CN106243078B - 伏康树中化合物的制备方法和用途 - Google Patents

伏康树中化合物的制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了伏康树中化合物的制备方法，包括以下步骤：取伏康树树皮，乙酸乙酯渗漉提取，减压干燥渗漉液得浸膏，柱层析，用石油醚‑乙酸乙酯洗脱，收集各段液体，继续分离纯化即得。该方法可以有效从伏康树中提取制备出多种化合物。本发明还公开了这些化合物的抗肿瘤用途，具有广阔的市场前景。

Description

伏康树中化合物的制备方法和用途
技术领域
本发明涉及伏康树中化合物的制备方法和用途。
背景技术
伏康树(Voacanga africana Staph.)为夹竹桃科(Apocynaceae)马铃果属(Voacanga)植物，广泛分布在西非、刚果、坦桑尼亚等地，主要分布于次生林和过渡区。在非洲传统用于治疗麻风病、腹泻、全身水肿、小儿惊风和癫狂症，也用作利尿剂和婴儿补剂。现代持续的科学研究发现，伏康树中含有生物碱、黄酮类、单宁、类固醇、萜类和香豆素类等类型的化学成分，其中生物碱是其主要化学成分和主要活性成分。有报道称伏康树是单萜吲哚类生物碱的重要来源，这些生物碱具有奇妙的碳骨架结构和良好的生物活性。
因此，有必要对伏康树中的化学成分进行提取并对其进行进一步研究。
发明内容
本发明提供了一种制备化合物的方法，所述化合物如为下述化合物中的任一种或多种：
其中，Me表示甲基；
包括以下步骤：
取伏康树树皮，乙酸乙酯渗漉提取，减压干燥渗漉液得浸膏，柱层析，用石油醚-乙酸乙酯洗脱，收集各段液体，继续分离纯化即得。
进一步地，所述化合物为12、13、14、15，制备方法的步骤如下：
A、取伏康树树皮，干燥，打粉，用14倍量乙酸乙酯渗漉提取，减压干燥渗漉液得浸膏；
B、运用硅胶柱层析石油醚：乙酸乙酯＝5:1,4:1,3:1,2:1,1:1,1:2,0:1，甲醇洗脱，并运用TLC点板合并为8段，分别为Fr.1-8；
C1：化合物12的制备：第1段Fr.1采用0.3mol/L HCl溶解和NaOH沉淀，再通过甲醇重结晶得到化合物12；
C2：化合物13的制备：第2段Fr.2运用硅胶柱层析石油醚：丙酮＝6:1,5:1,4:1,3:1,2:1,1:1洗脱，划分为6段，即Fr.2-1到Fr.2-6，Fr.2-6重结晶得到化合物13；
C3：化合物14和化合物15的制备：第3段Fr.3运用凝胶Sephadex LH-20,柱直径1cm，柱高160cm，流动相为氯仿：甲醇体积比为1:1，4个柱体积；等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第35-50个流份为化合物14，合并第60-75个流份为化合物15，氯仿：甲醇＝1:1纯化得到化合物14和化合物15。
进一步地，所述化合物为化合物1-11，制备方法的步骤如下：
(1)伏康树树皮干燥得药材，粉碎，14倍药材量乙酸乙酯渗滤提取，提取液浓缩得浸膏；
(2)分离：采用硅胶柱层析，流动相为：石油醚-乙酸乙酯＝5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，0:1，甲醇，梯度洗脱，按流动相合并为几个部位；运用TLC根据斑点显色情况将剩余样品合并为Ⅰ、Ⅱ和甲醇部位；
(3-1)
Ⅰ部位经MCI柱洗脱，柱体积314mL，流动相为甲醇：水体积比为40:60，3倍柱体积；50:50，3倍柱体积；60：40，3倍柱体积；80:20，3倍柱体积；100:0，3倍柱体积；梯度洗脱，每50mL收集一个流份，结合TLC点板划段；
(3-1-1)
化合物1的制备：合并第1-10个流份经Rp-8反相硅胶柱，柱体积56mL，流动相为甲醇：水体积比为15:85，3倍柱体积；20:80，3倍柱体积；25:75，3倍柱体积；30:70，3倍柱体积；35:65，3倍柱体积；梯度洗脱，每10mL收集一个流份，结合TLC点板划段；合并第50-67个流份经Sephadex LH-20柱洗脱，柱体积125mL，流动相为甲醇：水体积比为100:0，8个柱体积；等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第150-154个流份硫酸乙醇显紫色单一斑点，油状物化合物为化合物1；
(3-1-2)
化合物10的制备：合并第24-26个流份经Sephadex LH-20柱洗脱，柱体积125mL，流动相为甲醇：水体积比为90:10，4个柱体积；等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第51-56个流份硫酸乙醇显紫色单一斑点，白色粉末状物为化合物10；
(3-2)
Ⅱ部位用甲醇溶解，抽滤，滤液直接上MCI柱，经90％甲醇等度洗脱液作为样品；
90％甲醇洗脱的样品运用硅胶柱层析，柱直径4cm，柱高20cm，流动相为石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1，4倍柱体积；8:1，4倍柱体积；5:1，4倍柱体积；3:1，4倍柱体积；1:1，4倍柱体积；1:2，4倍柱体积；乙酸乙酯，4倍柱体积；甲醇，4倍柱体积；梯度洗脱；运用TLC点板分别合并每个梯度划分为8段FrⅡ.1-8；
(3-2-1)
化合物2和化合物3的制备：FrⅡ.1在50℃水浴温度下滴加甲醇，边滴加边振荡直至不再溶解，趁热过滤，滤液放置常温下有白色沉淀物析出，析出沉淀经凝胶Sephadex LH-20柱，柱体积125mL，流动相为氯仿：甲醇体积比为3:2，5个柱体积；等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第84-107个流份，再经Rp-8反相硅胶柱，柱直径2cm，柱高18cm，流动相为甲醇：水体积比为40:60，8倍柱体积；50:50，8倍柱体积；55:45，8倍柱体积；100:0，8倍柱体积；梯度洗脱，每10mL收集一个流份，结合TLC点板划段；合并第35-43个流份为化合物2；合并第49-161个流份为化合物3；
(3-2-2)
化合物4的制备：FrⅡ.5运用半制备HPLC，YMC-Pack ODS-A半制备高效液相色谱柱，250mm×10mm,S-5μm,12nm；流动相：65％甲醇/氨水；流速：4ml/min；检测波长：205nm；tR＝15min；纯化得化合物4；
(3-2-3)
化合物11的制备：FrⅡ.3-4经Rp-8反相硅胶柱，柱直径1cm，柱高15cm，流动相为甲醇：水体积比为50:50，3倍柱体积；60:40，3倍柱体积；70:30，3倍柱体积；80:20，3倍柱体积；90:10，3倍柱体积；梯度洗脱，每5mL收集一个流份，结合TLC点板合并第4-23个流份，再经Rp-8反相硅胶柱，柱直径1cm，柱高15cm，流动相为甲醇：水体积比为40:60，3倍柱体积；45:55，3倍柱体积；50:50，3倍柱体积；55:45，3倍柱体积；100:0，3倍柱体积；梯度洗脱，每5mL收集一个流份，结合TLC点板合并55％，100％甲醇洗脱液，再经Sephadex LH-20，柱直径1cm，柱高160cm，流动相为甲醇：水体积比为100:0，4个柱体积；等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第57-80个流份得到化合物11；
(3-3)
甲醇部位样品，采用硅胶柱层析，柱直径6cm，柱高20cm，流动相为氯仿：甲醇体积比为30:1，6倍柱体积；25:1，6倍柱体积；20:1，6倍柱体积；15:1，6倍柱体积；梯度洗脱，结合点板合并得到4个与流动相相应部位，30:1部位经Rp-8反相硅胶柱，柱直径3cm，柱高18cm，流动相为甲醇：水体积比为30:70，5倍柱体积；60:40，6倍柱体积；90:10，5倍柱体积；梯度洗脱，分别合并各梯度项下洗脱液，得到30％部位，60％部位，90％部位；
60％部位运用制备HPLC[LC-10ATVP系统，紫外-可见检测器，流动相甲醇/水：0-8min 60％，8-20min 60-100％，20-25min 100％，25-28min 100-60％，28-30min 60％；流速：10ml/min；检测波长：205nm；划分为3段Fr.1-Fr.3；
(3-3-1)
化合物5和化合物6的制备：Fr.1运用半制备HPLC，YMC-Pack ODS-A半制备高效液相色谱柱，250mm×10mm,S-5μm,12nm；流动相：65％甲醇/水等度；流速：1ml/min；检测波长：205nm；纯化，得到化合物5和化合物6；
(3-3-2)
化合物7：Fr.2运用半制备HPLC，YMC-Pack ODS-A半制备高效液相色谱柱，250mm×10mm,S-5μm,12nm，流动相：40％甲醇/水等度；流速：1ml/min；检测波长：205nm；纯化，得到化合物7；
(3-3-3)
化合物8和化合物9的制备：Fr.3运用Sephadex LH-20凝胶柱，柱直径1cm，柱高160cm，流动相为甲醇：水体积比为100:0，4个柱体积；等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合TLC点板合并第45-50个流份得到化合物8；合并第60-70个流份得到化合物9。
