CN106191287A

CN106191287A - 一种大豆耐盐性的检测方法

Info

Publication number: CN106191287A
Application number: CN201610631360.0A
Authority: CN
Inventors: 宁丽华; 邵宏波; 张大勇; 郭士伟; 何晓兰; 黄益洪; 徐照龙; 万群; 刘佳
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-08-02
Filing date: 2016-08-02
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2036-08-02
Also published as: CN106191287B

Abstract

本发明提供一种大豆耐盐性的检测方法，具体为：首先提取待测大豆基因组DNA，再分别以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，对大豆基因组DNA进行PCR扩增，对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收PCR扩增产物；然后利用限制性内切酶XbaI对回收的PCR扩增产物进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若酶切产物为324bp的DNA片段，则待测大豆为耐盐大豆；若酶切产物为280bp和40bp的两个DNA片段，则待测大豆为盐敏感大豆；本发明是利用Glyma.03g171500基因起始密码子上游‑643位核苷酸进行甄别，在大豆苗期就可以利用该分子标记对大豆耐盐性进行鉴定，结果准确，操作简便，大大提高育种效率，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。

Description

一种大豆耐盐性的检测方法

技术领域

本发明涉及大豆耐盐育种和分子生物学技术领域，特别是一种大豆耐盐性的检测方法。

背景技术

我国盐渍化土壤分布广泛，总面积高达两亿亩。目前由于环境持续恶化和不合理耕作等原因，盐渍化土壤面积仍不断增加。同时由于近年来粮食压力的增大和可用耕地面积的持续减少，盐渍化土壤成为我国耕地的重要后备土地资源，但是土壤盐渍化严重影响作物生长进程和产量水平，大大限制了盐渍化土壤的快速改良和有效利用。

大豆是我国重要的粮食作物和油料作物，在大豆五大主产区均存在不同程度的土壤盐渍化的问题。大豆属于中度耐盐作物，在盐害胁迫下大豆产量和品质受到很大影响。我国蕴藏着大量的大豆种质资源以及丰富优异等位变异，因此选育耐盐品种对于促进盐渍土地的有效利用和实现大豆高产稳产具有重要的理论意义和实践价值。

目前大豆耐盐性鉴定主要依靠育种者在盐渍条件下对大豆不同生育期的耐盐特性调查进行判断，鉴定结果易受外界环境影响。因此，耐盐性大豆遗传育种迫切需要寻找一种不受环境条件及生育期限制并且能够快速准确进行大豆耐盐性鉴定方法。

分子标记辅助选择在DNA水平上对不同大豆种质及大豆耐盐育种后代的耐盐性进行检测，该方法可以在大豆苗期进行，从而加快耐盐大豆育种进程。目前可用于大豆耐盐性鉴定的分子标记较少，郭培等(中国农业科学33:10-16，2000)开发一个共显性的PARD分子标记，可以鉴定耐盐大豆个体(700bp)和敏盐大豆个体(600bp)，该标记在锦豆33×Hark以及铁峰8号×早熟6号两个F₂群体中得到验证(郭培等，2002，大豆科学，21:56-61)；田蕾(2008中国农业科学院硕士论文)将前期开发的RAPD标记转化为SCAR标记，SCAR的使用增强了RAPD标记的特异性并简化PCR分析；张孟臣(专利申请号201210538634.3)开发一对引物可以用于冀豆12号与冀NF58的杂交组合后代的耐盐性鉴定和筛选。然而大豆耐盐性状为多基因控制的数量性状，仅靠现有的这些耐盐分子标记对大量的大豆种质耐盐性进行鉴定是远远不够的，因此急需开发和补充新的可用于育种实践中的有效分子标记。

GmNcl1基因(Glyma.03g171500)与拟南芥的CHXs家族亲缘关系较近，AtCHX21编码拟南芥的一个Na⁺/H⁺反向转运蛋白，在调节根木质部Na⁺浓度发挥重要作用，该基因被敲除后拟南芥植叶片和木质部中的Na⁺含量降低(2006Hall et al.Journal of ExperimentalBotany Vol.57,No.5,pp.1201-1210)。对GmNcl1基因表达模式进行分析发现该基因受盐胁迫诱导表达上调，并且盐敏感大豆85-140较耐盐品种铁峰8号的Ncl1上调表达幅度更大，说明该基因为大豆耐盐相关基因(2014赫卫等，中国农业科学47(3):411-421)；赫卫等(2014)对50个不同耐盐性大豆品种的Glyma.03g171500基因启动子及基因序列拼接获得的序列进行聚类分析，发现耐盐品种和盐敏感品种之间存在特定的单倍型GAGATATTC(耐)/TTT----CT(敏)序列。

