滤，经微滤与超滤、浓缩、真空冷冻干燥、粉碎、密封保存备用。菠萝蛋白酶的制备也按照此方法；中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶的制备，用已知方法经发酵提取得到。

(2)外切酶的制备，以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30-50℃，湿度70-90％的密闭容器中发酵2-5天，提取、再干燥，密封保存备用。

(3)风味酶的制备，以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵1-4天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。

(4)上述制备好的内切酶、外切酶、风味酶存放在阴凉、干燥的地方，可以保存3-5个月，使用时将所需要的植物蛋白水解复合酶中的成份经粉碎、灭菌，按上述要求的比例混合，在一定酶解工艺条件下，可以将大豆制品或含植物蛋白的物料酶解制得各种营养丰富的饮料、酱料、风味食品等植物蛋白水解产品。

综观已有的植物蛋白分解法，由于他们采用的酶是单一的，或者是内切酶，或者是外切酶或者是风味酶，也没有提到三者的结合，因而分解蛋白的效果较差，大部分不能完全将大分子的植物蛋白变成多肽和氨基酸，营养成分不完全，人体吸收不好，更没有好的口感。而本发明在所设定的温度、PH值和时间的条件下，通过内切酶和外切酶的共同作用下，打开了植物蛋白的复杂结构，破坏了其中稳定的物理化学键，使蛋白分子结构变得松散，非极性蛋白基团暴露出来，有利于蛋白内切酶作用加快植物蛋白水解；另外，在植物蛋白水解复合酶中的内切酶作用下，切断植物蛋白质7S及11S大分子肽链内部的肽键，生成分子量较小的蛋白胨和多肽等中间产物，然后由植物蛋白水解复合酶中的外切酶把多肽中游离羧基末端和氨基末端逐一切断肽键水解生成低分子小肽和生物活性氨基酸等物质，辅以风味酶调节，以获得营养丰富、水解度高、功能性优及风味好的植物蛋白水解产品。具体反应的酶解机理如以下化学反应式表示：

            外切酶                         内切酶            外切酶

     氨基酸                      肽                     氨基酸                 氨基酸

风味酶的加入，调控水解生产香鲜味的氨基酸，减少苦味氨基酸的生成，同时，还能生成醇类，与有机酸生成香味酯，能使植物蛋白水解产品的味道更好，香气更浓。

此外，加入保护剂硫酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸等，保护生物酶活性基团不受破坏，使酶活保持不变。

与现有技术相比，本发明的突出的实质性特点和显著的进步是：

1、研制出一种新的植物蛋白水解专用复合酶，经发酵、提取、分离得到可用于植物蛋白水解的外切酶及风味酶。

2、植物蛋白酶水解液氨基酸含量大于0.95克/100毫升，最高可达1.32克/100毫升，游离氨基酸总量在8.5克/100毫升以上。

3、植物蛋白质水解利用率大于88％，氨基酸生成率70％以上，植物蛋白水解度可达70％以上。

4、植物蛋白水解液具有特有的大豆风味及浓郁的酱香味、很好的营养性及食品安全性，不含三氯丙醇等对人体有害物质。

5、在较宽的PH值范围内酶法植物蛋白水解产物溶解性变化很小，即在酸性饮料中添加也不会出现沉淀。

6、酶水解产物具有很好乳化性和起泡性、促进发酵的特性及口感性。

本发明人使用上述制备的植物蛋白水解复合酶处理植物蛋白，其酶解产物的氨基酸含量达到1.32克/100毫升，游离氨基酸总量达到8.5克/100毫升，鲜味浓郁，口感独特。

具体实施方式

实施例1

内切酶的制备：以木瓜蛋白酶制备为例，从木瓜树或果实取下新鲜木瓜浆，先用蒸馏水或去离子水冲稀或溶解木瓜胶乳，加入无机酸使杂质沉淀，离心、过滤，经微滤与超滤、浓缩、真空冷冻干燥、粉碎、得木瓜蛋白酶，密封保存备用。

外切酶的制备：以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30℃，湿度90％的密闭容器中发酵3天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。

风味酶的制备：以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵2天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。

将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数64∶30∶5的比例，并加入1份焦亚硫酸钠，混合，得到植物蛋白水解复合酶，置于10℃的冰箱保存，五个月不变质。

实施例2

内切酶的制备：取新鲜菠萝及皮，打碎取汁，加入无机酸使杂质沉淀，离心、过滤，经微滤与超滤、浓缩、真空冷冻干燥、粉碎、得菠萝蛋白酶，密封保存备用。

外切酶的制备：以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在35℃，湿度80％的密闭容器中发酵5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。

风味酶的制备：以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵3天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。

将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数40∶49∶10的比例，并加入1份L-半胱氨酸，混合，得到植物蛋白水解复合酶，置于10℃的冰箱保存，五个月不变质。

实施例3

内切酶的制备：以木瓜蛋白酶制备为例，从木瓜树或果实取下新鲜木瓜浆，先用蒸馏水或去离子水冲稀或溶解木瓜胶乳，加入无机酸使杂质沉淀，离心、过滤，经微滤与超滤、浓缩、真空冷冻干燥、粉碎、得木瓜蛋白酶，密封保存备用。

外切酶的制备：以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在50℃，湿度70％的密闭容器中发酵2天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。

风味酶的制备：以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵4天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。

将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数20∶70∶9的比例，并加入1份L-半胱氨酸盐酸盐，混合，得到植物蛋白水解复合酶，置于10℃的冰箱保存，五个月不变质。

实施例4

内切酶的制备：中性蛋白酶的制备，用已知方法经发酵提取得到，密封保存备用。

外切酶的制备：以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30℃，湿度90％的密闭容器中发酵4.5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。