本发明还提供了所述化合物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的用途。
进一步地：所述化合物为化合物2、4、12、13和14中的任一种。
进一步地所述肿瘤为肝癌、皮肤黑色素瘤、乳腺癌、神经母细胞瘤和结肠癌中任一种或多种。
本发明还提供了一种药物组合物，它是以所述化合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
进一步地：所述化合物为化合物2、4、12、13或14中的任一种。
发明人课题组前期抗肿瘤活性筛选实验证明其伏康树提取物对非小细胞肺癌A549细胞具有生长抑制活性，课题组成员在对其生物碱化学成分和其乙酸乙酯部位化学成分研究的同时对分离得到的生物碱单体进行了抗肿瘤活性筛选，证明生物碱确实是具有良好的肿瘤细胞抑制活性。
本发明运用柱层析硅胶，凝胶(Sephadex LH-20)，MCI，Rp-8、18，制备，半制备，重结晶等先进的分离纯化手段从伏康树树皮乙酸乙酯剩余部位中分离得到11个化合物。运用波谱方法及理化性质确定出其中9个化合物，分别为：化合物1：boonein，化合物2：voacamine，化合物3：ibogamine-16-carboxylic acid,17,20-didehydro-5,6-dioxo-10-methoxy-methyl ester，化合物4：vobasine，化合物5：3-epivobasinol，化合物6：iboxigaina，化合物7：3-oxo-19-epi-voacristine，化合物8：19ˊ(S)-hydroxyconodurine，化合物9：19ˊ(S)-hydroxyconoduramine。除化合物2，4外，其余化合物均为首次从该植物中分离得到，化合物1为首次从该属植物中分离得到，化合物3为一个新化合物。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为伏康树的分离流程图。
具体实施方式
仪器：
HPLC制备(LC-10ATVP系统，紫外-可见检测器)；YMC-Pack ODS-A半制备高效液相色谱柱(250mm×10mm,S-5μm,12nm)；上海天美科学仪器公司紫外光谱仪UV1100；珀金埃尔默红外光谱测定仪(KBr压片)；瑞士Bruker公司Bruker Avance核磁共振仪(400/600MHz)；micrOTOF-Q II10339型质谱仪；Bruker APEX IISmart CCD型X-单晶衍射仪；昆山市超声仪器有限公司KQ-600DE型数控超声波清洗器(40kHz，600W)；北京赛多利斯仪器系统有限公司BP211D型电子分析天平；上海顾村电光仪器厂ZF-90型暗箱式紫外透射仪；上海精密科学仪器有限公司X-4显微测定熔点仪；成都超纯科技有限公司UPT超纯水机；烘箱；真空干燥箱；制备。
材料：
青岛海洋化工集团有限公司柱层析硅胶、薄层层析硅胶；美国Pharmacia公司Sephadex LH-20凝胶；日本三菱化学公司MCI GEL CHP-20P(75～150μm)；美国Merck公司Lichroprep RP-18gel反相填充材料；日本YMC公司YMC gel ODS-A(50μm)；试剂均为分析纯。
药材：
伏康树药材于2012年4月购自非洲加纳，经四川大学刘海峰博士鉴定为夹竹桃科植物伏康树(Voacanga africana Staph.)的树皮(标本存于成都中医药大学药学院中药化学实验室，编号FKS-20120421-JN)
实施例1化合物1-15的制备方法
1、化合物12、13、14、15的制备
伏康树树皮(14.5Kg)，干燥，打粉，用14倍量乙酸乙酯渗漉提取，减压干燥渗漉液得浸膏546g。运用硅胶柱层析(200-300目柱层析硅胶，柱直径10cm，柱高20cm)，流动相为石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1(6个柱体积)，4:1(6个柱体积)，3:1(6个柱体积)，2:1(5个柱体积)，1:1(5个柱体积)，1:2(5个柱体积)，0:1(5个柱体积)，甲醇(5个柱体积)梯度洗脱。运用TLC点板合并石油醚：乙酸乙酯＝5:1洗脱部分为第1段Fr.1；合并石油醚：乙酸乙酯＝4:1洗脱部分第2段Fr.2；合并石油醚：乙酸乙酯＝3:1洗脱部分为第3段Fr.3；合并石油醚：乙酸乙酯＝2:1洗脱部分为第4段Fr.4；合并石油醚：乙酸乙酯＝1:1洗脱部分为第5段Fr.5；合并石油醚：乙酸乙酯＝1:2洗脱部分第6段Fr.6；合并石油醚：乙酸乙酯＝0:1洗脱部分为第7段Fr.7；合并甲醇洗脱部分为第8段Fr.8。
第1段加入适量0.3mol/L HCl使其充分溶解后过滤，滤液滴加NaOH使其产生沉淀直至不再有沉淀生成，收集沉淀，在50℃水浴温度下往沉淀中滴加甲醇，边滴加边振荡直至沉淀不再溶解，趁热过滤，滤液放置常温下有晶体慢慢析出，所得晶体为化合物12(11g)。
第2段运用硅胶柱层析(200-300目柱层析硅胶，柱直径6cm，柱高20cm)，流动相为石油醚：丙酮体积比为6:1(2个柱体积)，5:1(2个柱体积)，4:1(2.5个柱体积)，3:1(2.5个柱体积)，2:1(3个柱体积)，1:1(6个柱体积)梯度洗脱。结合TLC点板分别合并每个梯度流份划分为6段(Fr.2-1to Fr.2-6)。Fr.2-6在50℃水浴温度下滴加甲醇，边滴加边振荡直至不再溶解，趁热过滤，滤液放置常温下有晶体慢慢析出，所得晶体为化合物13(12g)。
第3段运用凝胶Sephadex LH-20(柱直径1cm，柱高160cm)，流动相为氯仿：甲醇体积比为1:1(4个柱体积)等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第35-50个流份为化合物14(220mg)，合并第60-75个流份为化合物15(200mg)。
结构鉴定如下：
化合物12
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δH:7.68(1H,s,H-1),7.13(1H,d,J＝9Hz,H-12),6.92(1H,d,J＝2.0Hz,H-9),6.80(1H,dd,J＝9.0,2.0Hz,H-11),3.85(3H,s,-OMe),3.71(3H,s,-COOMe),3.54(1H,s,H-21),3.39(1H,m,H-5a),3.22(1H,m,H-5b),3.13(1H,m,H-6a),2.91(1H,m,H-3a),2.98(1H,dd,J＝16.0,1.0Hz,H-6b),2.81(1H,d,J＝9.0Hz,H-3b),2.57(H,d,J＝12Hz,H-17a),1.90(1H,dd,J＝12,2.0Hz,H-17b),1.87(1H,m,H-14),1.73(1H,t,J＝10.0Hz,H-15a),1.44-1.57(2H,m,H-19),1.32(1H,m,H-20),1.12(1H,dd,J＝10.0,7.2Hz,H-15b),0.9(3H,H-18).13C-NMR(150MHz,CDCl3)δC:175.7(C-22),154.0(C-10),137.5(C-2),130.5(C-13),129.2(C-8),111.8(C-11),111.08(C-12),110.1(C-7),100.7(C-9),57.5(-COOMe),56.0(-OMe),55.1(C-16),53.1(C-5),51.5(C-3),39.1(C-20),36.5(C-17),32.0(C-15),27.3(C-14),26.7(C-19),22.2(C-6),11.7(C-18)
化合物13
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:1.10(3H,d,J＝6.2Hz,H-18),1.97(1H,d,J＝13.6Hz,H-14),2.60(1H,d,J＝13.5Hz,19-OH),2.81(1H,d,J＝9.1Hz,6.6Hz,H-3a),3.05(1H,m,H-6a),3.01(1H,m,H-3b),3.11(1H,m,H-5a),3.15(1H,m,H-6b),3.46(1H,m,H-5b),3.72(3H,s,-COOCH3),3.82(1H,d,J＝11.5Hz,H-19),3.84(3H,s,-OCH3),3.86(1H,s,H-21),4.17(1H,m,H-21),6.82(1H,d,J＝8.7Hz,H-11),6.91(1H,s,H-9),7.14(1H,d,J＝8.7Hz,H-12),7.83(1H,s,H-1).13C-NMR(150MHz,CDCl3)δC:174.80(C-22),154.20(C-10),136.60(C-2),130.69(C-13),128.88(C-8),112.28(C-11),111.25(C-12),10961(C-7),100.75(C-9),71.30(C-19),59.79(C-21),56.03(C-16),54.08(-OCH3),52.94(-COOCH3),52.32(C-3),51.31(C-5),39.58(C-20),37.00(C-17),26.76(C-14),22.93(C-15),21.55(C-6),20.36(C-18)
化合物14