CAPS是酶切扩增多态性序列标记技术，是特异引物的PCR扩增产物与限制性内切酶相结合而产生的一种DNA分子标记，它揭示了特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点的变异信息。具有共显性、位点特异性、操作简单和成本低的特点。目前，基于Glyma.03g171500基因的DNA序列差异的大豆耐盐性检测方法尚未见报道。

发明内容

针对上述问题，本申请根据不同大豆品种Glyma.03g171500基因的DNA序列差异，将其开发成CAPS分子标记，通过PCR扩增及电泳技术将DNA水平上遗传多态性出来，该方法简便快速，检测结果直观易区分，本发明是这样实现的：

一种大豆耐盐性的检测方法，其具体步骤如下：

A)提取待测大豆基因组DNA；

B)分别以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，对大豆基因组DNA进行PCR扩增；然后对反应产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，再回收PCR扩增产物；

C)利用限制性内切酶XbaI对回收的PCR扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳检测；若酶切产物为324bp的DNA片段，则待测大豆为耐盐大豆；若酶切产物为280bp和40bp的两个DNA片段，则待测大豆为盐敏感大豆。

优选的，本发明所述大豆耐盐性的检测方法中，步骤B)所述对大豆基因组DNA进行PCR扩增，是指：

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer 25μL、dNTP Mix(10mM each)1μL、上下游引物(10μM)各4μL、1U/μL的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL、20ng/μL的模板DNA4μL、ddH₂O补足到50μL；

PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。

优选的，本发明所述大豆耐盐性的检测方法中，步骤C)所述利用限制性内切酶XbaI对PCR扩增产物进行酶切，具体是指：

酶切体系：10×FastDigest Green Buffer 5μL、100ng/μL的DNA 25μL、1U/μL限制性内切酶XbaI 1μL、ddH₂O补足到50μL；

酶切条件：37℃温浴15min；反应结束后，65℃温浴20min以终止酶切反应。

本发明中，SEQ ID NO.1为上游(正向)引物序列：CTCACAACTCACAATTGCCA；其是根据所述大豆基因组中Glyma.03g171500基因起始密码子上游-643位核苷酸的上游序列进行设计；SEQ ID NO.2为下游(反向)引物序列：GAGGCTACGTGCGCCTCTA；其是根据所述大豆基因组中Glyma.03g171500基因起始密码子上游-643位核苷酸的下游序列进行设计。

本发明所提供的检测方法，主要为检测待测大豆的基因组中Glyma.03g171500基因起始密码子上游-643位核苷酸为C还是T(见SEQ ID NO.3)，利用限制性内切酶XbaI对待测大豆基因PCR扩增产物进行酶切，若酶切产物为324bp的DNA片段，则待测大豆为耐盐大豆；若酶切产物为280bp和40bp的两个DNA片段，则待测大豆为盐敏感大豆。将上述324bp的DNA片段回收双向测序发现其序列为SEQ ID NO.4，第30-33位核苷酸(ATAT)，且第45为核苷酸为T。将上述280bp的DNA片段回收测序，发现其序列为SEQ ID NO.3第45-324位序列(序列的第45为C)，测序结果与酶切结果一致。

本发明利用Glyma.03g171500基因起始密码子上游-643位核苷酸设计特异性引物进行PCR扩增，再利用限制性内切酶XbaI对胶回收的PCR扩增产物进行酶切，通过对酶切产物的判断，在大豆苗期就可以利用该分子标记对大豆耐盐性进行鉴定，结果准确，操作简便，大大提高育种效率，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为耐盐大豆(A清远小青豆)与盐敏感大豆(B邢阳灰黄豆)盐胁迫处理后的表型示意图；

图2为PCR产物测序后比对结果示意图；

图3为鉴定耐盐大豆相关基因分子标记扩增及XbaI酶切后的结果示意图，其中M1：为Takara DL 2000bp DNA Marker，M2：Thermo scientific GeneRuler 50bp DNA Ladder，1-10为引物对扩增后PCR产物电泳图，其中，1：铁峰8号，2：Lee68，3：BB52，4：大悟六月爆，5：清远小青豆，6：Jackson，7：Williams 82，8：N23674，9：邢阳灰黄豆，10：南农89-30；11-20为1-10相应的PCR产物用XbaI酶切后的电泳图。

