CN103088101A - 一种提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法，根据无患子或皂荚水提液中含有较高浓度的纤维二糖和单糖，纤维二糖经酶水解，以水提酶水解液为底物，接种丘陵假丝酵母及铜绿假单胞菌，发酵生产槐糖脂和鼠李糖脂，得到天然表面活性剂与生物表面活性剂的复配产物，为制备天然皂素液体洗涤剂或其他液体产品提供可行高效的技术路线。

Description

一种提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法

技术领域

本发明涉及一种提取天然及生物表面活性剂复合产物的方法，属生物质化学化工领域。

背景技术

天然皂素，又称皂苷，能形成水溶液或胶体溶液并能形成肥皂状泡沫的植物糖苷统称，是由皂苷元和糖、糖醛酸或其他有机酸组成的，能有效降低水的表面张力，是一种天然、无毒、无污染的表面活性剂。

无患子（Sapindus mukurossi Gaertn.）又名木患子、油患子、苦患树、黄目树等，属无患子科（Sapindaceae），为落叶大乔木，高可达20余米，树皮灰褐色或黑褐色，主要分布于我国东部、南部至西南部。根和果入药，具有清热解毒、化痰止咳的功能。无患子果壳中含有约15～25%无患子皂素，已有研究表明，此种皂素是一种天然非离子表面活性剂，具有良好的起泡性能，其表面活性物质为三萜皂苷类和倍半萜糖苷类、脂肪油和蛋白质。能有效去除污垢，具有良好的清洁能力，并且在一些文献中报道无患子皂素具有抗菌、增白、祛斑、祛痘、防止皮肤病的药用功能，可以在各种护肤品中作为天然活性物质的主要成份。皂荚树具有根系发达，耐旱节水等优点，是营造农田防护林、水土保持林和城乡景观林的理想生态树种。皂荚荚果中含有20～35%的皂素。皂荚树的开发利用具有很高的经济效益，陕西、河南、河北、四川在原有野生皂荚林的基础上，积极发展人工皂荚林，目前种植面积超过300,000亩。

生物表面活性剂是微生物在一定条件下培养时，在其代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的代谢产物。微生物产生的生物表面活性剂包括许多不同的种类。依据他们的化学组成和微生物来源可分为糖脂、脂肽和脂蛋白、脂肪酸和磷脂、聚合物和全胞表面本身等五大类。与化学合成的表面活性剂相比,生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等相同作用外,还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、良好的选择性和专一性、能生物降解、生物相溶性好等优点。在食品工业、精细化工、医药和农业等工业方面越来越受到青睐。

铜绿假单胞菌和丘陵假丝酵母均是能够生产生物表面活性剂的菌种，且均可以利用葡萄糖为碳源，进行发酵，铜绿假单胞菌能够在一定条件下发酵，生产出鼠李糖脂，丘陵假丝酵母可以生产槐糖脂，具有较高的产量。除葡萄糖可以作为碳源外，油脂也可以作为碳源被菌种利用，加入一定量油脂会促进表面活性剂亲油基团的生成。

无患子或皂荚水提液中含有丰富的皂素和糖类物质，需要进一步分离精制，在进行真空蒸发浓缩处理时会产生大量的泡沫，导致操作单元难以连续进行；水提液直接作用液体洗涤剂或农药增效剂时，又由于水提液中含有丰富的糖类物质，导致产品稳定性差；水提液直接喷雾干燥制备成干粉所需能耗高，同时干粉中产品杂质含量高。

现有技术公开了对无患子进行提取得到皂素的技术方案，如本申请发明人曾经提出过如下申请：

中国申请CN102603855公开了一种无患子皂素的提取方法，包括的步骤有：1)对无患子果皮进行提取，得到无患子皂素提取液；2)采用氮气浮选法对无患子皂素提取液进行分离浓缩，得到无患子皂素浓缩液。所述方法提取时间短，效率高，不使用任何有机溶剂，用水量少；从空气中分离出的氮气既可有效保护产品皂素的质量，又不存在废气污染环境的问题。