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δH:8.38(1H,s,H-1),7.14(1H,dd,J＝7.2,1.6Hz,H-12),6.91(1H,s,H-11),6.79(1H,d,J＝8.4Hz,H-9),4.15(1H,s,H-21),4.11(1H,dq,J＝4.8,2.4Hz,H-19),3.85(3H,s,-OMe),3.71(3H,s,-COOMe),3.43(1H,m,H-5a),3.10(1H,m,H-5b),3.05(2H,m,H-6),2.97(1H,m,H-3a),2.79(1H,d,J＝8.8Hz,H-3b),2.63(1H,d,J＝12.8Hz,H-17a),2.03(1H,m,H-17b),1.96(1H,m,H-14),1.88(1H,t,J＝6.8Hz,H-15a),1.48(1H,m,H-20),1.24(1H,dm,J＝6.8,5.2,2.0Hz,H-15b),1.11(3H,d,J＝5.6Hz,H-18).13C-NMR(150MHz,CDCl3)δC:174.6(C-22),153.8(C-10),136.7(C-2),130.6(C-13),128.5(C-8),111.8(C-11),111.2(C-7),109.2(C-12),100.3(C-9),71.2(C-19),59.5(C-21),55.7(10-OMe),53.9(C-16),52.7(C-5),52.1(C-OMe),51.2(C-3),39.2(C-20),36.6(C-17),26.5(C-14),22.7(C-15),21.3(C-6),20.1(C-18)
化合物15
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δH:7.91(1H,s,N-H),7.47(1H,d,J＝7.2Hz,H-12),7.26(1H,d,J＝10.2Hz,H-9),7.17(1H,t,J＝10.2Hz,H-10),7.09(1H,t,J＝10.2Hz,H-11),4.11(1H,dq,J＝6.0,3.0Hz,H-19),3.82(1H,s,H-21),3.62(3H,s,-COOMe),3.52(1H,m,H-5b),3.10-3.18(2H,m,H-5a,6b),3.05(1H,m,H-6a),2.61(2H,d,J＝14.0Hz,H-17b),2.16(1H,m,H-14),2.04(1H,m,H-17a),2.02(2H,dm,J＝12.0Hz,H-15b),1.93(lH,t,J＝10.8Hz,H-15a),1.48(1H,m,H-20),1.11(3H,d,J＝6.0Hz,H-18).13C-NMR(150MHz,CDCl3)δC:174.6(C-22),135.6(C-2,13),128.5(C-8),122.4(C-11),119.6(C-10),118.4(C-9),110.5(C-12),109.8(C-7),71.2(C-19),59.6(C-21),54.0(C-16),53.0(-OMe),52.4(C-5),51.5(C-3),39.5(C-20),36.9(C-17),26.7(C-14),22.9(C-15),21.3(C-6),20.4(C-18)
2、化合物1-11制备
药材提取
伏康树树皮干燥得药材14.5kg，粉碎，14倍药材量乙酸乙酯渗滤提取，提取液浓缩得浸膏546g。
分离
采用硅胶柱层析，流动相为：石油醚-乙酸乙酯(5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，0:1，甲醇)梯度洗脱，按流动相合并为几个部位。课题组成员前期完成了石油醚-乙酸乙酯(5:1，4:1，3:1)各部位的化学成分研究。本实验运用TLC根据斑点显色情况将剩余样品合并为Ⅰ、Ⅱ和甲醇部位。
Ⅰ部位经MCI GEL CHP-20P(75～150μm，柱直径4cm，柱高25cm，柱体积314mL)，流动相为甲醇：水体积比为40:60(3倍柱体积)，50:50(3倍柱体积)，60：40(3倍柱体积)，80:20(3倍柱体积)，100:0(3倍柱体积)梯度洗脱，每50mL收集一个流份，结合TLC点板划段。合并第1-10个流份经Rp-8反相硅胶柱(柱直径2cm，柱高18cm，柱体积56mL)，流动相为甲醇：水体积比为15:85(3倍柱体积)，20:80(3倍柱体积)，25:75(3倍柱体积)，30:70(3倍柱体积)，35:65(3倍柱体积)梯度洗脱，每10mL收集一个流份，结合TLC点板划段。合并第50-67个流份经Sephadex LH-20(柱直径1cm，柱高160cm，柱体积125mL)，流动相为甲醇：水体积比为100:0(8个柱体积)等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第150-154个流份硫酸乙醇显紫色单一斑点，油状物化合物为化合物1(20mg)。合并第24-26个流份经Sephadex LH-20(柱直径1cm，柱高160cm，柱体积125mL)，流动相为甲醇：水体积比为90:10(4个柱体积)等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第51-56个流份硫酸乙醇显紫色单一斑点，白色粉末状物为化合物10(10mg)。
Ⅱ部位用甲醇溶解，抽滤，滤液直接上MCI柱(柱直径6cm，柱高25cm)，经90％甲醇等度洗脱液为样品。90％甲醇洗脱的样品运用硅胶柱层析(柱直径4cm，柱高20cm)，流动相为石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1(4倍柱体积)，8:1(4倍柱体积)，5:1(4倍柱体积)，3:1(4倍柱体积)，1:1(4倍柱体积)，1:2(4倍柱体积)，乙酸乙酯(4倍柱体积)，甲醇(4倍柱体积)梯度洗脱。运用TLC点板分别合并每个梯度划分为8段FrⅡ.1-8。FrⅡ.1在50℃水浴温度下滴加甲醇，边滴加边振荡直至不再溶解，趁热过滤，滤液放置常温下有白色沉淀物析出，析出沉淀经凝胶Sephadex LH-20(柱直径1cm，柱高160cm，柱体积125mL)，流动相为氯仿：甲醇体积比为3:2(5个柱体积)等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第84-107个流份，再经Rp-8反相硅胶柱(柱直径2cm，柱高18cm)，流动相为甲醇：水体积比为40:60(8倍柱体积)，50:50(8倍柱体积)，55:45(8倍柱体积)，100:0(8倍柱体积)梯度洗脱，每10mL收集一个流份，结合TLC点板划段。合并第35-43个流份为化合物2(10.6mg)，合并第49-161个流份为化合物3(18.8mg)。FrⅡ.3-4经Rp-8反相硅胶柱(柱直径1cm，柱高15cm)，流动相为甲醇：水体积比为50:50(3倍柱体积)，60:40(3倍柱体积)，70:30(3倍柱体积)，80:20(3倍柱体积),90:10(3倍柱体积)梯度洗脱，每5mL收集一个流份，结合TLC点板合并第4-23个流份，再经Rp-8反相硅胶柱(柱直径1cm，柱高15cm)，流动相为甲醇：水体积比为40:60(3倍柱体积)，45:55(3倍柱体积)，50:50(3倍柱体积)，55:45(3倍柱体积),100:0(3倍柱体积)梯度洗脱，每5mL收集一个流份，结合TLC点板合并55％，100％甲醇洗脱液，再经Sephadex LH-20(柱直径1cm，柱高160cm)，流动相为甲醇：水体积比为100:0(4个柱体积)等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第57-80个流份得到化合物11(17mg)。FrⅡ.5运用半制备HPLC[YMC-Pack ODS-A半制备高效液相色谱柱(250mm×10mm,S-5μm,12nm)，流动相：65％甲醇/氨水；流速：4ml/min；检测波长：205nm；tR＝15min]纯化得化合物4(10mg)。
甲醇部位样品10g，采用硅胶柱层析(200-300目柱层析硅胶，柱直径6cm，柱高20cm)，流动相为氯仿：甲醇体积比为30:1(6倍柱体积)，25:1(6倍柱体积)，20:1(6倍柱体积)，15:1(6倍柱体积)梯度洗脱，结合点板合并得到4个与流动相相应部位，30:1部位经Rp-8反相硅胶柱(柱直径3cm，柱高18cm)，流动相为甲醇：水体积比为30:70(5倍柱体积)，60:40(6倍柱体积)，90:10(5倍柱体积)梯度洗脱，分别合并各梯度项下洗脱液，得到30％部位，60％部位，90％部位。因30％部位量少未继续分离；60％部位(1.2g)运用制备HPLC[LC-10ATVP系统，紫外-可见检测器，流动相(甲醇/水)：0-8min 60％，8-20min 60-100％，20-25min 100％，25-28min 100-60％，28-30min 60％；流速：10ml/min；检测波长：205nm]划分为3段Fr.1-Fr.3。Fr.1运用半制备HPLC(YMC-Pack ODS-A半制备高效液相色谱柱(250mm×10mm,S-5μm,12nm，流动相：65％甲醇/水等度；流速：1ml/min；检测波长：205nm)纯化，得到化合物5(5mg)和化合物6(20mg)。Fr.2运用半制备HPLC(YMC-Pack ODS-A半制备高效液相色谱柱(250mm×10mm,S-5μm,12nm)，流动相：40％甲醇/水等度；流速：1ml/min；检测波长：205nm)纯化，得到化合物7(10mg)。Fr.3运用Sephadex LH-20凝胶柱(柱直径1cm，柱高160cm)，流动相为甲醇：水体积比为100:0(4个柱体积)等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合TLC点板合并第45-50个流份得到化合物8(10mg)，合并第60-70个流份得到化合物9(10mg)。结构鉴定结果如下：