具体实施方式

实施例中涉及的大豆品种铁峰8号，记载于“姜静涵.大豆苗期耐盐机理研究及耐盐基因定位.中国农业科学院，生物化学与分子生物学，2013，硕士论文”，为耐盐大豆品种，由江苏省农业科学院陈华涛赠予；

大豆品种Jackson：记载于“Hamwieh A,Xu DH,2008.Conserved salt tolerancequantitative trait locus(QTL)in wild and cultivated soybeans.BreedingScience,58:355-359.”，为耐盐大豆品种，由江苏省农业科学院陈华涛赠予；

大豆品种Lee68，BB52和N23674：记载于“於炳军.一年生盐生野生大豆BB52苗期耐盐机理的研究.南京农业大学，植物学，2001，博士论文”，Lee68和BB52为耐盐大豆品种，N23674为盐敏感大豆品种，由国家大豆改良中心提供；

大豆品种大悟六月爆，清远小青豆，邢阳灰黄豆和南农89-30均由国家大豆改良中心提供；

DNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购于Axygen公司；

高保真DNA聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase购于Vazyme公司；

FastDigest XbaI限制性内切酶和Thermo scientific GeneRuler 50bp DNALadder购于Thermo Scientific公司；

Takara DL 2000bp DNA Marke购于Takara公司；

实施例中所使用的PCR仪为Life technologies的ProFlex PCR System；

实施例中所涉及的引物和测序由南京金斯瑞有限公司合成和完成。

实施例中所使用的试验方法无特殊说明，均为常规方法，所使用的试验材料、试剂等若无特殊说明，均为商业购买。

实施例中涉及的序列：

上游(正向)引物序列SEQ ID NO.1：CTCACAACTCACAATTGCCA；

下游(反向)引物序列SEQ ID NO.2：GAGGCTACGTGCGCCTCTA；

Glyma.03g171500基因启动子的1578bp核苷酸序列SEQ ID NO.3：

GGAGTCAATGAAACCGGATGGGTTTGCTTACAAAAAATAAAATTAAACCGGATGGATAATTAATTCTAATGCCACAGATCATGACATTTGATACAAAATACTACTTTAACTCCTTTGATGCTTATAAAGTTTGGTGTTTGAGGTTTGATGAATCTTTTAATTTATTCATGAAGATCGATCGAATTAACTTAAGAAATTAAATAAAATAATAACAAGAAATTTCTCATGGCTAATAAAAATTAGCATAATCTTGTAGAAGCTACAATTTTAAATATAAATTTTATTTTTATATAAATAAATACTTACAGTAATTCATGAAAAATTGTAAAAAAAAAAATGCCTCCACTGCTGAACGTGAAGCAATGCTTAGACTTATTATATTTATACACTATATATTATTTTGGTAACCACTTCTAATAAGAATTTTTGAATTTATGTTGTAATTCTAAGGTCCAAATTATTTTTACAAATTTGTTTGATTTGATTATGAGATTAATTTTTAGGACTTAGTCAAGTTATTCGTTTTTTCTCCCAGAATATATTTTATACCTCCTTTTTTAGACAGTAAAAATATATTATATTTTTTTTTCAAGTTAAATACAAAAAAACTTTTCTATGAGTATGGGTAATTAATGAGTCTCTCAAACTTTTAGTGTTTTAATAGTTAATAGTTAATTTTGGACATTTGAAATTATAATACGTATTATTTTTTCAAAAGACATGAAGAGTGTTGCAGAAGACAAATTAGTTTTGAATTAAATATGAAATATAATTTATTTAATTAACTATTTCTTGAACGTATAAATATATCCATTTTGAATTCATTTGTTCAAGTCTTTTTTTACATTCCAACCATTTACTACAATACCTTATATTGTATTTCACTCAAGAGCAACTCACAACTCACAATTGCCACAGTAATATCAGAAAATTCTCTAGAGTAAATTAAGAACTCACATAAAGAAACAAAGTCTCATCGTCAAGCCAATCATCTGAAGAAAAGCATTGAGGTAGTCGTTAGCTGTTTCACGCAACTGATTATTCATCACTCAGATTTCAACCGACACTTTAATTTGATAAGAAGTTCATATATAAATTAAGAAACCCACAATCATATATTAGGAGTTGAATTTGAAATTTGCGATTAGCGCCACGCAAAGGTAGCGTTAAAAAAGATGAGATAACAAAGAGAGGGATAGAGGCGCACGTAGCCTCAGCAGCCGCGAATTTTAATTAAAACCCGTCAGCTATGTTTTTCCATCTATAAATACAGACCCAAGCAGCGACACTTTGTTGACTCAAAACATCACAAGAACAACCGACACTTTAATTTGATAAGAAGTTCATATATAAATTAAGAAACCCACAATCATATATTAGGAGTTGAATTTGAAATTTGCGATTAGCGCCACGCAAAGGTAGCGTTAAAAAAGATGAGATAACAAAGAGAGGGATAGAGGCGCACGTAGCCTCAGCAGCCGCGAATTTTAATTAAAACCCGTCAGCTATGTTTTTCCATCTATAAATACAGACCCAAGCAGCGACACTTTGTTGACTCAAAACATCACAAGAACAACC；