中国申请CN102719491公开了一种无患子皂素提取物的发酵精制方法，包括步骤：将无患子提取物酶解糖化，然后用乳酸菌接种发酵。此外，还提供一种无患子皂素提取物的发酵精制产物。该申请根据无患子果皮提取物中含有较高浓度纤维二糖和甘露糖的特点，提出将无患子果皮提取物经过酶解糖化发酵，将其中的糖类物质和少量蛋白转化成乳酸，从而充分利用无患子果皮，获得无患子皂素和乳酸的复配产物，实现无患子果实的高值化利用。将无患子水提液中的糖、蛋白等干扰杂质直接转化为最终产品中的有效组分，制得的无患子精制液体产品质量稳定，纯度高，可用于制备液体洗涤剂或其他液体产品。

上述技术方案虽具有工艺过程简化、生产效率高等优点，但皂素水提液中的糖类物质未得到充分高效利用，同时天然皂素表面张力相对较高的缺点未得到有效克服。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法，根据无患子或皂荚水提液中含有较高浓度的纤维二糖和单糖，纤维二糖经酶水解，以水提酶水解液为底物，接种丘陵假丝酵母及铜绿假单胞菌，发酵生产槐糖脂和鼠李糖脂，得到天然表面活性剂与生物表面活性剂的复配产物，为制备天然皂素液体洗涤剂或其他液体产品提供可行高效的技术路线。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法，包括如下步骤：

（1）原料预处理：

风干无患子果皮和/或皂荚荚果作为皂素原料，经分拣、粉碎及过筛后，备用；

（2）皂素水浸提：

皂素原料与水以重量比1:3～1:8，在水浴温度50～70℃下浸提2～6h；离心，取上清液为酶解发酵底物；

（3）酶解水提液：

以pH调节剂将上清液pH值调至4.5～5.0；向其中加入浓度为420～480IU/L的纤维二糖酶，在40～50℃，150～200rpm的恒温震荡培养箱内酶解糖化90～120h；

（4）接种菌种；

将酶水解液作为发酵底物；同时加入灭菌发酵培养基；接种铜绿假单胞菌和/或丘陵假丝酵母，菌种接种量分别为2%～8%，优选5%；

（5）发酵培养：

接种后的发酵体系在28～32℃下，120～150rpm的恒温震荡培养箱发酵160～180h；

（6）离心分离：

以离心机分离发酵悬浮液中固液两相，液相即为天然皂素与生物表面活性剂的复合产物。

本发明所述的提取方法，优选所述步骤（1）为：风干无患子果皮和/或皂荚荚果作为皂素原料，经分拣去杂后控制水分≤12%，杂质≤0.5%；用粉碎机粉碎，过12目筛，备用。其中，为了方便预处理，优选单独以无患子果皮或皂荚荚果为皂素原料。

本发明所述的提取方法，优选所述步骤（2）中，皂素原料与水的最佳重量比1:5～1:7；水浴温度为60℃；浸提时间为3～5h。

采用上述提取方案，能够将皂素原料中的有效成分充分提取出来，纯度和收率都能实现最优化。但值得注意的是，本领域技术人员可以预见采用本发明所述浸提之外其他的提取方法也能够用于实现本发明，只是纯度和收率上有差别。

本发明所述的提取方法，优选所述的步骤（3）为：以pH调节剂将上清液pH值调至4.8；向其中加入浓度为450IU/L的纤维二糖酶，在45℃，180rpm的恒温震荡培养箱内水解糖化96h。在该过程中，能够将纤维二糖充分转化为葡萄糖，有益于后续通过发酵将糖类转化为鼠李糖脂和槐糖脂等。

与现有技术相比，本发明的核心在于提出了向上述酶水解液中接种铜绿假单胞菌或丘陵假丝酵母，通过酶解发酵过程，实现皂素水提液中的杂质（糖类等）转化为高效的生物表面活性剂。