化合物3
无色针晶，mp 341-342℃。碘化泌钾反应阳性，提示化合物为生物碱类成分。根据HR-ESI-MS[M-H]-m/z＝395.1620(计算值为395.1601)，[M+Na]+m/z＝419.1554(计算值为419.1577)推断出化合物分子式为C22H24N2O5。紫外光谱最大吸收在211，262nm。化合物3红外光谱在3191cm-1的吸收提示为氨基取代；在1749，1625cm-1的吸收提示为羰基取代；在1588，1455cm-1的吸收提示为苯环特征吸收峰。
1H-NMR谱中在不饱和区出现一组ABX系统氢：δH7.39(1H,d,J＝2.3Hz)，6.85(1H,dd,J＝8.8,2.3Hz)，7.29(1H,d,J＝8.8Hz)可能为吲哚环上三个取代的芳香氢信号；结合13C-NMR在高场区的8个碳信号：δc101.9，110.6，113.7，113.7，126.6，131.1，151.7，156.4其中2个δc131.1，151.7是与N相连的不饱和碳，证实吲哚生物碱的存在。在1H-NMR谱中出现的甲氧基信号δH3.77(3H,s)及13C-NMR谱高场区出现的季碳信号δc156.4，并结合1H-NMR谱中在不饱和区出现一组ABX系统氢，可以确定甲氧基取代位于吲哚苯环上的10位碳上，由于甲氧基的吸电子效应导致苯环上碳信号向低场位移至156.4。在1H-NMR谱中出现的甲氧基信号δH3.63(3H,s)及13C-NMR谱出现的酯甲基信号δc53.5，172.0证明化合物中存在酯甲基取代。在13C-NMR谱高场区还有2个羰基信号δc168.4，185.1证明在化合物中存在2个羰基取代。我们知道在DEPT 45°中，除季碳外的所有峰都出现，为正峰；DEPT 90°中只出现叔碳；而DEPT 135°中，伯碳和叔碳为正，仲碳为负。因此从此化合物DEPT 90°谱图中可以看出δc28.1，35.5，56.1，101.9，113.7信号为正，均为叔碳。从DEPT 135°的谱图中可以看出δc28.0，28.7，33.1，48.1信号为负，均为仲碳；δc12.0，28.1，35.5，53.7，55.8，56.1，101.9，113.7信号为正，排除在DEPT 90°谱图中为正信号的叔碳δc28.1，35.5，56.1，101.9，113.7，剩余δc12.0，53.7，55.8为伯碳。13C-NMR谱中其余碳信号均为季碳。HSQC谱显示芳香苯环上δH7.39与δc101.9直接相关，说明δH7.39属于δc101.9上的氢；δH6.85与δc113.7直接相关，说明δH6.85属于δc113.7上的氢；δH7.29与δc113.7直接相关，说明δH7.29属于δc113.7上的氢。结合HMBC谱分析，芳香氢δH7.39与δc110.6，156.4，113.7，131.1相关；芳香氢δH6.85与δc101.9，156.4，131.1相关；芳香氢δH7.29与δc126.6，101.9，156.4相关。印证了化合物1吲哚苯环上取代甲氧基在10位碳上的推断。
经与文献(Huang JP,Feng ZM,Zheng CF,Zhang PC,Ma YM.Indole alkaloidsfrom the roots of Ervatamia hainanensis[J].Chin Chem lett.2006,17:779-782)对照，化合物3与ibogamine-18-carboxylic acid,3,4-didehydro-7,8-dioxo-methyl ester的1H-NMR和13C-NMR数据十分相似，均属于依波加明型(依博格胺亚型)单萜吲哚生物碱。差异仅在于化合物3在10位碳上有甲氧基取代导致化学位移向低场位移至156.4，而化合物ibogamine-18-carboxylic acid,3,4-didehydro-7,8-dioxo-methyl ester在10位碳上没有取代基化学位移为126.0。
综上所述，该化合物被鉴定为ibogamine-16-carboxylic acid,17,20-didehydro-5,6-dioxo-10-methoxy-methyl ester。经SciFinder Scholar进行网络检索，未发现该结构，证明此化合物为一个新化合物。
波谱数据归属如下：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):7.39(1H,d,J＝2.3Hz,H-9)，7.29(1H,d,J＝8.8Hz,H-12)，6.85(1H,dd,J＝8.8,2.4Hz,H-11)，4.20(1H,brs,H-21)，3.77(3H,s,10-OCH3)，3.63(3H,s,-COOCH3)，3.50(1H,d,J＝11.4Hz,H-3b)，3.14(1H,d,J＝11.6Hz,H-3a)，2.96(1H,m,H-15b)，2.29(1H,s,H-14)，1.82(1H,m,H-17a)，1.81(1H,m,H-15a)，1.67(1H,m,H-20)，1.52(1H,m,H-19a)，1.39(1H,m,H-19b)，1.37(1H,m,H-17b)，0.88(3H,t,J＝7.3Hz,H-18)；13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):185.1(C-6)，172.0(-COOCH3)，168.4(C-5)，156.4(C-10)，151.7(C-2)，131.1(C-13)，126.6(C-8)，113.7(C-12)，113.7(C-11)，110.6(C-7)，101.9(C-9)，56.1(C-21)，55.7(-10-OCH3)，53.5(-COOCH3)，52.1(C-16)，48.1(C-3)，35.5(C-20)，33.1(C-15)，28.8(C-17)，28.1(C-14)，28.0(C-19)，12.0(C-18)。
化合物3结构中有4个手性碳原子，存在16种可能的同分异构体。从乙酸乙酯中培养出单晶，通过进行X-单晶射线衍射实验确定了化合物3的绝对构型。化合物3通过X射线衍射仪反射镜钼Kα射线辐射测量，通过异常色散的方法Flack＝-0.6(12)，确定化合物3的绝对构型为14(R),16(S),20(S),21(S)，化合物3的绝对构型为首次确定。
为了确定化合物3的绝对构型，进行了X射线晶体学分析。实验数据(见3)确定了化合物3的绝对构型，晶体数据如下：分子式C22H24N2O5；Mr＝396.43；空间群为P212121，属斜方晶系；晶胞参数为体积晶胞内分子数Z＝4；晶体密度Dcalcd＝1.321mg/m3；可靠因子R＝0.0483,wR2＝0.1173。
晶体数据测试过程中，温度维持在296(2)K，应用直接法(SHELXS-97程序)测定分子结构，交迭使用最小二乘法与Fourier综合法。CCDC 1016804为该文章提供晶体学补充数据。
化合物ibogamine-16-carboxylic acid,17,20-didehydro-5,6-dioxo-10-methoxy-methyl ester与化合物ibogamine-18-carboxylic acid,3,4-didehydro-7,8-dioxo-methyl ester的NMR波谱数据比较见表1
表1
化合物1
白色油状物，mp 95-96℃，化合物1H-NMR谱数据中1.25(3H,d,J＝7.0HZ)为10位上甲基氢信号；4.26(3H,m,2H-3,1H-7)分别为连氧的CH2，CH信号；13C-NMR谱数据中174.9为羰基碳信号；13.8为甲基碳信号；CHOH(74.4)，CH3(13.8)的13C-NMR数据说明-OH，-CH3处于顺式构型，因为通过比较2-甲基环戊醇的顺式和反式构型的碳谱数据发现：反式同分异构体的CHOH信号为80.9ppm，CH3信号19.4ppm；顺式同分异构体的CHOH信号为76.3ppm，CH3信号为14.8ppm，而此化合物这两个基团的碳谱数据与后者符合。经与文献(G.Marini-Bettolo,M.Nicoletti,I.Messana,et al.Research on African medicinal plants-Ⅳ[J].Tetrahedron,1983,39(2):323-329)对照，鉴定化合物为boonein。
