CN106198817A - 蛋白质n末端肽段的在线分离装置及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分析和检测技术领域,具体为一种蛋白质N末端肽段的在线分离装置及使用方法。该装置包括:两台高压泵、六通阀、四通阀、三通阀、C18柱和巯基肽段捕集柱以及相关连接部件。本发明中,蛋白质固定于填充C18疏水性填料的毛细管柱中,进而进行柱上氨基封闭,柱上酶解,酶解肽段固相巯基衍生,巯基肽段捕集柱捕集非N末端肽段,实现N末端肽段的在线分离。固相的蛋白封闭反应可以减少除盐过程中的损失,简化实验步骤,缩短样品反应时间;同时,可以通过采用过量的衍生试剂,实现肽段高效快速的巯基衍生。本发明通过在线装置,使得反应时间缩短,减少样品转移,减少样品损失,缩短除盐等预处理步骤的耗时,提高蛋白质N末端肽段鉴定效果。
Description
技术领域
本发明属于生物分析和检测技术领域,具体涉及一种蛋白质N末端肽段的在线分离装置及使用方法。
背景技术
设计联用在线装置,减少样品在转移过程中的污染和损失,在蛋白质组学研究中被大量应用,比如应用于磷酸化肽的研究,通过直接上样,减少了转移过程中样品的吸附,使得最终鉴定到的磷酸化肽数目约提高至原来的4倍;通过构建在线平台,与离线方法相比,可以缩短样品前处理时间,可以进一步降低样品的蛋白起始量,被应用于少量细胞的蛋白鉴定中。
鉴定蛋白质N末端序列及其翻译后修饰,以期修正基因组翻译的蛋白质序列,同时探索相关的蛋白质功能。而在目前的实验路线中,多采用离线的模式,需要对样品进行还原烷基化,蛋白层面的氨基封闭、酶解等,涉及多次的溶剂交换和样品转移;同时,实验过程耗时长,容易造成样品中的蛋白发生降解等问题。
基于以上两点考虑,本发明通过设计蛋白质N末端肽段的在线分离装置,实现蛋白质N末端的高效分离和鉴定。首先,将蛋白固定,进行固相的氨基封闭,该反应可以通过加大封闭试剂的浓度减少反应时间;同时,固定化的蛋白,可以简单地通过清洗的方式除去多余的盐分,减少了样品转移过程和溶剂交换的损失;结合固定化蛋白酶解等,搭建起蛋白质N末端肽段的在线分离系统,使得N末端肽段鉴定数目进一步提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白质N末端肽段的在线分离装置及使用方法。
本发明提供的蛋白质N末端肽段的在线分离装置,该装置包括:两台高压泵、一个六通阀、一个四通阀、一个三通阀、一个C18柱和一个巯基肽段捕集柱以及相关连接部件。其中,六通阀有6个接口,高压泵1和六通阀的6号口相连,六通阀的3号口为进样口,进样环连接于六通阀的1号口和4号口之间,C18柱连接于六通阀的5号口和四通阀的2号口之间,六通阀的3号口和四通阀的1号口连接废液瓶子,高压泵2、四通阀的3号口和巯基肽段捕集柱用三通阀相连。其中,高压泵1有A、B、C和D共4个相位,分别对应于A、B、C和D 4个相:A相为去离子水;B相为氨基封闭试剂,由甲醛和氰基硼氢化钠新鲜配制而成,甲醛浓度为0.2-3 M,氰基硼氢化钠浓度为0.1-1.5 M;C相为三乙基碳酸氢铵溶液,浓度为20 mM-1 M;D相为含0.1%三氟乙酸的乙腈。如图1所示。
本发明中,蛋白质固定于填充C18疏水性填料的毛细管柱中,进而进行柱上氨基封闭,柱上酶解,酶解肽段固相巯基衍生,巯基肽段捕集柱捕集非N末端肽段,实现N末端肽段的在线分离。
本发明利用六通阀的切换实现蛋白质进样,酶解,和酶解肽段的巯基衍生;利用装填有金修饰填料的巯基肽段捕集柱,实现含巯基肽段的在线捕集。在该分离过程中,固相的蛋白封闭反应可以减少除盐过程中的损失,简化实验步骤,缩短样品反应时间;同时,固相的衍生反应中,可以通过采用过量的衍生试剂,实现肽段高效快速的巯基衍生。本发明通过在线化装置,使得反应时间缩短,减少样品转移,减少样品损失,缩短除盐等预处理步骤的耗时,可以方便高效地去除非N末端肽段,提高蛋白质N末端肽段鉴定效果。
本发明提供的蛋白质N末端肽段的在线分离装置的使用方法,其基本步骤为:
(1)将六通阀和四通阀都保持在A位,用进样针将蛋白样品注射入进样环;
(2)将六通阀切换至B位,用A相将进样环中的样品以0.01-0.4μL/min的流速通过C18柱;
(3)将六通阀切换至A位,以0.01-0.4μL/min的流速,依次往C18柱中通入B相,反应0.2-4小时,继而通入A相,冲洗C18柱,于此同时,用进样针将胰蛋白酶溶液注射入进样环;