以Williams 82的DNA为模板以所述引物对进行PCR扩增后的测序结果SEQ IDNO.4：

CTCACAACTCACAATTGCCACAGTAATAT....CAGAAAATTCTCTAGAGTAAATTAAGAACTCACATAAAGAAACAAAGTCTCATCGTCAAGCCAATCATCTGAAGAAAAGCATTGAGGTAGTCGTTAGCTGTTTCACGCAACTGATTATTCATCACTCAGATTTCAACCGACACTTTAATTTGATAAGAAGTTCATATATAAATTAAGAAACCCACAATCATATATTAGGAGTTGAATTTGAAATTTGCGATTAGCGCCACGCAAAGGTAGCGTTAAAAAAGATGAGATAACAAAGAGAGGGATAGAGGCGCACGTAGCCTC；

以铁峰8号的DNA为模板以所述引物对进行PCR扩增后的测序结果SEQ ID NO.5：

CTCACAACTCACAATTGCCACACTAATATATATCAGAAAATTCTTTAGAGTAAATTAAGAACTCACATAAAGAAACAAAGTCTCATCGTCAAGCCAATCATCTGAAGAAAAGCATTGAGGTAGTCGTTAGCTGTTTCACGCAACTGATTATTCATCACTCAGATTTCAACCGACACTTTAATTTGATAAGAAGTTCATATATAAATTAAGAAACCCACAATCATATATTAGGAGTTGAATTTGAAATTTGCGATTAGCGCCACGCAAAGGTAGCGTTAAAAAAGATGAGATAACAAAGAGAGGGATAGAGGCGCACGTAGCCTC。

实施例1

分别选取大豆品种铁峰8号，Lee68，BB52，大悟六月爆，清远小青豆，Jackson，Williams82，N23674，邢阳灰黄豆，南农89-30大小一致、籽粒饱满、种皮完整的种子，消毒催芽后播种于装满蛭石的花盆中。

将萌发一周的大豆材料转移到含有1/2×Hoagland营养液的水培箱，待大豆幼苗生长到第一片复叶完全展开时，每个品种均选取长势相同大豆幼苗分为两组分别放在含有不同浓度NaCl的1/2×Hoagland营养液中培养：一组(对照组，0mM NaCl)以不加盐的1/2×Hoagland营养液培养，另一组(实验组，150mM NaCl)加入50mM NaCl处理一天，接着再用100mM NaCl处理一天，然后将盐浓度提高到150mM进行处理一周。然后对两组大豆幼苗进行耐盐性调查。以上试验均在光照、温度与湿度可控的温室内开展试验，试验条件为：光照时间16小时，光强约600μmol m^{-2 s-1}，昼夜温度28℃/18℃，相对湿度65％-85％。根据叶片盐害症状将大豆划分为5个级别，分别为耐盐(正常叶片)、较耐盐(叶受损面积≤25％)、中度(25％<叶受损面积≤50％)、较敏感(50％<叶受损面积≤75％)和敏感(叶受损面积>75％或死亡)。

该试验最终鉴定结果为铁峰8号，Lee68和BB52为耐盐大豆，Jackson，Williams 82和N23674为盐敏感大豆，与在先文献鉴定结果一致，大悟六月爆和清远小青豆为耐盐大豆品种，邢阳灰黄豆和南农89-30为盐敏感大豆品种。

图1为盐胁迫处理后的表型示意图，其中图1A为清远小青豆(耐盐大豆)，图1B为邢阳灰黄豆(盐敏感大豆)；

利用DNA提取试剂盒分别提取这十种不同大豆(Glycine max(L.)Merr.)品种幼苗叶片中基因组DNA(提取方法严格依照试剂盒说明书)，以此为模板，利用SEQ ID NO.1和SEQID NO.2进行PCR扩增；

