CN106191191A - 无患子皂苷提取物、其发酵精制方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无患子皂苷提取物、其发酵精制方法及应用。所述方法包括：将无患子果皮置于容器中，并按1‑5％的接种量加入乳酸菌种子液，在温度为30‑37℃的条件下密封培养5‑7天进行第一次发酵；向第一次发酵所得料液的上清液中接种1‑5％的酵母菌，在温度为25‑30℃的条件下密封培养3‑5天进行第二次发酵；对经两次发酵所得料液进行后处理，获得无患子皂苷提取物。本发明提供的无患子皂苷提取物发酵精制方法操作简单，设备投资少，生产周期短，制备高效，安全，成本低，易于工业化生产，且所获无患子皂苷提取物对青春痘相关病原菌具有优异的抑制效果。

Description

无患子皂苷提取物、其发酵精制方法及应用

技术领域

本发明具体涉及一种无患子皂苷提取物、其发酵精制方法及应用，例如在抑制青春痘相关病原菌中的用途，属于天然产物提取领域。

背景技术

痤疮又称青春痘、粉刺、暗疮，是一种发生于毛囊及皮脂腺的慢性炎症性皮肤科常见病、多发病，在青春期和成年期的发病率较高。引起痤疮发生的因素比较复杂，现认为主要包括以下四大类：毛囊及皮脂腺导管上皮的过度角化，微生物的定植，皮脂腺过度分泌以及不良炎症反应。而在微生物感染中，痤疮丙酸杆菌(P.acnes)、金黄色葡萄球菌(S.aures)、大肠杆菌(E.coli)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)这五种菌是引起痤疮的主要致病菌。痤疮丙酸杆菌等微生物的侵入，使皮脂分解成游离脂肪酸，使得毛囊及其周围发生炎症反应，从而导致痤疮的产生。

目前，痤疮主要是通过抗生素来进行治疗，抗生素药物主要包括过氧化苯甲酰、维甲酸、他扎罗汀和阿达帕林等。由于临床上对抗生素的滥用导致许多致病菌产生了耐药性，使得治疗痤疮的疗效不显著，并且抗生素药物均具有一定的副作用。针对痤疮日益严重的形势，人们对抗药物的研究日益增多，目前国内外研究员们着手从中草药中提取具有高疗效、低毒副的活性成分来研究对痤疮相关病原菌的抑制作用，包括椰子油中的月桂酸，大黄中的蒽醌，黄芩中的黄芩苷，黄柏中的盐酸小劈碱，以及芦荟中的芦荟甙、芦荟素等。此外，研究发现中药活性成分在菌体中具有多样化的作用途径和机制，通过产生不同的药理作用，从而使得菌株的耐药性降低，用于预防和治疗细菌或真菌感染引起的疾病具有众多优势。但是与抗生素相比较，天然产物抗菌成分的有效抑菌浓度高，需要与其它抗菌药配合使用才能达到良好的效果，因此中草药活性成分的使用受到了一定的限制。

无患子，亦称洗手果、油罗树，其根、皮、叶、果皮、种子等均具有很强的药用价值，是不可多得的自然资源。其果皮中含有丰富的皂苷，搓揉便会产生大量泡沫，因此添加至洗涤剂中可增加洗涤效果。此外，研究表明无患子皂苷具有抗菌活性，但由于分子量结构大，不利于其进入细菌和真菌细胞，因此抑菌浓度高，达不到直接杀菌的效果。

现有技术中用于分离纯化无患子皂苷的方法种类较多，包括水提醇沉法、正丁醇萃取法、超滤膜分离法、大孔树脂法以及微生物发酵法等。其中，水提醇沉法应用最为普遍，但所得产品皂苷纯度不高。近年来，微生物发酵法应用十分广泛，一些通过物化方法较难去除的大分子物质可通过微生物进行分解，效果十分显著，并且微生物发酵法其产品纯度比常规水提法所得产品纯度相对较高。有研究人员还曾通过单一微生物菌株对无患子皂苷进行分离纯化，但是单独使用一种菌株的针对性不强，因此得到的皂苷纯度不高，导致其中的有效成分活性并不高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种无患子皂苷提取物、其发酵精制方法及应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种无患子皂苷的提取方法包括以下步骤：