(4)将六通阀切换至B位,用C相将进样环中的胰蛋白酶溶液以0.01-0.4μL/min的流速通过C18柱;
(5)将六通阀切换至A位,用进样针将特劳特试剂注射入进样环,同时,用A相冲洗C18柱;
(6)将六通阀切换至B位,用C相将进样环中的特劳特试剂以0.01-0.4μL/min的流速通过C18柱;
(7)将六通阀切换至A位,将四通阀切换至B位,以0.01-0.4μL/min的流速用D相洗脱C18柱,同时,泵2以0.2-4倍流速通入A相,混合液进入巯基肽段捕集柱,流出液进入液相色谱质谱联用仪进行检测。
以上步骤如图2所示。
本发明中,C18柱的制备方法如下:将C18填料分散于乙腈中,利用气压,将填料填入毛细管中。巯基肽段捕集柱的制备方法如下:首先,将含有三氟乙磺酸基高聚物材料与半胱氨酸混合,置于碱性的缓冲体系中孵育;第二,通过离心得到半胱氨酸修饰的聚合物材料;经过几次水洗后,将该材料与预先合成好的纳米金胶孵育,离心,得到纳米金修饰的高聚物填料;第三,将该填料烘干,并分散于无水乙醇中,利用气压将填料填入毛细管中。
利用本发明设计的蛋白质N末端肽段的在线分离装置,可以在3小时内完成全部实验步骤,包括:蛋白的氨基封闭、酶解、巯基衍生和巯基肽段捕集等,具有相当的应用潜力。
附图说明
图1为本发明的一体化装置图。
图2为N末端肽段在线分离流程图。其中,A相为去离子水;B相为氨基封闭试剂,由甲醛和氰基硼氢化钠新鲜配制而成,甲醛浓度为0.2-3 M,氰基硼氢化钠浓度为0.1-1.5 M;C相为三乙基碳酸氢铵溶液,浓度为20 mM-1 M;D相为含0.1%三氟乙酸的乙腈。
具体实施方式
实施例1:蛋白质在C18柱上氨基封闭和酶解
将还原烷基化后的牛血清白蛋白取10 μg经六通阀切换负载在C18柱中;将六通阀切换至A位,泵1的B相以2 μL/min通过C18柱,反应1小时后;接着,再用A相清洗C18柱子;同时,在进样环中注入30 μL胰蛋白酶溶液,泵1的C相以2 μL/min的流速推动进样环中的酶溶液通过C18柱;反应半小时后,利用C相将C18柱上的肽段洗脱,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行鉴定。结果表明牛血清白蛋白能的氨基能被成功封闭,随之被有效地酶解。
实施例2:C18柱上巯基衍生和巯基肽段捕集柱的捕集效果
将乙酰化肽段GR(1021.5 Da)和氨基游离肽段ER(1282.6 Da)注入C18柱后,再进样120μL 2 M特劳特试剂,用泵1的C相将该试剂以2 μL/min通过C18柱,接着,再用D相将巯基衍生后的肽段洗脱。此时,将四通阀切换至B位,泵2以相同流速注入去离子水,洗脱和去离子水经三通阀进入巯基肽段捕集柱。经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,流出液中仅检测到肽段GR的信号,证明了C18柱子上巯基衍生效果良好,且含巯基肽段被成功地捕集,N末端肽段可以得到有效分离。
Claims (3)
1. 一种蛋白质N末端肽段的在线分离装置,其特征在于,包括:两台高压泵、一个六通阀、一个四通阀、一个三通阀、一个C18柱和一个巯基肽段捕集柱以及相关连接部件;其中,六通阀有6个接口,第一高压泵和六通阀的6号口相连,六通阀的3号口为进样口,进样环连接于六通阀的1号口和4号口之间,C18柱连接于六通阀的5号口和四通阀的2号口之间,六通阀的3号口和四通阀的1号口连接废液瓶子,第二高压泵、四通阀的3号口和巯基肽段捕集柱用三通阀相连;其中,第一高压泵有A、B、C和D共4个相位,分别对应于A、B、C和D 4个相:A相为去离子水;B相为氨基封闭试剂,由甲醛和氰基硼氢化钠配制而成,甲醛浓度为0.2-3 M,氰基硼氢化钠浓度为0.1-1.5 M;C相为三乙基碳酸氢铵溶液,浓度为20 mM-1 M;D相为含0.1%三氟乙酸的乙腈。
2.根据权利要求1所述的蛋白质N末端肽段的在线分离装置,其特征在于,蛋白质固定于填充C18疏水性填料的毛细管柱中,进而进行柱上氨基封闭,柱上酶解,酶解肽段固相巯基衍生,巯基肽段捕集柱捕集非N末端肽段,实现N末端肽段的在线分离。
3.根据权利要求1或2所述的所述的蛋白质N末端肽段的在线分离装置的使用方法,其特征在于具体操作步骤如下:
(1)将六通阀和四通阀都保持在A位,用进样针将蛋白样品注射入进样环;
