CN106216709A - 一种制备o‑羧甲基壳聚糖包裹纳米银的方法 - Google Patents

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Abstract

一种制备O‑羧甲基壳聚糖包裹纳米银的方法，其所述方法是按硝酸银溶液和O‑羧甲基壳聚糖溶液按比例进行混合后，经紫外光照射制得O‑羧甲基壳聚糖包裹的纳米银抗菌剂。本方法采用纳米银作为主要抗菌成分，O‑羧甲基壳聚糖作为辅助抗菌剂、还原剂和稳定剂，降低了抗菌剂毒性，在紫外光照射下，Ag离子被O‑羧甲基壳聚糖还原成单质银，O‑羧甲基壳聚糖吸附在银核表面防止纳米银团聚，同时起到协同抗菌作用，经检测该抗菌剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度为1µ/mL，对金色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2µ/mL，达到了国内外同类最好产品能达到的最低浓度限度，所用材料对人体无害，价格低廉，是一种绿色环保的新型复合抗菌剂。

Description

一种制备O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银的方法
技术领域
本发明涉及一种复合抗菌剂的制备方法，尤其是一种用于共混或表面改性的壳聚糖-纳米银复合抗菌剂的制备方法。
背景技术
壳聚糖是一种绿色天然抗菌剂，由于壳聚糖分子结构中含有大量羟基和氨基等活性基团，这些基团可以和金属离子发生反应。现有制备具有抗菌性能的壳聚糖类的抗菌通常都采用Ag作为主要抗菌物存在。
纳米银是一类最具前景的纳米材料，具有显著优于银离子化合物的杀菌性能。近年来，产业界和学术界在壳聚糖-纳米银复合抗菌剂的制备和应用方面进行了广泛的探索和开发。
公开的“一种纳米银抗菌溶液及其制备方法”的发明专利，该专利在含有0.001-0.1mol/L的纳米金属银粒子及羧甲基壳聚糖的去离子水溶液中加入2倍银离子摩尔浓度的水合肼还原剂，搅拌反应即可得到含有纳米金属银粒子和羧甲基壳聚糖的纳米银抗菌溶液。但是该专利在制备过程中使用毒性较高的水合肼作为还原剂，使得在医用材料应用方面受到限制，易对人体健康产生威胁。
公开的“一种壳聚糖与银铜共混制备复合抗菌剂的方法”的发明专利，该专利按硝酸银和硝酸铜的浓度比为1:30-1:80 进行混合后，再与壳聚糖共混。制得淡蓝色抗菌剂粉末。本方法减少了银的使用量，其中壳聚糖充当还原剂使用，避免了再加入化学试剂，降低了抗菌剂的毒性。但是该专利制备的抗菌剂提纯干燥后无法重新在水中分散，使得该抗菌剂应用于材料抗菌改性时有较大限制。
发明内容
本发明提供一种制备O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银的方法，该方法采用O-羧甲基壳聚糖作为稳定剂和还原剂，在紫外光下还原银得到一种复合抗菌剂，具有良好且安全的抗菌性能，以解决现有纳米银系抗菌剂制备过程中使用有毒化学试剂对人体健康产生的潜在危害，以及纳米银易团聚、分散性差的问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下。
一种制备O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银的方法，其所述方法是按下列步骤进行的：
(1)将0.1%wt的硝酸银溶液与0.1%wt 的O-羧甲基壳聚糖溶液按体积比为20:80-1:99加入搅拌器，室温下均匀搅拌0.5h-1h；
(2)将上述混合溶液置于2-20mL容量的透明容器中，通氮气20s除尽空气并密封；
(3)将上述容器置于距紫外灯3-8cm处照射5min-200min，紫外灯波长为250-290nm，紫外灯功率为10-40w；
(4)将混合溶液中加入一倍体积无水乙醇在14000r/min转速下离心30-60min使其沉淀，并用40%-60%wt乙醇离心洗涤两次；
(5)将沉淀物进行冷冻干燥，即获得O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂粉末；
(6)将O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂粉末溶于水，并超声20-30min，即制得水溶性壳聚糖包裹纳米银抗菌剂。
其中，所述O-羧甲基壳聚糖分子量为30000- 2000000；所述硝酸银被还原后是单质银。
上述技术方案是经过大量的实验研究，采用先将硝酸银溶液与O-羧甲基壳聚糖溶液按比例混合，然后在紫外光照射下进行还原反应，在制备过程中不需要外加还原剂等化学试剂，得到了抗菌性能好，且成本比较低的绿色新型复合抗菌剂，本发明O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂的制备方法的主要工艺特点如下。
现有技术制备纳米银抗菌剂时一般需分别加入还原剂与稳定剂，本发明使用O-壳聚糖在还原银离子的同时吸附于纳米银表面，起到稳定作用，同时由O-羧甲基壳聚糖极佳的亲水性，本发明获得的纳米银在提纯干燥后可以再次分散于水溶液中。
在硝酸银溶液与O-羧甲基壳聚糖溶液共混后在紫外光照射下进行还原，反应无需加热和搅拌，有利于节能减排。
纳米银表面的O-羧甲基壳聚糖为纳米粒子提供大量的活性基团有利于纳米银粒子进一步改性和应用。
纳米银作为主要抗菌剂，O-羧甲基壳聚糖作为辅助抗菌剂，制备过程不引入其他无抗菌效果试剂。