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer 25μL；dNTP Mix(10mM each)1μL；上下游引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)各4μL(10μM)；Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase(1U/μL)1μL；模板DNA 4μL(20ng/μL)；ddH₂O补足到50μL。

PCR扩增程序为95℃预变性3min；然后95℃变性15s，56℃退火45s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保温。

反应结束后，将所得PCR产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，结果显示所得PCR产物长度约为320bp(耐盐大豆为324bp；盐敏感大豆为320bp)，为目的扩增条带，将所得PCR扩增产物利用DNA凝胶回收试剂盒回收，所获得胶回收PCR扩增产物分为两部分：

一部分进行双向测序，其中以Williams 82的DNA为模板进行PCR扩增后的测序结果如SEQ ID NO.4所示，以铁峰8号的DNA为模板进行PCR扩增后的测序结果如SEQ ID NO.5所示。利用DNAMAN软件对测序结果进行比对显示(图2)，所有耐盐大豆的测序结果第30-33位核苷酸为ATAT，且第45为核苷酸为T；而所有的盐敏感大豆的测序结果第30-33位核苷酸为缺失，且第45为核苷酸为C。

另一部分胶回收PCR扩增产物进行限制性酶切法检测变异位点：由于基因Glyma.03g171500起始密码子上游-643位的碱基变化(SNP＝C/T)，使得：当为C(盐敏感大豆)时形成限制性内切酶XbaI的识别序列(T^CTAGA，下划线处为核苷酸多态，^表示酶切位置)，可以被XbaI切开；而当为T(耐盐大豆)时不能形成限制性内切酶XbaI的识别序列，因而不能被XbaI切开。

将上述PCR扩增产物用限制性内切酶XbaI单酶切。酶切体系：10×FastDigestGreen Buffer5μL；DNA(100ng/μL)25μL；限制性内切酶XbaI(1U/μL)1μL；ddH₂O补足到50μL。与待酶切的DNA量相比，确保酶切体系中XbaI酶的用量充足。酶切条件为：37℃温浴15min；反应结束后，65℃温浴20min终止酶切反应；将酶切产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳检查。

酶切结果如图3所示，图3中M1：为Takara DL 2000bp DNA Marker，M2：Thermoscientific GeneRuler 50bp DNA Ladder，1：铁峰8号，2：Lee68，3：BB52，4：大悟六月爆，5：清远小青豆，6：Jackson，7：Williams 82，8：N23674，9：邢阳灰黄豆，10：南农89-30。1-10为引物对扩增后PCR产物电泳图，11-20为1-10的PCR产物用XbaI酶切后的电泳图。由图3可见，盐敏感的PCR产物被XbaI完全酶切，得到280bp与40bp两个片段；而耐盐大豆的PCR产物不能被XbaI酶切，得到的324bp的单一片段。将上述324bp的DNA片段回收双向测序发现其序列为序列4，第30-33位核苷酸(ATAT)，且第45为核苷酸为T。利用测序技术进一步对酶切结果检测发现：将上述280bp的DNA片段回收测序，发现其序列为序列3第45-324位序列(序列的第45为C)。

经过耐盐性鉴定与CAPS标记分析结果比对，预测结果与实测结果吻合，检测结果参见表1：

表1预测与实际结果比对

以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种大豆耐盐性的检测方法

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ctcacaactc acaattgcca 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gaggctacgt gcgcctcta 19

<210> 3

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggagtcaatg aaaccggatg ggtttgctta caaaaaataa aattaaaccg gatggataat 60