将无患子果皮置于容器中，按1-5％的接种量加入乳酸菌种子液，在温度为30-37℃的条件下密封培养5-7天进行第一次发酵；

向第一次发酵所得料液的上清液中接种1-5％的酵母菌，在温度为25-30℃的条件下密封培养3-5天进行第二次发酵；

对经两次发酵所得料液进行后处理，获得无患子皂苷提取物

本发明实施例中还提供了由所述方法制备的无患子皂苷提取物。

本发明实施例中还提供了所述无患子皂苷提取物在制备青春痘相关病原菌抑制剂或药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

1)本发明直接采用无患子果皮进行发酵得到无患子皂苷提取物，其中的皂苷纯度大于70％。提取工艺设备投资少，生产周期短，制备高效，操作简单、安全，成本低，易于工业化生产。

2)本发明将无患子果皮先经乳酸菌进行第一次发酵，然后将酵母菌直接接种于上清液进行第二次发酵，并加入一定浓度的碳酸钙溶液，最大程度地利用其中的营养成分，无需过滤除渣，且所得提取物不含糖类物质，产品纯度高，质量稳定。

3)本发明得到的无患子发酵液中除了含有皂苷提取物外，还含有乳酸菌发酵所产生的乳酸，能有效促进对病原菌的抑制作用。

4)本发明还可通过真空抽滤回收的酒精，可用作溶剂或燃料，从而实现无患子果皮的高值化利用。

5)药理实验证明，本发明得到的无患子皂苷提取物比无患子皂苷水提液对痤疮丙酸杆菌等病原菌的抑制效果更好。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本发明提供的无患子皂苷的提取方法采用乳酸菌发酵可将无患子果皮中的糖类物质及少量蛋白转化为乳酸，乳酸对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等病原菌具有一定的抑制作用；酵母菌发酵糖类的代谢产物以气体的形式放出，因此简化了后续处理工艺。当把两种菌株先后接入无患子果皮堆积层中，不仅充分地利用其中的营养成分，而且避免竞争性抑制作用，因此杂质去除率较高，并且在一定程度上对皂苷起到了浓缩作用。

本发明实施例的一个方面提供了一种无患子皂苷提取物的发酵精制方法，其包括以下步骤：

将无患子果皮置于容器中，并按接种量1-5％接种乳酸菌种子液，在温度为30-37℃的条件下密封培养5-7天进行第一次发酵；

向第一次发酵所得料液的上清液中接种1-5％的酵母菌，在温度为25-30℃的条件下密封培养3-5天进行第二次发酵；

对经两次发酵所得料液进行后处理，获得无患子皂苷提取物。

本发明将无患子果皮堆积进行发酵，无需进行浸提处理。

在一些实施方案中，所述发酵精制方法包括：向第一次发酵所得料液的上清液中接种酵母菌种子液，并加入浓度为80-100mg/mL的碳酸钙溶液，再进行第二次发酵。通过添加碳酸钙溶液，可以调节发酵液中电解质浓度，以促进酵母发酵。

其中，所述碳酸钙溶液的用量可以为第一次发酵所得料液的上清液体积的0.3％。

在一些实施方案中，所述发酵精制方法包括：：将乳酸菌接种于MRS培养基上，在温度为30-37℃的条件下培养2-3天，完成乳酸菌的活化，获得所述乳酸菌种子液。

较为优选的，所述MRS培养基包含：蛋白胨8-10g/L，牛肉粉6-8g/L，酵母粉2-4g/L，葡萄糖18-20g/L，磷酸氢二钾1-2g/L，柠檬酸氢二铵1-2g/L，乙酸钠3-5g/L，硫酸镁0.1-0.2g/L，硫酸锰0.02-0.04g/L，吐温80 0.5-1g/L，以及蒸馏水；并且所述MRS培养基pH值为5.7±0.2。

在一些实施方案中，所述发酵精制方法包括：所述酵母菌接种于第一次发酵所得料液的2-4倍稀释液中，并于30-35℃静置活化15-30min，实现酵母菌的活化，之后将活化的酵母菌接种于第一次发酵所得料液的上清液，进行第二次发酵。该活化过程采用的活化介质简单、操作简易，时间短。