本方法所制备的O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂经微量肉汤法试验检测对大肠杆菌的最小抑菌浓度为1 µ/mL，对金色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2 µ/mL；O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银在水溶液中具有良好分散性和稳定性，使得其应用领域更广；而且本方法操作简便，快捷，排除了有毒化学试剂的使用，保障了人身的健康，可安全地用于可广泛用于医疗、卫生、环境治理，功能涂料、纺织品抗菌整理等领域。
附图说明
图1是本发明O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂的X射线衍射谱图。图中，看到在2θ=11.4o、21.4o、38.1o、44.3o、64.4o、77.3o、81.5o出现七个特征衍射峰，其中11.4o、21.4o的两个衍射峰是O-羧甲基壳聚糖的特征峰。通过与JCPDS(4-0781) 标准卡片对比，我们可以知道38.1o、44.3o、64.4o、77.3o、81.5o这五个衍射峰分别是对应着立方相金属银的(111)、(200)、(220)、(311)和(222)五个晶面的衍射峰。表明本发明所制备的是含有O-甲基壳聚糖和纳米银的复合抗菌剂，其中的银是立方结构晶系的单质银。
图2是本发明O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂的紫外可见光谱图，图中，曲线在在波长为405nm处出现纳米银的共振吸收峰，该峰宽比较窄,说明球形粒子的粒径分布较窄。
图3是本发明不同硝酸银溶液(0.1wt%)与O-羧甲基壳聚糖溶液(0.1wt%)体积比制备的O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂微量肉汤稀释法抑菌实验结果，试验使用大肠杆菌。
图4是本发明不同硝酸银溶液(0.1wt%)与O-羧甲基壳聚糖溶液(0.1wt%)体积比制备的O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂微量肉汤稀释法抑菌实验结果，试验使用金色葡萄球菌。
具体实施方式
本发明低分子量壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂是按硝酸银(0.1wt%)和O-羧甲基壳聚糖(0.1wt%)的体积比为20:80-1:99进行混合后，经紫外光照射，将获得的的悬浮液进行离心、洗涤、冷冻干燥、水溶液分散，制得O-羧甲基壳聚糖包裹的纳米银抗菌剂。
下面通过具体实施例来进一步详细说明本发明的具体实施方式。
实施例1
(1)将0.1g硝酸银溶于100ml超纯水中，0.1gO-羧甲基壳聚糖溶于100ml超纯水中，按体积比为5:95进行混合，磁力搅拌0.5h；
(2)取3mL混合溶液置于4mL石英比色皿中，通氮气20s将空气排尽后密封，将样品瓶置于距272nm紫外灯5cm处照射130min，紫外灯功率20w；
(3)紫外灯照射结束后石英比色皿中混合溶液变为金黄色，将混合溶液中加入一倍体积无水乙醇在14000r/min转速下离心60min取沉淀，并用50%wt乙醇离心洗涤两次；
(5)将沉淀进行冷冻干燥，即得到O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂粉末。
(6)O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂粉末溶于水，并超声30min，即得O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银抗菌剂。
对本实施例O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银抗菌剂进行微量肉汤稀释法最小抑菌浓度测试：
将大肠杆菌(ATCC11229)和金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的菌种分别以划线法接种到配置好的营养琼脂上，置于恒温培养箱中在下培养后，取典型的菌落移种到营养肉汤培养基中，再次培养，用营养肉汤对菌悬液进行稀释，配制成105CFU/mL细菌悬液备用。
选取灭菌的96孔聚苯乙烯板中并排的八个孔，每孔依次加入双倍浓度的灭菌MH(B)完全培养基100μL、105CFU/mL细菌悬液50μL和倍比稀释后不同浓度的O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂50μL。此时第1孔至第8孔药物浓度分别为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。将96孔聚苯乙烯板置于37oC培养箱内培养24h，用酶标仪检测630nm处各孔的OD值。
试验结果见附图3、附图4，抗菌剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度为1 µ/mL，对金色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2 µ/mL。
通过上述制备方法中，硝酸银溶液(0.1wt%)与O-羧甲基壳聚糖溶液(0.1wt%)的体积之比为5:95，紫外照射使用的容器为石英比色皿，紫外照射时间为130min。
实施例2