taattctaat gccacagatc atgacatttg atacaaaata ctactttaac tcctttgatg 120

cttataaagt ttggtgtttg aggtttgatg aatcttttaa tttattcatg aagatcgatc 180

gaattaactt aagaaattaa ataaaataat aacaagaaat ttctcatggc taataaaaat 240

tagcataatc ttgtagaagc tacaatttta aatataaatt ttatttttat ataaataaat 300

acttacagta attcatgaaa aattgtaaaa aaaaaaatgc ctccactgct gaacgtgaag 360

caatgcttag acttattata tttatacact atatattatt ttggtaacca cttctaataa 420

gaatttttga atttatgttg taattctaag gtccaaatta tttttacaaa tttgtttgat 480

ttgattatga gattaatttt taggacttag tcaagttatt cgttttttct cccagaatat 540

attttatacc tcctttttta gacagtaaaa atatattata tttttttttc aagttaaata 600

caaaaaaact tttctatgag tatgggtaat taatgagtct ctcaaacttt tagtgtttta 660

atagttaata gttaattttg gacatttgaa attataatac gtattatttt ttcaaaagac 720

atgaagagtg ttgcagaaga caaattagtt ttgaattaaa tatgaaatat aatttattta 780

attaactatt tcttgaacgt ataaatatat ccattttgaa ttcatttgtt caagtctttt 840

tttacattcc aaccatttac tacaatacct tatattgtat ttcactcaag agcaactcac 900

aactcacaat tgccacagta atatcagaaa attctctaga gtaaattaag aactcacata 960

aagaaacaaa gtctcatcgt caagccaatc atctgaagaa aagcattgag gtagtcgtta 1020

gctgtttcac gcaactgatt attcatcact cagatttcaa ccgacacttt aatttgataa 1080

gaagttcata tataaattaa gaaacccaca atcatatatt aggagttgaa tttgaaattt 1140

gcgattagcg ccacgcaaag gtagcgttaa aaaagatgag ataacaaaga gagggataga 1200

ggcgcacgta gcctcagcag ccgcgaattt taattaaaac ccgtcagcta tgtttttcca 1260

tctataaata cagacccaag cagcgacact ttgttgactc aaaacatcac aagaacaacc 1320

gacactttaa tttgataaga agttcatata taaattaaga aacccacaat catatattag 1380

gagttgaatt tgaaatttgc gattagcgcc acgcaaaggt agcgttaaaa aagatgagat 1440

aacaaagaga gggatagagg cgcacgtagc ctcagcagcc gcgaatttta attaaaaccc 1500

gtcagctatg tttttccatc tataaataca gacccaagca gcgacacttt gttgactcaa 1560

aacatcacaa gaacaacc 1578

<210> 4

<211> 320

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctcacaactc acaattgcca cagtaatatc agaaaattct ctagagtaaa ttaagaactc 60

acataaagaa acaaagtctc atcgtcaagc caatcatctg aagaaaagca ttgaggtagt 120

cgttagctgt ttcacgcaac tgattattca tcactcagat ttcaaccgac actttaattt 180

gataagaagt tcatatataa attaagaaac ccacaatcat atattaggag ttgaatttga 240

aatttgcgat tagcgccacg caaaggtagc gttaaaaaag atgagataac aaagagaggg 300

atagaggcgc acgtagcctc 320

<210> 5

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctcacaactc acaattgcca cactaatata tatcagaaaa ttctttagag taaattaaga 60

actcacataa agaaacaaag tctcatcgtc aagccaatca tctgaagaaa agcattgagg 120

tagtcgttag ctgtttcacg caactgatta ttcatcactc agatttcaac cgacacttta 180

atttgataag aagttcatat ataaattaag aaacccacaa tcatatatta ggagttgaat 240

ttgaaatttg cgattagcgc cacgcaaagg tagcgttaaa aaagatgaga taacaaagag 300

agggatagag gcgcacgtag cctc 324

Claims

1.一种大豆耐盐性的检测方法，其特征在于，步骤如下：

A）提取待测大豆基因组DNA；

B）分别以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为上下游引物，对大豆基因组DNA进行PCR扩增；然后对反应产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳，再回收PCR扩增产物；

C）利用限制性内切酶XbaI对回收的PCR扩增产物进行酶切，再对酶切产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳检测；若酶切产物为324bp的DNA片段，则待测大豆为耐盐大豆；若酶切产物为280bp和40bp的两个DNA片段，则待测大豆为盐敏感大豆。

2.根据权利要求1所述大豆耐盐性的检测方法，其特征在于，步骤B）所述对大豆基因组DNA进行PCR扩增，是指：

PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer 25μL、10mM each dNTP Mix1μL、浓度均为10μM的上下游引物各4μL、1U/μL的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL、20ng/μL的模板DNA4μL、ddH₂O补足到50μL;

PCR 扩增程序为：95℃预变性3 min； 95℃变性15 s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保温。

3.根据权利要求1所述大豆耐盐性的检测方法，其特征在于，步骤C）所述利用限制性内切酶XbaI对PCR扩增产物进行酶切，具体是指：

酶切体系：10×FastDigest Green Buffer 5μL、100ng/μL 的DNA 25μL、1 U/μL限制性内切酶XbaI 1μL、ddH₂O补足到50μL；

酶切条件：37℃温浴15min；反应结束后，65℃温浴20 min以终止酶切反应。