具体地，本发明所述的提取方法，优选所述的步骤（4）为：将酶水解液pH值调至6.8～7.2，作为铜绿假单胞菌的发酵底物；同时加入灭菌发酵培养基A；接种铜绿假单胞菌，菌种接种量为2%～8%，优选5%。

其中，按重量百分比计，加入的灭菌发酵培养基A的组分为：

培养基A：NaNO₃g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，KH₂PO₄0.25g/L，酵母膏1.0g/L；

或所述的步骤（4）为：将酶水解液直接作为丘陵假丝酵母的发酵底物；同时加入灭菌发酵培养基B；接种丘陵假丝酵母，菌种接种量为2～8%，优选5%。

所述加入的灭菌发酵培养基B的组分为：

培养基B：KH₂PO₄0.1%，NaHPO₄·12H₂O0.1%，MgSO₄·7H₂O0.05%，酵母膏0.5%。

上述各组分重量百分比均是其自身重量与发酵体系的总体积的比值。

上述培养基有利于铜绿假单胞菌、丘陵假丝酵母的扩繁和生产生物表面活性剂的代谢过程。

所述的步骤（4）中，发酵底物中进一步加入相当于发酵底物重量4～6%的豆油，优选5%。

加入豆油能够进一步提高生物表面活性剂的生产效率，具有意料不到的技术效果。

本发明所述的提取方法，优选所述的步骤（5）为：将接种了铜绿假单胞菌或丘陵假丝酵母发酵体系于30℃下，120～130rpm的恒温震荡培养箱中发酵165～170h。

其中，优选铜绿假单胞菌发酵温度为30℃，丘陵假丝酵母温度为28℃，两组各自在120～130rpm的恒温震荡培养箱发酵165～170h。

本发明所述的提取方法，优选所述的步骤（6）为：以离心机分离发酵悬浮液中固液两相，液相即为天然皂素与生物表面活性剂的复合产物。具体的离心分离为本领域技术人员所掌握，本发明对此不作特别限定。

本发明的提取方法中，需要pH调节剂对pH值进行调节，本发明不对pH调节剂的本身作出限定，任意合适的能够起到调节pH作用的都可以用于实现本发明，如10%的NaOH溶液。

此外，作为本发明的一种最佳实施，所述的提取方法包括如下步骤：

（1）原料预处理：

风干无患子果皮和/或皂荚荚果作为皂素原料，经分拣去杂后控制水分≤12%，杂质≤0.5%；用粉碎机粉碎，过12目筛，备用；

（2）皂素水浸提：

皂素原料与水以重量比1:6，在水浴温度60℃下浸提5h；离心，取上清液为酶解发酵底物；

（3）酶解水提液：

以pH调节剂将上清液pH值调至4.8；向其中加入浓度为450IU/L的纤维二糖酶，在45℃，180rpm的恒温震荡培养箱内水解糖化96h；

（4）接种菌种；

将酶水解液pH值调至7.0，作为铜绿假单胞菌底物的发酵底物；同时加入A组灭菌发酵培养基；接种铜绿假单胞菌，菌种接种量为5%；培养基A：NaNO₃g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，KH₂PO₄0.25g/L，酵母膏1.0g/L；

或，将酶水解液直接作为丘陵假丝酵母底物的发酵底物；同时加入B组灭菌发酵培养基；接种丘陵假丝酵母，菌种接种量为5%；培养基B：KH₂PO₄0.1%，NaHPO₄·12H₂O0.1%，MgSO₄·7H₂O0.05%，酵母膏0.5%；

（5）发酵培养：

将接种了铜绿假单胞菌或丘陵假丝酵母发酵体系分别于30℃，和28℃下，在130rpm的恒温震荡培养箱发酵168h；

（6）离心分离：

以离心机分离发酵悬浮液中固液两相，液相即为天然皂素与生物表面活性剂的复合产物。

采用上述技术方案，本发明提供的天然皂素水提液发酵制生物表面活性剂的方法具有如下优点：

（1）根据皂素水提液中含有较高浓度纤维二糖和单糖的特点，提出将皂素水提液经过酶解，再通过发酵将糖类转化为鼠李糖脂和槐糖脂，充分利用天然皂素原料，获得天然皂素和糖脂的复合产物，实现无患子果实或皂荚荚果的高值化利用。