按照实施例1的工艺方法，实施例2的区别在于：紫外照射时间为70min。紫外照射后混合溶液呈淡黄色，紫外可见光光谱测试中纳米银紫外吸收峰低于实施例1。与实施例1相比，实施例2减少紫外照射时间可获得尺寸更小、更稳定、颜色更浅的纳米银，有利于进一步应用，但纳米银产率不高，导致成本上升。
实施例3
按照实施例1的工艺方法，实施例4的区别在于：紫外照射使用的容器为玻璃样品瓶。玻璃器皿相对石英器皿廉价易得可有效降低成本，但石英比色皿相对于玻璃瓶透光率更高，同样照射时间下本实施例使用玻璃样品瓶的样品紫外吸收峰远远低于实施例1，纳米银产率较低。
实施例4
按照实施例1的工艺方法，实施例5的区别在于：硝酸银溶液(0.1wt%)与O-羧甲基壳聚糖溶液(0.1wt%)的体积之比为10:90，紫外照射时间为50min。相对于实施例1，本实施例提高了硝酸银用量，可在较短时间内生成更多提高了纳米银合成速度，紫外照射时间降低至50min，同时由于纳米银浓度和尺寸的增大，第四步的离心洗涤的转速可降至12000r/min。
对本实施例O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银抗菌剂进行微量肉汤稀释法最小抑菌浓度测试：
将大肠杆菌(ATCC11229)和金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的菌种分别以划线法接种到配置好的营养琼脂上，置于恒温培养箱中在下培养后，取典型的菌落移种到营养肉汤培养基中，再次培养，用营养肉汤对菌悬液进行稀释，配制成105CFU/mL细菌悬液备用。
选取灭菌的96孔聚苯乙烯板中并排的八个孔，每孔依次加入双倍浓度的灭菌MH(B)完全培养基100μL、105CFU/mL细菌悬液50μL和倍比稀释后不同浓度的O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂50μL。此时第1孔至第8孔药物浓度分别为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。将96孔聚苯乙烯板置于37oC培养箱内培养24h，用酶标仪检测630nm处各孔的OD值。
抑菌试验结果见附图3、附图4，抗菌剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度为2 µ/mL，对金色葡萄球菌的最小抑菌浓度为4 µ/mL，抑菌效果不及实施例1。
实施例5
按照实施例1的工艺方法，实施例7的区别在于：硝酸银溶液(0.1wt%)与O-羧甲基壳聚糖溶液(0.1wt%)的体积之比为15:85，紫外照射时间为20min。相对于实施例1、2，本实施例进一步提高了硝酸银用量，紫外照射仅需20min，同时由于纳米银浓度和尺寸的进一步增大，第四步的离心洗涤的转速可降至10000r/min。
对本实施例O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银抗菌剂进行微量肉汤稀释法最小抑菌浓度测试：
将大肠杆菌(ATCC11229)和金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的菌种分别以划线法接种到配置好的营养琼脂上，置于恒温培养箱中在下培养后，取典型的菌落移种到营养肉汤培养基中，再次培养，用营养肉汤对菌悬液进行稀释，配制成105CFU/mL细菌悬液备用。
选取灭菌的96孔聚苯乙烯板中并排的八个孔，每孔依次加入双倍浓度的灭菌MH(B)完全培养基100μL、105CFU/mL细菌悬液50μL和倍比稀释后不同浓度的O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂50μL。此时第1孔至第8孔药物浓度分别为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。将96孔聚苯乙烯板置于37oC培养箱内培养24h，用酶标仪检测630nm处各孔的OD值。
试验结果见附图3、附图4，抗菌剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度为2 µ/mL，对金色葡萄球菌的最小抑菌浓度为8 µ/mL，抑菌效果不及实施例1、2。

Claims (3)

1.一种制备O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银的方法，其所述方法是按下列步骤进行的：
(1)将0.1%wt的硝酸银溶液与0.1%wt 的O-羧甲基壳聚糖溶液按体积比为20:80-1:99加入搅拌器，室温下均匀搅拌0.5h-1h；
(2)将上述混合溶液置于2-20mL容量的透明容器中，通氮气20s除尽空气并密封；
(3)将上述容器置于距紫外灯3-8cm处照射5min-200min，紫外灯波长为250-290nm，紫外灯功率为10-40w；
(4)将混合溶液中加入一倍体积无水乙醇在14000r/min转速下离心30-60min使其沉淀，并用40%-60%wt乙醇离心洗涤两次；
(5)将沉淀物进行冷冻干燥，即获得O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂粉末；
(6)将O-羧甲基壳聚糖包裹纳米银复合抗菌剂粉末溶于水，并超声20-30min，即制得水溶性壳聚糖包裹纳米银抗菌剂。
2.如权利要求1所述的方法，其所述O-羧甲基壳聚糖分子量为30000- 2000000。
3.如权利要求1所述的方法，其所述硝酸银被还原后是单质银。
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