波谱数据归属如下：1H-NMR(400MHz，CDCl3)δH:4.26(3H,m,2H-3,1H-7)，1.74(1H,brs,H-5)，1.25(3H,d,J＝7.0HZ,H-10)，13C-NMR(101MHZ,CDCl3)δC:174.9(C-1)，66.95(C-3)，29.5(C-4)，33.9(C-5)，41.1(C-6)，75.28(C-7)，44.1(C-8)，47.7(C-9)，13.8(C-10)
化合物2
白色片状晶体。碘化铋钾反应呈阳性。提示化合物为生物碱类成分。化合物1H-NMR谱在高场区特征氢信号：δH10.17(1H,s)，9.85(1H,s)，7.50(1H,d,J＝11.1Hz)，7.06(1H,dd,J＝12.2,5.5Hz)，6.95(3H,m)，6.52(1H,s)提示可能为吲哚环上的2个宽单峰活泼氢和2个苯环上的芳香氢；结合13C-NMR高场区的16个不饱和碳信号δc99.4，109.1，110.1，110.3，111.1，117.0，117.5，126.9，129.8，130.0，130.9，136.6，138.1，138.4，139.4，150.8(6个叔碳，10个季碳)证明此化合物为具有两个吲哚环的双聚单萜吲哚生物碱。此外还有三组甲氧基信号：δc56.4，δH3.93(3H,s)；δc52.3，δH2.64(3H,s)；δc49.8，δH3.57(3H,s)和两组羰基信号δc174.3，170.8证明此化合物中存在2个酯甲基取代。一组N-Me信号：δc42.4，δH2.61(3H，s)为楠因-士的宁型(波里芬亚型)生物碱的特征信号；另外13C-NMR中存在三个与N直接相连的碳信号δc52.7(C-3ˊ)，53.9(C-5ˊ)，57.2(C-21ˊ)为依波加明型(依博格胺亚型)生物碱的特征信号。说明此化合物是一个由楠因-士的宁型(波里芬亚型)生物碱单体和依波加明型(依博格胺亚型)生物碱单体组成的双聚单萜吲哚生物碱。经与文献(W.L.B.Medeiros,I.J.C.Vieira,L.Mathias,et al.Two known bis-indole alkaloids isolated fromTabernaemontana laeta:complete1H and 13C chemical shift assignments,[J].Magnetic Resonance in Chemistry,1999,37:676-681)对照，鉴定化合物为voacamine。
波谱数据归属如下：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:10.17(1H,s,N-H)，9.85(1H,s,Nˊ-H)，7.50(1H,d,J＝11.1Hz,H-9)，7.06(1H,dd,J＝12.2,5.5Hz,H-10)，6.95(3H,m,H-11,12,12ˊ)，6.52(1H,s,H-9ˊ)，5.24(1H,q,J＝6.5Hz,H-19)，4.95(1H,d,J＝11.4Hz,H-3)，3.93(3H,s,10ˊ-OCH3)，3.57(3H,s,22ˊ-OCH3)，2.46(3H,s,22-OCH3)，2.38(3H,s,N-CH3)，1.62(3H,d,J＝6.3Hz,H-18)，0.81(3H,t,J＝7.3Hz,Hˊ-18)；13C-NMR(101MHZ,CDCl3)δ:138.37(C-2ˊ)，52.7(C-3ˊ)，53.87(C-5ˊ)，21.86(C-6ˊ)，110.12(C-7ˊ)，126.89(C-8ˊ)，99.35(C-9ˊ)，150.77(C-10ˊ)，129.82(C-11ˊ)，117.04(C-12ˊ)，130.93(C-13ˊ)，27.19(C-14ˊ)，38.43(C-15ˊ)，54.92(C-16ˊ)，32.03(C-17ˊ)，12.04(C-18ˊ)，27.10(C-19ˊ)，38.23(C-20ˊ)，57.20(C-21ˊ)，174.28(-COOMeˊ)，52.3(-COOMeˊ)，56.41(10ˊ-OCH3)，139.41(C-2)，37.22(C-3)，42.54(N-Me)，59.93(C-5)，19.3(C-6)，111.08(C-7)，129.97(C-8)，117.51(C-9)，109.10(C-10)，120.89(C-11)，110.31(C-12)，136.61(C-13)，36.34(C-14)，33.88(15)，47.08(C-16)，12.32(C-18)，118.07(C-19)，138.07(C-20)，52.67(C-21)，170.83(C-22)，49.78(22-OMe)。
化合物4
碘化泌钾反应阳性，提示为生物碱类成分，化合物1H-NMR谱在高场区特征氢信号：δH9.04(1H,s)，7.72(1H,d,J＝8.1Hz)，7.35(2H,m)，7.17(1H,m)提示可能为吲哚环上的一个宽单峰活泼氢和四个芳香氢；结合13C-NMR中δc111.8，120.3，120.4，120.9，126.8，128.6，134.2，136.3的8个芳香碳信号(4个叔碳，4个季碳)，其中2个δc134.2，136.3是与N相连的不饱和碳，证实吲哚生物碱的存在。一组N-Me信号：δc42.4，δH2.61(3H，s)和一个高场区的羰基信号：δc190.2，提示为楠因-士的宁型(波里芬亚型)生物碱。经与文献(LIANG Shuang,CHENG Haisheng,JIN Yongsheng,et al.Study on chemical constituents in rhigomeof Ervatamia hainanensis[J].China Journal of Chinese Materia Medica,2007,32:1296-1299)对照，鉴定化合物为vobasine。
波谱数据归属如下：1H-NMR(400MHz，CDCl3)δH9.04(1H,s,NH)，7.72(1H,d,J＝8.1Hz,H-9)，7.35(2H,m,H-11,12)，7.17(1H,m,H-10)，5.47(1H,q,J＝6.6Hz,H-19)，3.98(1H,m,H-5)，3.85(1H,d,H-21b)，3.78(1H,m,H-15)，3.53(1H,m,H-6b)，3.42(1H,m,H-6a)，3.32(1H,m,H-14b)，2.98(1H,d,H-21a)，2.83(1H,m,H-16)，2.73(1H,m,H-14a)，2.65(3H,s,COOMe)，2.61(3H,s,N-Me)，1.72(3H,dd,J＝6.8,1.8Hz,H-18)；13C-NMR(101MHZ,CDCl3)δC134.2(C-2)，190.2(C-3)，57.3(C-5)，20.4(C-6)，120.3(C-7)，128.6(C-8)，120.9(C-9)，120.4(C-10)，126.8(C-11)，111.8(C-12)，136.4(C-13)，43.1(C-14)，30.5(C-15)，46.7(C-16)，12.4(C-18)，121.0(C-19)，135.9(C-20)，51.87(C-21)，171.34(-COOMe)，50.44(-COOMe)，42.38(N-Me)。化合物5
化合物1H-NMR谱在高场区特征氢信号：δH7.42(1H,d,J＝7.8Hz)，7.16(1H,d,J＝8.0Hz)，6.99(1H,t,J＝7.5Hz)，6.90(1H,t,J＝7.5Hz)，为苯环上4个不饱和氢信号；δH5.35(1H,q,J＝6.7Hz)，1.62(3H,dd,J＝6.8,1.8Hz)与vobasine具有相同信号，证明存在C＝C-CH3基团取代；δH2.46(3H,s)，2.35(3H,s)与vobasine具有相同信号，证明存在N-Me，-COOMe基团取代；综上信息说明，化合物5可能与vobasine具有相同骨架结构，但两者的氢谱比较发现此化合物1H-NMR谱比vobasine的1H-NMR谱多了一个δH4.99(1H,dd,J＝12.4,4.2Hz)信号。经查阅相似化合物文献分析这个氢信号属于楠因-士的宁型(波里芬亚型)骨架3位被羟基取代后的H-3信号，并且可以从H-3的峰形及偶合常数(dd,J＝12.4,4.2Hz)判断羟基取代为α-OH取代。因为文献(Anne-Marie Bui,Bhupesh C.Das,Eric Guittet,et al.Structureand Stereochemistry of Hazuntamine,a New Bisindole Alkaloid from Hazuntamodesta var.Methuenii Subvar.Methuenii[J].Heterocycles,1994,38:1025-1032.)显示3位为β-OH取代时H-3的峰形及偶合常数为：(dd,J＝4,1Hz)或(dd,J＝5,2Hz)。经与文献(Alfarius E.Nugroho,Yusuke Hirasawa,Nobuo Kawahara,et al.Bisnicalaterine A,aVobasine-Vobasine Bisindole Alkaloid from Hunteria zeylanica[J].J.Nat.Prod,2009,72(8):1502-1506)对照，鉴定化合物5为3-epivobasinol。