风味酶的制备：以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵3.5天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。

将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数10∶59∶30的比例，并加入1份焦亚硫酸钠，混合，得到植物蛋白水解复合酶，置于10℃的冰箱保存，五个月不变质。

实施例5

内切酶的制备：碱性蛋白酶制备，用已知方法经发酵提取得到，密封保存备用。

外切酶的制备：以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30℃，湿度88％的密闭容器中发酵2.5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。

风味酶的制备：以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵2.5天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。

将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数75∶10∶14的比例，并加入1份焦亚硫酸钠，混合，得到植物蛋白水解复合酶，置于10℃的冰箱保存，五个月不变质。

实施例6

内切酶的制备：以木瓜蛋白酶制备为例，从木瓜树或果实取下新鲜木瓜浆，先用蒸馏水或去离子水冲稀或溶解木瓜胶乳，加入无机酸使杂质沉淀，离心、过滤，经微滤与超滤、浓缩、真空冷冻干燥、粉碎、得木瓜蛋白酶，密封保存备用。

外切酶的制备：以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30℃，湿度85％的密闭容器中发酵3.5天，提取、再干燥，得外切酶，密封保存备用。

风味酶的制备：以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌等菌种，在常温下发酵1.5天，提取、分离、超滤等方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用。

将上述的内切酶、外切酶、风味酶按质量份数50∶34∶15的比例，并加入1份焦亚硫酸钠，即称取50kg木瓜蛋白酶，34kg外切酶，15kg风味酶及1kg焦亚硫酸钠，混合，得100kg植物蛋白水解复合酶，置于10℃的冰箱保存，五个月不变质。

本发明人对用上述方法制备得到的植物蛋白水解复合酶采取紫外法进行酶活测定，其中内切酶的酶活为20000～2000000u/g；外切酶的酶活为2500～250000u/g，风味酶的酶活为500～50000u/g。

本发明人对用上述方法制备得到的植物蛋白水解复合酶做大豆植物蛋白分解试验，方法是：先将大豆或大豆粕用热水(1∶2-5W/W)浸泡0.5-2小时，胶体磨均质，高温高压蒸煮，在4-7的PH值及25-70℃的温度下，按质量含量0.5-2％添加植物蛋白水解复合酶于其中，酶解3-6天后，测得水解液氨基酸含量最高可达1.32克/100毫升，游离氨基酸总量在8.5克/100毫升，并有浓郁的大豆香味。

本发明的植物蛋白水解复合酶可以在植物蛋白深加工中应用，它可以将复合酶或其植物蛋白水解液用于制造酱油或调味品、汤料、肉类香精、氨基酸制品等产品。

Claims (8)

1、一种植物蛋白水解复合酶，其特征在于它包含有内切酶和外切酶、风味酶。

2、根据权利要求1所述的植物蛋白水解复合酶，其特征在于内切酶在木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中选用，或者选用这些内切酶的混合物，内切酶的酶活为20000～2000000u/g，内切酶在总的植物蛋白水解复合酶中占10-75％。

3、根据权利要求1所述的植物蛋白水解复合酶，其特征在于外切酶在米曲霉或米根霉、黑曲霉的发酵物提取中选用，或者选用这些外切酶的混合物，外切酶的酶活为2500～250000u/g，外切酶在总的植物蛋白水解复合酶中占10-70％。

4、根据权利要求1所述的植物蛋白水解复合酶，其特征在于风味酶在乳酸菌或酵母菌的发酵物提取中选用，或者选用这些风味酶的混合物，风味酶的酶活为500～50000u/g，风味酶在总的植物蛋白水解复合酶中占5-30％。

5、根据权利要求1所述的植物蛋白水解复合酶，其特征在于植物蛋白水解复合酶混合物中还包括有保护剂，保护剂在硫酸钠、焦亚硫酸钠选用，或者选用L-胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐，保护剂在总的植物蛋白水解复合酶中占0.5-5％。

6、一种如权利要求1所述的植物蛋白水解复合酶的制备方法，其特征在于按常规方法制取内切酶，和利用发酵法制取外切酶和风味酶，再按比例混合得到，具体步骤为：

(1)内切酶的制备，取新鲜木瓜浆或菠萝汁，先用蒸馏水或去离子水冲稀或溶解木瓜胶乳，加入无机酸到菠萝汁或木瓜胶乳中，使杂质沉淀，离心、过滤，经微滤和超滤、浓缩、真空冷冻干燥、粉碎、密封保存备用；中性蛋白酶、碱性蛋白酶的制备，用已知方法经发酵提取得到；

(2)外切酶的制备，以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，加入米曲霉或米根霉、黑曲霉在30-50℃，湿度70-90％的密闭容器中发酵2-5天，提取、再干燥，密封保存备用；

(3)风味酶的制备，以大豆或豆粕、麦麸为原料，按常规的方法，将大豆或豆粕、麦麸粉碎，先灭菌，再加入乳酸菌、酵母菌，在常温下发酵1-4天，提取、分离、超滤方法取得溶液，然后冻干，粉碎得到风味酶，保存备用；

(4)上述制备好的内切酶、外切酶、风味酶存放在阴凉、干燥的地方。

7、一种如权利要求1所述的植物蛋白水解复合酶的在植物蛋白酶解中应用，其特征在于先将植物蛋白用热水浸泡，蒸煮，在4-7的PH值及25-70℃的温度下，按质量含量0.05-2％添加植物蛋白水解复合酶于其中，酶解3-6天。

8、根据权利要求1和7的植物蛋白水解复合酶用在植物蛋白深加工中的应用，其特征在于植物蛋白复合酶或其植物蛋白水解液在酱油或调味品、汤料、肉类香精、氨基酸制品方面的应用。