（2）由于天然皂素、鼠李糖脂和槐糖脂均是生物相容性表面活性剂，而且均可以添加到日化产品中，作为护肤洗涤用品，此耦合生产复合产品较单独生产单一物质工艺简化，产品得率高，原料高效利用。

（3）用天然水提皂素溶液发酵生产鼠李糖脂和槐糖脂与传统的皂素精制分离工艺相比，具有反应条件温和、副反应小、原料利用率高等特点，并且一步反应可以同时纯化皂素和制备鼠李糖脂、槐糖脂生物表面活性剂，反应与分离精制耦合，生产效率高。

（4）该精制工艺省去了蒸发或干燥单元，能量消耗大大降低。

（5）天然皂素精制水提液中不含糖类物质，含两种表面活性剂，产品质量稳定，纯度高，可用于制备液体洗涤剂或其他液体产品。

（6）将天然水提液中的有害杂质直接转化为最终产品中的有效组分，集产品精制与反应一体，工艺独创。

附图说明

图1为本发明提取工艺流程图；

图2为铜绿假单胞菌接种量对发酵体系中葡萄糖浓度的影响随发酵时间变化的示意图；

图3为铜绿假单胞菌接种量对发酵体系中溶液表面张力的影响随发酵时间变化的示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

如图1所示，本发明所述提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法具体流程如下：

将风干的无患子果皮去杂除铁，电动粉碎机粉碎果皮，过12目筛，在60℃，150转的恒温摇床中振荡提取皂素，其中，原料与水的重量比为1:6，提取时间为5h。将提取液置于在转速为3000rpm的离心机中，离心15min，收集上层清液，即为无患子水提液。

用10%的NaOH溶液，滴加1～2滴调节溶液pH值为4.8。向溶液加入450IU纤维二糖酶/L，45℃，180rpm的全温震荡培养箱中进行糖化水解96h。

以酶水解液作为发酵底物，30%NaOH溶液调节溶液pH值为7.0。将溶液分成4份，编号1，2，3，4。1号为空白组，不接发酵菌种，不加培养基，加入无菌水，补充体积其他组分相同。2、3、4号组分别接入2%、5%和8%的铜绿假单胞菌，加入相同体积的发酵培养基A（组成：培养基A：NaNO₃g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，KH₂PO₄0.25g/L，酵母膏1.0g/L），上述发酵底物分别在30℃，130rpm的恒温震荡培养箱发酵168h。用高效液相色谱检测发酵液中糖浓度，浓硫酸-香草醛法检测发酵液中表面活性物质浓度，吊片法测溶液表面张力。1号组最终发酵液pH值为7.04，表面活性剂物质为40.5g/L，溶液表面张力为59.575mN/m，葡萄糖浓度高达14g/L；2号组最终发酵液pH值为7.60，表面活性剂物质为48.32g/L，溶液表面张力为56.678mN/m；3号组最终发酵液pH值为6.78，表面活性剂物质为48.83g/L，溶液表面张力为55.124mN/m；4号组最终发酵液pH值为6.96，表面活性剂物质为49.44g/L，溶液表面张力为55.135mN/m。溶液中均无葡萄糖剩余。结果表明，本发明所述的提取方法能够得到理想的天然皂素及生物表面活性剂复合产物。具体发酵体系中葡萄糖浓度随发酵时间的变化如图1，发酵体系中溶液表面张力随发酵时间的变化如图2。

实施例2

如图1所示，本发明所述提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法具体流程如下：

将风干的皂荚荚果去杂除铁，电动粉碎机粉碎果皮，过12目筛，在60℃，150转的恒温摇床中振荡提取皂素，其中，原料与水的重量比为1:8，提取时间为5h。将提取液置于在转速为3000rpm的离心机中，离心15min，收集上层清液，即为皂荚水提液。