波谱数据归属如下：1H-NMR(400MHz，MeOD)δH7.42(1H,d,J＝7.8Hz,H-9)，7.16(1H,d,J＝8.0Hz,H-12)，6.99(1H,t,J＝7.5Hz,H-10)，6.90(1H,t,J＝7.5Hz,H-11)，5.35(1H,q,J＝6.7Hz,H-19)，4.99(1H,d,J＝12.4,4.2Hz,H-3)，3.78(1H,m,H-15)，3.71(1H,m,H-21a)，3.53(1H,m,H-5)，3.32(1H,m,H-6a)，3.11(1H,m,H-6b)，2.87(1H,d,J＝13.9Hz,H-21b)，2.59(2H,m,H-16,14a)，2.46(3H,s,N-Me)，2.35(3H,s,COOMe)，1.94(1H,m,H-14b)，1.62(3H,dd,J＝6.8,1.8Hz,18-Me)；13C-NMR(101MHZ,MeOD)δC135.7(C-2)，66.8(C-3)，58.8(C-5)，19.0(C-6)，109.5(C-7)，128.9(C-8)，118.0(C-9)，118.8(C-10)，122.1(C-11)，110.3(C-12)，136.9(C-13)，36.9(C-14)，30.6(C-15)，46.1(C-16)，12.1(C-18)，119.1(C-19)，135.9(C-20)，52.0(C-21)，41.9(N-Me)，49.8(-COOMe)，171.6(-COOMe)。
化合物6
白色针状小晶体。碘化泌钾反应阳性。提示化合物为生物碱类成分。化合物1H-NMR谱在不饱和区出现一组ABX系统氢：δH7.11(1H,d,J＝8.7Hz,)，6.89(1H,d,J＝2.3Hz)，6.88(1H,dd,J＝8.7,2.4Hz)可能为吲哚环上三个取代的芳香氢信号；结合13C-NMR在高场区的8个碳信号：δc101.30，108.48，111.54，112.01，131.24，132.01，143.09，155.11其中2个δc132.01，143.09是与N相连的不饱和碳，证实吲哚生物碱的存在。在1H-NMR谱中出现的甲氧基信号δH3.81(3H,s)及13C-NMR谱高场区出现的季碳信号δc155.11，并结合1H-NMR谱中在不饱和区出现一组ABX系统氢，可以确定甲氧基取代位于吲哚苯环上的10位碳上，由于甲氧基的吸电子效应导致苯环上碳信号向低场位移至155.11。同时出现在1H-NMR谱中的一组氢信号δH4.15(1H,dt,J＝6.3,4.4Hz)，1.13(3H,d,J＝6.4Hz)及13C-NMR谱中的羟基信号δc73.31，提示化合物中存在CHOHCH3取代基。经与文献(Santos,Allana Kellen L.；Ticiane S.；Monte,Francisco Jose Q.；et al.Iboga alkaloids fromPeschiera affinis(Apocynaceae)-unequivocal 1H and 13C chemical shiftassignments:antioxidant activity[J].Química Nova,2009,32:1834-1838.)对照，鉴定化合物6为iboxigaina。
波谱数据归属如下：1H-NMR(400MHz,MeOD)δH7.11(1H,d,J＝8.7Hz,H-12)，6.89(1H,d,J＝2.3Hz,H-9)，6.68(1H,dd,J＝8.7,2.4Hz,H-11)，4.15(1H,dt,J＝6.3,4.4Hz,H-19)，3.81(3H,s,10-OMe)，1.13(3H,d,J＝6.4Hz,18-Me)；13C-NMR(101MHZ,MeOD)δC 143.63(C-2)，54.38(C-3)，50.57(C-5)，20.43(C-6)，108.48(C-7)，131.2(C-8)，101.30(C-9)，155.11(C-10)，112.01(C-11)，111.54(C-12)，132.01(C-13)，27.62(C-14)，24.76(C-15)，41.24(C-16)，35.52(C-17)，21.40(C-18)，73.31(C-19)，43.75(C-20)，62.05(C-21)，56.52(-OMe)。
化合物7
白色粉末状物，碘化泌钾反应阳性，提示化合物为生物碱类成分。1H-NMR谱中在不饱和区出现一组ABX系统氢：δH7.13(1H,d,J＝8.7Hz)，6.91(1H,d,J＝2.2Hz)，7.81(1H,dd,J＝8.8,2.3Hz)可能为吲哚环上三个取代的芳香氢信号；结合13C-NMR在高场区的8个碳信号：δc100.53，109.17，111.39，112.69，128.16，130.89，134.23，154.26其中2个δc130.89，134.23是与N相连的不饱和碳，证实吲哚生物碱的存在。在1H-NMR谱中出现的甲氧基信号δH3.82(3H,s)及13C-NMR谱高场区出现的季碳信号δc154.26，并结合1H-NMR谱中在不饱和区出现一组ABX系统氢，可以确定甲氧基取代位于吲哚苯环上的10位碳上，由于甲氧基的吸电子效应导致苯环上碳信号向低场位移至154.26。在1H-NMR谱中出现的甲氧基信号δH3.73(3H,s)及13C-NMR谱出现的酯甲基信号δc53.2，175.93证明化合物中存在酯甲基取代。在13C-NMR谱高场区还有1个羰基信号δc172.74证明在化合物中存在1个羰基取代。同时出现在1H-NMR谱中的一组氢信号δH3.82(1H,qd,J＝6.6,1.8Hz)，1.31(3H,d,J＝6.2Hz)及13C-NMR谱中的羟基信号δc70.00，提示化合物中存在CHOHCH3取代基。经与文献(V.S.PrakashChaturvedula,Shannon Sprague,Jennifer K.Schilling,et al.New Cytotoxic IndoleAlkaloids from Tabernaemontana calcarea from the Madagascar Rainforest[J].Journal of Natural Products,2003,66:528-53)对照，鉴定化合物为3-oxo-19-epi-voacristine。
波谱数据归属如下：1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δH7.93(1H,brs,NH)，7.13(1H,d,J＝8.7Hz,H-12)，6.91(1H,d,J＝2.2Hz,H-9)，6.81(1H,dd,J＝8.8,2.3Hz,H-11)，4.62(1H,brs,H-21)，4.45(1H,m,H-5)，3.82(1H,qd,J＝6.6,1.8Hz,H-19)，3.82(3H,s,OCH3)，3.73(3H,s,-COOCH3)，3.21(1H,m,H-6)，3.16(1H,m,H-5)，1.38(1H,m,H-15)，1.31(3H,d,J＝6.2Hz,18-Me)；13C-NMR(101MHZ,CDCl3)：δc134.23(C-2)，172.8(C-3)，42.27(C-5)，21.13(C-6)，109.17(C-7)，128.16(C-8)，100.53(C-9)，154.26(C-10)，112.69(C-11)，111.39(C-12)，130.89(C-13)，38.03(C-14)，27.38(C-15)，55.77(C-16)，35.88(C-17)，21.41(C-18)，70.00(C-19)，41.29(C-20)，54.61(C-21)，56.01(-OMe)，53.10(-CO2 Me)，175.93(-CO 2Me)。
化合物8
浅黄色油状物。碘化铋钾反应呈阳性。提示化合物为生物碱类成分。化合物1H-NMR谱在高场区特征氢信号：δH7.48(1H,m)，7.12(1H,d,J＝8.7Hz)，7.05(1H,m)，6.94(2H,m)，6.73(1H,d,J＝8.7Hz)为苯环上6个氢信号；结合13C-NMR高场区在苯环上的12个不饱和碳信号δc131.5，120.2，119.4，127.1，111.1，137.4，128.1，117.8，109.3，153.5，113.81，134.7(6个季碳，6个叔碳)证明此化合物为具有两个吲哚环的双聚单萜吲哚生物碱。此外还有三组甲氧基信号：δc50.8，δH2.45(3H,s)；δc53.2，δH2.99(3H,s)；δc56.3，δH3.76(3H,s)和两组羰基信号δc172.9，175.8证明此化合物中存在2个-COOMe取代。一组N-Me信号：δc42.5，δH2.59(3H，s)为楠因-士的宁型(波里芬亚型)生物碱的特征信号。另外13C-NMR中存在三个与N直接相连的碳信号δc53.35(C-3ˊ)，53.44(C-5ˊ)，61.39(C-21ˊ)为依波加明型(依博格胺亚型)生物碱的特征信号。说明此化合物是一个由楠因-士的宁型(波里芬亚型)生物碱单体和依波加明型(依博格胺亚型)生物碱单体组成的双聚单萜吲哚生物碱。上述特征信号与voacamine特征信号一致，但与voacamine不同的是此化合物出现了一组羟基信号：δH4.07(1H,m)，δc72.91。经与文献(Toh-Seok Kam,Kooi-Mow Sim.Conodurine,conoduramine,andervahanine derivatives from Tabernaemontana corymbosa[J].Phytochemistry,200.)对照，鉴定化合物为19ˊ(S)-hydroxyconodurine。