在一些实施方案中，所述的后处理包括：对经两次发酵所得料液过滤除渣，之后以8000-10000rpm的速度离心10-15min，再进行浓缩处理，获得所述无患子皂苷提取物。

在一些实施方案中，所述的后处理还包括：回收经两次发酵所得料液中的酒精。进一步，可以将第二次发酵液离心后进行抽滤浓缩，回收酒精

进一步的，所述无患子皂苷提取物中皂苷的纯度大于70wt％。

本发明实施例的另一个方面还提供了由所述方法制备的无患子皂苷提取物。

本发明实施例的另一个方面还提供了所述无患子皂苷提取物在制备青春痘相关病原菌抑制剂或药物中的应用。

在一些较为具体的实施方案中，所述无患子皂苷提取物的发酵精制方法包括的步骤如下：

(1)菌种活化：乳酸菌接种于MRS肉汤里，在37℃的条件下培养2天，获得菌种发酵液；酵母菌接种于第一次发酵所得液体的两倍稀释液中，于35℃水浴上静置活化30min。

(2)发酵：将无患子果皮平铺于容器中，按1.5％的接种量加入乳酸菌种子液，在37℃的条件下密封培养5天进行第一次发酵；然后，再按1.5％的接种量将酵母菌种子液接种于上清液中，并加入浓度为100mg/mL的碳酸钙溶液，在30℃的条件下密封培养3天进行第二次发酵。

(3)离心、浓缩：过滤除渣，并将两次发酵所得液体于8000rpm离心10min，然后通过抽滤浓缩得到无患子皂苷提取物。

本发明将乳酸菌和酵母菌这两种菌株先后接入无患子果皮堆积层中，不仅充分地利用其中的营养成分，而且避免竞争性抑制作用，因此杂质去除率较高，并且在一定程度上对皂苷起到了浓缩作用，因此简化了后续处理工艺。

本发明发酵得到的无患子皂苷提取物对青春痘相关病原菌的抑制作用显著高于无患子皂苷水提液。

本发明原料来源广泛，取材便利，拓展了无患子皂苷的药物用途，制备方法简便，抗菌效果良好。

以下结合实施例对本发明的技术作进一步的解释说明。

实施例1

1、无患子皂苷的制备

(1)菌种活化：乳酸菌接种于MRS肉汤里，在37℃的条件下培养2天，获得乳酸菌种子发酵液；安琪酵母菌接种于第一次发酵所得液体的两倍稀释液中，于35℃水浴上静置活化30min。

(2)发酵：将无患子果皮平铺于容器中，接种含量为1.5％的乳酸菌种子液于其中，在37℃的条件下密封培养5天进行第一次发酵；然后，再接种含量为1.5％的安琪酵母菌种子液于上清液中，并加入浓度为100mg/mL的碳酸钙溶液，在30℃的条件下密封培养3天进行第二次发酵。

(3)离心、浓缩：过滤除渣，并将二次发酵所得液体于8000rpm离心10min，后通过真空抽滤浓缩得到无患子皂苷提取物，同时回收酒精。

2、发酵精制所得无患子皂苷提取物的抑菌实验

(1)菌悬液的制备：实验菌株采用痤疮丙酸杆菌、埃希氏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，其中痤疮丙酸杆菌经厌氧培养基在厌氧环境中于37℃活化48h，2至3代后，挑取菌落采用麦氏比浊法用无菌生理盐水稀释成菌液浓度约为10⁶cfu/mL的菌液待用；埃希氏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌经营养琼脂斜面培养基于37℃活化24h，挑取1环接入新鲜液体培养基中，37℃摇床振荡(转速120r/min)培养8h，用接种环蘸取1环在营养琼脂平板培养基上划线，37℃静置培养24h后从其上挑取菌落，采用麦氏比浊法用无菌生理盐水稀释成菌液浓度约为10⁶cfu/mL的菌液待用。

(2)灭菌测试：将10支灭菌试管排成一列、编号，各加入双倍营养的液体培养基(痤疮丙酸杆菌用厌氧培养基)1mL，在第一管内加入1mL待测样品(浓度为100mg/mL，溶剂为蒸馏水)，混匀后吸取1mL到第2管，混匀再取1mL到第3管，依次类推到第9管，弃去1mL，第10管不加提取物作空白对照。每管加入上述配制好的菌悬液1mL，混匀，置于37℃(痤疮丙酸杆菌需在厌氧条件下)静置培养24h(痤疮丙酸杆菌，48h)。然后各取1uL溶液点种在固体培养基上24h(痤疮丙酸杆菌，72h)后观察有无菌落生长。