用10%的NaOH溶液，滴加1～2滴调节溶液pH值为4.8。向溶液加入450IU纤维二糖酶/L，45℃，180rpm的全温震荡培养箱中进行糖化水解96h。

以酶水解液作为发酵底物，将溶液分成4份，编号1，2，3，4。1号为空白组，不接发酵菌种，不加培养基，加入无菌水，补充体积其他组分相同。2、3、4号组分别接入2%、5%和8%的丘陵假丝酵母，加入相同体积的发酵培养基B（组成：培养基B：KH₂PO₄0.1%，NaHPO₄·12H₂O0.1%，MgSO₄·7H₂O0.05%，酵母膏0.5%）。上述发酵底物分别在28℃，130rpm的恒温震荡培养箱发酵168h。用高效液相色谱检测发酵液中糖浓度，浓硫酸-香草醛法检测发酵液中表面活性物质浓度，吊片法测溶液表面张力。1号组最终发酵液pH值为4.85，表面活性剂物质为40.5g/L，溶液表面张力为59.575mN/m；2号组最终发酵液pH值为4.8，表面活性剂物质为48.94g/L，溶液表面张力为56mN/m；3号组最终发酵液pH值为4.6，表面活性剂物质为50.5g/L，溶液表面张力为56.112mN/m；4号组最终发酵液pH值为4.6，表面活性剂物质为50.0g/L，溶液表面张力为56.17mN/m。溶液中均无葡萄糖剩余。结果表明，本发明所述的提取方法能够得到理想的天然皂素及生物表面活性剂复合产物。具体发酵体系中葡萄糖浓度随发酵时间的变化和发酵体系中溶液表面张力随发酵时间的变化具有与图1和图2相同的规律。

实施例3

如图1所示，本发明所述提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法具体流程如下：

将风干的无患子果皮去杂除铁，电动粉碎机粉碎果皮，过20目筛，在60℃，150转的恒温摇床中振荡提取皂素，其中，原料与水的重量比为1:2，提取时间为4h。将提取液置于在转速为3000rpm的离心机中，离心15min，收集上层清液，即为无患子水提液。

用10%的NaOH溶液，滴加1～2滴调节溶液pH值为4.8。向溶液加入450IU纤维二糖酶/L，45℃，180rpm的全温震荡培养箱中进行糖化水解96h。

以酶水解液作为发酵底物，30%NaOH溶液调节溶液pH值为7.0。将溶液分成3份，编号1，2，3。1号为空白组，不接发酵菌种，不加培养基，加入无菌水，补充体积其他组分相同。2、3号组分分别接入5%的铜绿假单胞菌，加入相同体积的发酵培养基A。3号加入5%豆油。30℃，130rpm的全温震荡培养箱发酵168h。用高效液相色谱检测发酵液中糖浓度，浓硫酸-香草醛法检测发酵液中表面活性物质浓度，吊片法测溶液表面张力。1号组最终发酵液pH值为7.04，表面活性剂物质为42.6g/L，溶液表面张力为57.472mN/m；2号组最终发酵液pH值为6.78，表面活性剂物质为48.83g/L，溶液表面张力为55.124mN/m；3号组最终发酵液pH值为6.70，表面活性剂物质为50.8g/L，溶液表面张力为54.7405mN/m。溶液中均无葡萄糖剩余。结果表明，本发明所述的提取方法能够得到理想的天然皂素及生物表面活性剂复合产物。具体发酵体系中葡萄糖浓度随发酵时间的变化和发酵体系中溶液表面张力随发酵时间的变化具有与图1和图2相同的规律。

实施例4

如图1所示，本发明所述提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法具体流程如下：

将风干的皂荚荚果去杂除铁，粉碎机粉碎果皮，过12目筛，在60℃，150转的恒温摇床中振荡提取皂素，其中，原料与水的重量比为1:7，提取时间为2h。将提取液置于在转速为3000rpm的离心机中，离心15min，收集上层清液，即为皂荚皂素水提液。