波谱数据归属如下：1H-NMR(400MHz,MeOD)：δH7.48(1H,m,H-9)，7.12(1H,d,J＝8.7Hz,H-9ˊ)，7.05(1H,m,H-10)，6.94(2H,m,H-11,12)，6.73(1H,d,J＝8.7Hz,H-10ˊ)，5.54(1H,m,H-3)，5.35(1H,q,J＝6.5Hz,H-19)，4.07(2H,m,H-5,19ˊ)，3.76(3H,s,11ˊ-OMe)，2.99(3H,s,-CO2Meˊ)，2.68(1H,t,J＝3Hz,H-16)，2.59(3H,s,N-Me)，2.45(3H,s,-CO2Me)，1.67(3H,d,J＝6.5Hz,18-Me)，1.14(3H,d,J＝6.3Hz,18-Meˊ)；13C-NMR(101MHZ,MeOD)：δC139.79(C-2)，38.57(C-3)，60.14(C-5)，25.56(C-6)，110.97(C-7)，131.45(C-8)，120.16(C-9)，119.35(C-10)，127.11(C-11)，111.09(C-12)，137.36(C-13)，38.01(C-14)，35.43(C-15)，48.20(C-16)，12.53(C-18)，121.48(C-19)，139.85(C-20)，54.39(C-21)，50.76(-CO2 Me)，172.86(-CO 2Me)，42.49(N-Me)，139.16(C-2ˊ)，53.35(C-3ˊ)，53.44(C-5ˊ)，20.82(C-6ˊ)，111.27(C-7ˊ)，128.14(C-8ˊ)，117.79(C-9ˊ)，109.27(C-10ˊ)，153.49(C-11ˊ)，113.81(C-12ˊ)，134.70(C-13ˊ)，28.39(C-14ˊ)，25.50(C-15ˊ)，58.92(C-16ˊ)，41.28(C-17ˊ)，20.39(C-18ˊ)，72.91(C-19ˊ)，34.13(C-20ˊ)，61.39(C-21ˊ)，53.19(-CO2 Meˊ)，175.75(-CO2 Meˊ)，56.28(11ˊ-OMe)。
化合物9
浅黄色油状物。碘化铋钾反应呈阳性。提示化合物为生物碱类成分。化合物1H-NMR谱在高场区特征氢信号：δH7.42(1H,m)，7.05(3H,m)，6.82(1H,s)，6.68(1H,s)为苯环上6个氢信号；结合13C-NMR高场区在苯环上的12个不饱和碳信号δc129.80，117.47，118.66，121.57，109.82，135.81，130.35，117.47，126.93，151.17，99.15，130.35，(6个季碳，6个叔碳)证明此化合物为具有两个吲哚环的双聚单萜吲哚生物碱。此外还有三组甲氧基信号：δc49.90，δH2.37(3H,s)；δc52.85，δH3.54(3H,s)；δc56.11，δH3.69(3H,s)和两组羰基信号δc171.61，174.47证明此化合物中存在2个-COOMe取代。一组N-Me信号：δc42.38，δH2.48(3H，s)为楠因-士的宁型(波里芬亚型)生物碱的特征信号。另外13C-NMR中存在三个与N直接相连的碳信号δc51.43(C-3ˊ)，52.24(C-5ˊ)，59.52(C-21ˊ)为依波加明型(依博格胺亚型)生物碱的特征信号。说明此化合物是一个由楠因-士的宁型(波里芬亚型)生物碱单体和依波加明型(依博格胺亚型)生物碱单体组成的双聚单萜吲哚生物碱。上述特征信号与19ˊ(S)-hydroxyconodurine特征信号一致，同时均出现一组羟基信号：δH4.03(1H,q,J＝5.8Hz)，δc71.36。但在吲哚苯环上氢的峰形及偶合常数有所区别，经与文献(Toh-Seok Kam,Kooi-Mow Sim.Conodurine,conoduramine,and ervahanine derivatives fromTabernaemontana corymbosa[J].Phytochemistry,200.)对照，鉴定化合物为19ˊ(S)-hydroxyconoduramine。
波谱数据归属如下：1H-NMR(400MHz,CDCl3)δH7.60(1H,brs,NH)，7.42(2H,m,H-9,NHˊ)，7.05(3H,m,H-10,11,12)，6.82(1H,s,H-9ˊ)，6.68(1H,s,H-12ˊ)，5.23(1H,q,J＝6.5Hz,H-19)，5.04(1H,brd,H-3)，4.03(1H,q,J＝5.8Hz,H-19ˊ)，3.69(3H,s,11ˊ-OMe)，3.54(3H,s,-CO2Meˊ)，2.48(3H,s,N-Me)，2.37(3H,s,-CO2Me)，1.57(3H,d,J＝6.4Hz,18-Me)，0.98(3H,d,J＝6.3Hz,18ˊ-Me)；13C-NMR(101MHZ,CDCl3)：δc 137.93(C-2)，36.97(C-3)，59.93(C-5)，19.55(C-6)，109.5(C-7)，129.80(C-8)，117.47(C-9)，118.66(C-10)，121.57(C-11)，109.82(C-12)，135.81(C-13)，29.70(C-14)，33.59(C-15)，46.93(C-16)，12.28(C-18)，118.94(C-19)，136.26(C-20)，52.20(C-21)，49.90(CO2 Me)，171.61(CO 2Me)，42.38(N-Me)，130.45(C-2ˊ)，51.43(C-3ˊ)，52.44(C-5ˊ)，21.66(C-6ˊ)，110.45(C-7ˊ)，130.35(C-8ˊ)，117.47(C-9ˊ)，126.93(C-10ˊ)，151.17(C-11ˊ)，99.15(C-12ˊ)，130.35(C-13ˊ)，26.77(C-14ˊ)，22.90(C-15ˊ)，53.96(C-16ˊ)，36.94(C-17ˊ)，20.33(C-18ˊ)，71.36(C-19ˊ)，39.45(C-20ˊ)，59.52(C-21ˊ)，52.85(CO2 Meˊ)，174.47(CO2 Meˊ)，56.11(11ˊ-OMe)。
以上NMR谱数据归属见表2-表4
表2化合物4和5的1H-NMR和13C-NMR谱图数据
表3化合物6和7的1H-NMR和13C-NMR谱图数据
表4化合物2、8和9的1H-NMR和13C-NMR谱图数据
综上所述，(1)本发明采用多种分离纯化技术从伏康树树皮乙酸乙酯渗漉提取部位中分离鉴定了9个化合物，包括1个单萜内酯(1)，3个依波加明型(依博格胺亚型)单萜吲哚生物碱(3,6,7)，2个楠因-士的宁型(波里芬亚型)单萜吲哚生物碱(4,5)，3个楠因-士的宁型(波里芬亚型)+依波加明型(依博格胺亚型)双聚单萜吲哚生物碱(2,8,9)。除化合物2,4外，其余化合物均为首次从该植物中分离得到，化合物1为首次从该属植物中分离得到，化合物3为一个新化合物。
(2)未鉴定的2个化合物，均为齐墩果烷型三萜化合物。由于萜类化合物在纯化方面纯度很难达到，尽管在TLC薄层板上检测为一个斑点，但斑点多形成拖尾，导致做出来的核磁共振谱图复杂，给解析带来一定难度。
(3)本实验分离出来的化合物除化合物1以外均为单萜吲哚类生物碱，且化合物3，5，6，7，8，9均为首次从该植物中分离得到，特别是化合物8，9属于二聚体，前期抗肿瘤活性实验表明同样为二聚体的老刺母胺(化合物2)具有显著的肿瘤细胞抑制活性。因此这些化合物的抗肿瘤活性引起了我们的极大兴趣。
实施例2本发明化合物的抗肿瘤活性
实验样品
化合物3(ibogamine-16-carboxylic acid,17,20-didehydro-5,6-dioxo-10-methoxy-methyl ester)，化合物2(voacamine)，化合物4(vobasine)，化合物12(voacangine)，化合物13(voacristine)，化合物14(19-epi-voacristine)，化合物15(19-epi-heyneanine)。
实验过程
癌细胞株HEPG-2,A375,MDA-MB-231,SH-SY5Y and CT26购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，细胞株培养在5％CO2，37℃的大气环境中。当细胞进入对数生长期，将其接种在96孔板中贴壁生长，每孔接种细胞数大约为3×103/孔，每孔加入培养基10μL。然后转移到测试培养容器中，继续培养72小时。10％DMSO作为空白对照，紫杉醇作为阳性对照。细胞的异常运用MTT法评估分析。最后运用酶标仪评估测试化合物对细胞生长的影响，96孔板在570nm下进行测试。所有实验重复三次。
统计学方法
数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 15.0软件对实验所得的OD值进行组间t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
实验结果