(2)将六通阀切换至B位,用A相将进样环中的样品以0.01-0.4μL/min的流速通过C18柱;
(3)将六通阀切换至A位,以0.01-0.4μL/min的流速,依次往C18柱中通入B相,反应0.2-4小时,继而通入A相,冲洗C18柱,于此同时,用进样针将胰蛋白酶溶液注射入进样环;
(4)将六通阀切换至B位,用C相将进样环中的胰蛋白酶溶液以0.01-0.4μL/min的流速通过C18柱;
(5)将六通阀切换至A位,用进样针将特劳特试剂注射入进样环,同时,用A相冲洗C18柱;
(6)将六通阀切换至B位,用C相将进样环中的特劳特试剂以0.01-0.4μL/min的流速通过C18柱;
(7)将六通阀切换至A位,将四通阀切换至B位,以0.01-0.4μL/min的流速用D相洗脱C18柱,同时,泵2以0.2-4倍流速通入A相,混合液进入巯基肽段捕集柱,流出液进入液相色谱质谱联用仪进行检测。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109060992A (zh) * | 2018-09-03 | 2018-12-21 | 大连技嘉科技有限公司 | 可提高检测准确性的糖化血红蛋白分析仪 |
CN110220999A (zh) * | 2019-07-10 | 2019-09-10 | 中国南方电网有限责任公司超高压输电公司检修试验中心 | 一种变压器油中色谱柱自动反吹扫活化装置 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101055266A (zh) * | 2006-04-13 | 2007-10-17 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种用于蛋白质n-端肽特异性识别与测序的方法和试剂盒 |
CN105316381A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-02-10 | 复旦大学 | 纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质n末端分离的方法 |
CN105319116A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-02-10 | 复旦大学 | 基于磁性微球的蛋白质n末端肽段分离方法 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101055266A (zh) * | 2006-04-13 | 2007-10-17 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种用于蛋白质n-端肽特异性识别与测序的方法和试剂盒 |
CN105316381A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-02-10 | 复旦大学 | 纳米金修饰的石墨烯用于蛋白质n末端分离的方法 |
CN105319116A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-02-10 | 复旦大学 | 基于磁性微球的蛋白质n末端肽段分离方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
LANTING LI ET AL.: "A novel method to isolate protein N-terminal peptides from proteome samples using sulfydryl tagging and gold-nanoparticle-based depletion", 《ANAL BIOANAL CHEM》 * |
赵丽艳 等: "蛋白质和多肽的N端测序技术研究进展", 《中国医药生物技术》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109060992A (zh) * | 2018-09-03 | 2018-12-21 | 大连技嘉科技有限公司 | 可提高检测准确性的糖化血红蛋白分析仪 |
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