用10%的NaOH溶液，滴加1～2滴调节溶液pH值为4.8。向溶液加入450IU纤维二糖酶/L，45℃，180rpm的全温震荡培养箱中进行糖化水解96h。

以酶水解液作为发酵底物，将溶液分成4份，编号1，2，3。1号为空白组，不接发酵菌种，不加培养基，加入无菌水，补充体积其他组分相同。2、3号组分别接入5%丘陵假丝酵母，加入相同体积的发酵培养基B。3号加入5%的豆油。上述发酵底物分别在28℃，130rpm的全温震荡培养箱发酵168h。用高效液相色谱检测发酵液中糖浓度，浓硫酸-香草醛法检测发酵液中表面活性物质浓度，吊片法测溶液表面张力。1号组最终发酵液pH值为4.85，表面活性剂物质为42.6g/L，溶液表面张力为57.366mN/m；2号组最终发酵液pH值为4.6，表面活性剂物质为50.4g/L，溶液表面张力为56.112mN/m；3号组最终发酵液pH值为4.01，表面活性剂物质为52.48g/L，溶液表面张力为55.399mN/m；溶液中均无葡萄糖剩余。

实施例5

如图1所示，本发明所述提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法具体流程如下：

将风干的皂荚荚果和无患子果皮按1:1混合，去杂除铁，粉碎机粉碎果皮，过12目筛，在60℃，150转的恒温摇床中振荡提取皂素，其中，原料与水的重量比为1:5，提取时间为3h。将提取液置于在转速为3000rpm的离心机中，离心15min，收集上层清液，即得水提液。

用10%的NaOH溶液，滴加1～2滴调节溶液pH值为5.0。向溶液加入480IU纤维二糖酶/L，45℃，200rpm的全温震荡培养箱中进行糖化水解120h。

以酶水解液作为发酵底物，接种5%的丘陵假丝酵母，同时加入发酵培养基B及5%豆油（组成：培养基B：KH₂PO₄0.1%，NaHPO₄·12H₂O0.1%，MgSO₄·7H₂O0.05%，酵母膏0.5%）。上述发酵底物在28℃，120rpm的全温震荡培养箱发酵170h。用高效液相色谱检测发酵液中糖浓度，浓硫酸-香草醛法检测发酵液中表面活性物质浓度，吊片法测溶液表面张力。最终发酵液pH值为4.05，表面活性剂物质为49.65g/L，溶液表面张力为55.24mN/m；溶液中无葡萄糖剩余。

实施例6

如图1所示，本发明所述提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法具体流程如下：

将风干的皂荚荚果和无患子果皮按1:2混合，去杂除铁，粉碎机粉碎果皮，过12目筛，在60℃，150转的恒温摇床中振荡提取皂素，其中，原料与水的重量比为1:6，提取时间为4h。将提取液置于在转速为3000rpm的离心机中，离心15min，收集上层清液，即得水提液。

用10%的NaOH溶液，滴加1～2滴调节溶液pH值为4.8。向溶液加入420IU纤维二糖酶/L，40℃，180rpm的全温震荡培养箱中进行糖化水解100h。

以酶水解液作为发酵底物，30%NaOH溶液调节溶液pH值为7.2。接种5%的铜绿假单胞菌，同时加入发酵培养基A及5%豆油（组成：培养基A：NaNO₃g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，KH₂PO₄0.25g/L，酵母膏1.0g/L），上述发酵底物在30℃，130rpm的全温震荡培养箱发酵165h。用高效液相色谱检测发酵液中糖浓度，浓硫酸-香草醛法检测发酵液中表面活性物质浓度，吊片法测溶液表面张力。最终发酵液pH值为6.65，表面活性剂物质为50.3g/L，溶液表面张力为54.12mN/m；溶液中无葡萄糖剩余。