化合物2(双聚吲哚生物碱)对细胞株HEPG-2，A375，MDA-MB-231，SHSY5Y，CT26有显著的抑制活性IC50值分别为5.7±0.9，5.0±1.7，5.5±1.4，5.2±1.9,，5.5±1.1μg/mL；化合物4(柯南因-士的宁型吲哚生物碱)对细胞株HEPG-2，A375，MDA-MB-231，SHSY5Y，CT26有中等抑制活性IC50值分别为19.3±2.5，19.5±4.6，25±7.2，19±4.9，20±1.3μg/mL；化合物3,12-15具有相同的骨架结构仅取代基不同，它们的肿瘤细胞抑制活性也有很大的差距。化合物14对细胞株HEPG-2，A375，MDA-MB-231，SHSY5Y，CT26有显著的抑制活性IC50值分别为10.5±1.6，5.0±1.9，6.3±1.2，3.8±0.7，4.8±1.5ug/mL；化合物12对细胞株A375，CT26显示中等抑制活性IC50值分别为14±4.3，11±3.4ug/mL，对细胞株HEPG-2，MDA-MB-231，SHSY5Y有显著的抑制活性IC50值分别为10±0.8，8.0±1.1，7.6±2.6ug/mL。化合物13对细胞株HEPG-2，A375，MDA-MB-231，SHSY5Y，CT26有中等抑制活性IC50值分别为20±2.1，20±1.3，20±2.5，20±5.7，20±4.4ug/mL；化合物3,15未对测试细胞株表现出抑制活性。实验结果如下表：
注意：数据表示为平均值±标准偏差
实验讨论
(1)运用MTT法对从伏康树中分离鉴定的7个化合物(一个新化合物3和6个已知化合物进行了体外抗肿瘤细胞测试，测试细胞株为肿瘤细胞株HEPG-2，A375，MDA-MB-231，SHSY5Y，CT26。从实验结果可以看出除化合物4和15大多数单萜吲哚生物碱对肿瘤细胞株表现出抑制活性，且抑制活性比较大；但与阳性对照物紫杉醇(Taxol)的肿瘤细胞抑制活性相差甚远。
(2)依波加明型生物碱具有明显的肿瘤细胞抑制活性，其16位的酯甲基对维持活性具有重要意义。化合物3,12-15属于此类生物碱，且16位均有酯甲基取代，但它们的肿瘤细胞抑制活性存在差异，特别是化合物3和化合物15未对测试细胞株表现出抑制活性。对研究该类生物碱的构效关系具有一定的指导意义
(3)化合物2为双聚单萜吲哚生物碱，实验结果表明其对五种肿瘤细胞株均表现出高于其他化合物的显著的肿瘤细胞抑制活性。从化合物2的化学结构分析，发现它与长春碱同属于双聚单萜吲哚生物碱，且组成的单体均为单萜吲哚生物碱，只是所述类型有所差异。文献报道组成长春碱的长春质碱环和文多灵环单独并没有肿瘤细胞抑制活性，聚合在一起就表现出强大的抗癌作用。从长春碱我们可以得到双聚单萜吲哚生物碱具有显著抗癌作用的启示。
综上所述，本发明伏康树中化合物具有良好的肿瘤细胞抑制活性，制备简便，具有良好的市场应用前景。

Claims (1)

1.一种制备化合物的方法，其特征在于：所述化合物如为下述化合物中的任一种或多种：
其中，Me表示甲基；
包括以下步骤：
取伏康树树皮，乙酸乙酯渗漉提取，减压干燥渗漉液得浸膏，柱层析，用石油醚-乙酸乙酯洗脱，收集各段液体，继续分离纯化即得；
其中，所述化合物12、13、14、15的制备方法的步骤如下：
A、取伏康树树皮，干燥，打粉，用14倍量乙酸乙酯渗漉提取，减压干燥渗漉液得浸膏；
B、运用硅胶柱层析石油醚：乙酸乙酯＝5:1,4:1,3:1,2:1,1:1,1:2,0:1，甲醇洗脱，并运用TLC点板合并为8段，分别为Fr.1-8；
C1：化合物12的制备：第1段Fr.1采用0.3mol/L HCl溶解和NaOH沉淀，再通过甲醇重结晶得到化合物12；
C2：化合物13的制备：第2段Fr.2运用硅胶柱层析石油醚：丙酮＝6:1,5:1,4:1,3:1,2:1,1:1洗脱，划分为6段，即Fr.2-1到Fr.2-6，Fr.2-6重结晶得到化合物13；
C3：化合物14和化合物15的制备：第3段Fr.3运用凝胶Sephadex LH-20,柱直径1cm，柱高160cm，流动相为氯仿：甲醇体积比为1:1，4个柱体积；等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第35-50个流份为化合物14，合并第60-75个流份为化合物15，氯仿：甲醇＝1:1纯化得到化合物14和化合物15；
其中，所述化合物1-9的制备方法的步骤如下：
(1)伏康树树皮干燥得药材，粉碎，14倍药材量乙酸乙酯渗滤提取，提取液浓缩得浸膏；
(2)分离：采用硅胶柱层析，流动相为：石油醚-乙酸乙酯＝5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，0:1，甲醇，梯度洗脱，按流动相合并为几个部位；运用TLC根据斑点显色情况将剩余样品合并为Ⅰ、Ⅱ和甲醇部位；
(3-1)
Ⅰ部位经MCI柱洗脱，柱体积314mL，流动相为甲醇：水体积比为40:60，3倍柱体积；50:50，3倍柱体积；60：40，3倍柱体积；80:20，3倍柱体积；100:0，3倍柱体积；梯度洗脱，每50mL收集一个流份，结合TLC点板划段；
(3-1-1)
化合物1的制备：合并第1-10个流份经Rp-8反相硅胶柱，柱体积56mL，流动相为甲醇：水体积比为15:85，3倍柱体积；20:80，3倍柱体积；25:75，3倍柱体积；30:70，3倍柱体积；35:65，3倍柱体积；梯度洗脱，每10mL收集一个流份，结合TLC点板划段；合并第50-67个流份经Sephadex LH-20柱洗脱，柱体积125mL，流动相为甲醇：水体积比为100:0，8个柱体积；等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第150-154个流份硫酸乙醇显紫色单一斑点，油状物化合物为化合物1；
(3-2)
Ⅱ部位用甲醇溶解，抽滤，滤液直接上MCI柱，经90％甲醇等度洗脱液作为样品；
90％甲醇洗脱的样品运用硅胶柱层析，柱直径4cm，柱高20cm，流动相为石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1，4倍柱体积；8:1，4倍柱体积；5:1，4倍柱体积；3:1，4倍柱体积；1:1，4倍柱体积；1:2，4倍柱体积；乙酸乙酯，4倍柱体积；甲醇，4倍柱体积；梯度洗脱；运用TLC点板分别合并每个梯度划分为8段FrⅡ.1-8；
(3-2-1)
化合物2和化合物3的制备：FrⅡ.1在50℃水浴温度下滴加甲醇，边滴加边振荡直至不再溶解，趁热过滤，滤液放置常温下有白色沉淀物析出，析出沉淀经凝胶Sephadex LH-20柱，柱体积125mL，流动相为氯仿：甲醇体积比为3:2，5个柱体积；等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合点板合并第84-107个流份，再经Rp-8反相硅胶柱，柱直径2cm，柱高18cm，流动相为甲醇：水体积比为40:60，8倍柱体积；50:50，8倍柱体积；55:45，8倍柱体积；100:0，8倍柱体积；梯度洗脱，每10mL收集一个流份，结合TLC点板划段；合并第35-43个流份为化合物2；合并第49-161个流份为化合物3；
(3-2-2)
化合物4的制备：FrⅡ.5运用半制备HPLC，YMC-Pack ODS-A半制备高效液相色谱柱，250mm×10mm,S-5μm,12nm；流动相：65％甲醇/氨水；流速：4ml/min；检测波长：205nm；tR＝15min；纯化得化合物4；
(3-3)
甲醇部位样品，采用硅胶柱层析，柱直径6cm，柱高20cm，流动相为氯仿：甲醇体积比为30:1，6倍柱体积；25:1，6倍柱体积；20:1，6倍柱体积；15:1，6倍柱体积；梯度洗脱，结合点板合并得到4个与流动相相应部位，30:1部位经Rp-8反相硅胶柱，柱直径3cm，柱高18cm，流动相为甲醇：水体积比为30:70，5倍柱体积；60:40，6倍柱体积；90:10，5倍柱体积；梯度洗脱，分别合并各梯度项下洗脱液，得到30％部位，60％部位，90％部位；
60％部位运用制备HPLC[LC-10ATVP系统，紫外-可见检测器，流动相甲醇/水：0-8min60％，8-20min 60-100％，20-25min 100％，25-28min 100-60％，28-30min 60％；流速：10ml/min；检测波长：205nm；划分为3段Fr.1-Fr.3；
(3-3-1)
化合物5和化合物6的制备：Fr.1运用半制备HPLC，YMC-Pack ODS-A半制备高效液相色谱柱，250mm×10mm,S-5μm,12nm；流动相：65％甲醇/水等度；流速：1ml/min；检测波长：205nm；纯化，得到化合物5和化合物6；
(3-3-2)
化合物7：Fr.2运用半制备HPLC，YMC-Pack ODS-A半制备高效液相色谱柱，250mm×10mm,S-5μm,12nm，流动相：40％甲醇/水等度；流速：1ml/min；检测波长：205nm；纯化，得到化合物7；
(3-3-3)
化合物8和化合物9的制备：Fr.3运用Sephadex LH-20凝胶柱，柱直径1cm，柱高160cm，流动相为甲醇：水体积比为100:0，4个柱体积；等度洗脱，流速为7S/滴，每5mL收集一个流份，结合TLC点板合并第45-50个流份得到化合物8；合并第60-70个流份得到化合物9。
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