结果判定：培养基表面无菌落表示无细菌生长，有菌落表示有细菌生长，以能抑制细菌生长的无患子皂苷提取液最高稀释度作为其最低抑菌浓度(MIC)，以0.85％生理盐水做为阴性对照，氨苄青霉素溶液作为大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的阳性对照，0.1％皮傲宁溶液作为痤疮丙酸杆菌的阳性对照，结果见表1。

表1无患子皂苷提取物对致病菌的MIC实验数据

对表1的说明：1)若平行之间有差异，则以浓度大者作为最终的最小抑菌浓度；2)：—表示未进行实验操作；3)+：表示有菌落生长，且不存在浓度梯度。

由表1可知无患子皂苷衍生物对这三种痤疮的病原菌均具有良好的抑制效果，对痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度为0.39mg/mL，对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为3.13mg/mL。与无患子皂苷水提液相比，本发明发酵精制所得到的无患子皂苷提取物对该三种致病菌的抑菌作用显著提高。

综上所述，本发明通过直接对无患子果皮进行发酵精制，所得到的无患子皂苷提取物纯度高，与无患子皂苷水提液相比较，其对痤疮丙酸杆菌等病原菌的抑制作用更强，且制备高效、操作简单、安全、成本低、易于工业化生产。

应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种无患子皂苷提取物的发酵精制方法，其特征在于包括以下步骤：

将无患子果皮置于容器中，并接种含量为1-5％的乳酸菌种子液，在温度为30-37℃的条件下密封培养5-7天进行第一次发酵；

向第一次发酵所得料液的上清液中接种1-5％的酵母菌，在温度为25-30℃的条件下密封培养3-5天进行第二次发酵；

对经两次发酵所得料液进行后处理，获得无患子皂苷提取物。

2.根据权利要求1所述的无患子皂苷提取物的发酵精制方法，其特征在于包括：向第一次发酵所得料液的上清液中接种酵母菌种子液，并加入浓度为80-100mg/mL的碳酸钙溶液，再进行第二次发酵。

3.根据权利要求1所述的无患子皂苷提取物的发酵精制方法，其特征在于包括：将乳酸菌接种于MRS培养基上，在温度为30-37℃的条件下培养2-3天，完成乳酸菌的活化，获得所述乳酸菌种子液。

4.根据权利要求3所述的无患子皂苷提取物的发酵精制方法，其特征在于，所述MRS培养基包含：蛋白胨8-10g/L，牛肉粉6-8g/L，酵母粉2-4g/L，葡萄糖18-20g/L，磷酸氢二钾1-2g/L，柠檬酸氢二铵1-2g/L，乙酸钠3-5g/L，硫酸镁0.1-0.2g/L，硫酸锰0.02-0.04g/L，吐温800.5-1g/L，以及蒸馏水；并且所述MRS培养基pH值为5.7±0.2。

5.根据权利要求1所述的无患子皂苷提取物的发酵精制方法，其特征在于包括：所述酵母菌接种于第一次发酵所得料液的2-4倍稀释液中，并于30-35℃静置活化15-30min，实现酵母菌的活化，之后将活化的酵母菌接种于第一次发酵所得料液的上清液，进行第二次发酵。

6.根据权利要求1所述的无患子皂苷提取物的发酵精制方法，其特征在于，所述的后处理包括：对经两次发酵所得料液过滤除渣，之后以8000-10000rpm的速度离心10-15min，再进行浓缩处理，获得所述无患子皂苷提取物。

7.根据权利要求1所述的无患子皂苷提取物的发酵精制方法，其特征在于，所述的后处理还包括：回收经两次发酵所得料液中的酒精。

8.根据权利要求1所述的无患子皂苷提取物的发酵精制方法，其特征在于：所述无患子皂苷提取物中皂苷纯度大于70wt％。

9.由权利要求1-8中任一项所述方法制备的无患子皂苷提取物。

10.权利要求9所述无患子皂苷提取物在制备青春痘相关病原菌抑制剂或药物中的应用。