实施例7

如图1所示，本发明所述提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法具体流程如下：

将风干的皂荚荚果，去杂除铁，粉碎机粉碎果皮，过12目筛，在60℃，150转的恒温摇床中振荡提取皂素，其中，原料与水的重量比为1:7，提取时间为5h。将提取液置于在转速为3000rpm的离心机中，离心15min，收集上层清液，即得水提液。

用10%的NaOH溶液，滴加1～2滴调节溶液pH值为4.5。向溶液加入420IU纤维二糖酶/L，50℃，150rpm的全温震荡培养箱中进行糖化水解90h。

以酶水解液作为发酵底物，接种5%的丘陵假丝酵母，同时加入发酵培养基B及5%豆油（组成：培养基B：KH₂PO₄0.1%，NaHPO₄·12H₂O0.1%，MgSO₄·7H₂O0.05%，酵母膏0.5%），上述发酵底物在32℃，150rpm的全温震荡培养箱发酵180h。用高效液相色谱检测发酵液中糖浓度，浓硫酸-香草醛法检测发酵液中表面活性物质浓度，吊片法测溶液表面张力。最终发酵液pH值为4.07，表面活性剂物质为52.75g/L，溶液表面张力为55.62mN/m；溶液中无葡萄糖剩余。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种提取天然皂素及生物表面活性剂复合产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）原料预处理：

风干无患子果皮和/或皂荚荚果作为皂素原料，经分拣、粉碎及过筛后，备用；

（2）皂素水浸提：

皂素原料与水以重量比1:3～1:8，在水浴温度50～70℃下浸提2～6h；离心，取上清液为酶解发酵底物；

（3）酶解水提液：

以pH调节剂将上清液pH值调至4.5～5.0；向其中加入浓度为420～480IU/L的纤维二糖酶，在40～50℃，150～200rpm的恒温震荡培养箱内水解糖化90～120h；

（4）接种菌种；

将酶水解液作为发酵底物；同时加入灭菌发酵培养基；接种铜绿假单胞菌和/或丘陵假丝酵母，菌种接种量分别为2%～8%；

（5）发酵培养：

接种后的发酵体系在28～32℃下，120～150rpm的恒温震荡培养箱发酵160～180h；

（6）离心分离：

以离心机分离发酵悬浮液中固液两相，液相即为天然皂素与生物表面活性剂的复合产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）为：风干无患子果皮和/或皂荚荚果作为皂素原料，经分拣去杂后控制水分≤12%，杂质≤0.5%；用粉碎机粉碎，过12目筛，备用。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，皂素原料与水的最佳重量比1:5～1:7；水浴温度为60℃；浸提时间为3～5h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（3）为：以pH调节剂将上清液pH值调至4.8；向其中加入浓度为450IU/L的纤维二糖酶，在45℃，180rpm的恒温震荡培养箱内水解糖化96h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（4）为：将酶水解液pH值调至6.8～7.2，作为铜绿假单胞菌的发酵底物；同时加入灭菌发酵培养基A；接种铜绿假单胞菌，菌种接种量为2%～8%。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述灭菌发酵培养基A，按重量百分比计，具体组分为：

培养基A：NaNO₃g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，KH₂PO₄0.25g/L，酵母膏1.0g/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（4）为：将酶水解液直接作为丘陵假丝酵母的发酵底物；同时加入灭菌发酵培养基B；接种丘陵假丝酵母，菌种接种量为2～8%。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述灭菌发酵培养基B，按重量百分比计，具体组分为：

培养基B：KH₂PO₄0.1%，NaHPO₄·12H₂O0.1%，MgSO₄·7H₂O0.05%，酵母膏0.5%。

9.根据权利要求5或7所述的方法，其特征在于，所述的步骤（4）中，发酵底物中进一步加入相当于发酵底物重量4～6%的豆油，优选5%。

10.根据权利要求5或7所述的方法，其特征在于，所述的步骤（5）为：将接种了铜绿假单胞菌或丘陵假丝酵母发酵体系于30℃下，120～130rpm的恒温震荡培养箱中发酵165～170h。

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