CN106190987B - 一种基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法 - Google Patents

一种基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，所述方法为：将含有诺如病毒的待测污染水样与氨基化硅胶混合，在pH值为5～10的条件下，于20‑30℃下振荡孵育2小时，孵育结束后，离心，沉淀用BGT洗脱液浸泡15‑30min，浸泡期间每隔45s用20‑25KHz超声波处理5min，离心，取上清即为污染水样中的诺如病毒浓缩液；本发明是未氨基化的原硅胶浓缩效率的7‑8倍；同时也显著高于3‑氨丙基三乙氧基硅烷氨基硅胶(60.65～65.91％)和N‑氨乙基‑γ‑氨丙基三甲氧基硅烷氨基硅胶(72.65～85.76％)的浓缩效率。

Description

一种基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种诺如病毒的富集检测方法，特别涉及一种基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法。
(二)背景技术
诺如病毒(NoV)属于杯状病毒，是无包膜单股正链RNA病毒，基因组大小为7624个碱基，包括3个开放阅读框(ORF1、ORF2和ORF3)。根据NoV的全部衣壳基因序列，病毒可分为5个基因组(GI～GV)；目前，已知29种基因型。其中，引起人感染的NoV主要是G I基因组中的8种基因型和G II基因组中的17种基因型。通过突变和重组，诺如病毒的基因组进行着快速的变异，表现出基因的多样化，从而导致新突变株的产生以及急性胃肠炎疾病的大暴发。NoV的感染性强，甚至少于102拷贝数/mL的NoV颗粒都能导致感染。并且，NoV对环境具有较强的耐受性，在酸性(pH 2.7)条件下、加热(60℃)条件及自来水中游离氯(3.75～6.25mg/L)浓度条件下，仍具感染性，预防手段十分有限
诺如病毒(Norovirus,NoV)是世界范围内引起人类急性胃肠炎的最常见病原微生物之一，流行地区极为广泛，全年均有流行，感染对象主要为成人和学龄儿童，常分布在医院、餐馆、学校、养老院、家庭等。该病毒主要传播途径为主要通过粪-口途径传播，人感染了诺如病毒通常是由于饮用受污染的水、食品及生活接触，其中饮用受污染的水是重要途径之一。对水中NoV的准确检测能为诺如病毒胃肠炎防控提供科学依据。
水体中诺如病毒检测的难点在于含量太低、干扰测定的基本成份复杂，给准确测定造成了很大的困难。大部分水体需先通过水样中病毒的浓缩，才能进行检测，但水中不必要的污染物也因此被浓缩吸附，从而干扰试验结果。如通常使用絮凝沉淀法对水样进行浓缩，但其残留的有机物质可能会对PCR结果造成影响。另外传统的病毒浓缩方法，如细胞培养病毒鉴定，在操作上比较耗时，在技术成本的花费上比较昂贵，而且病毒很难在体外环境下进行培养。因此开发病毒的检测新技术，研究病毒的环境行为和风险评估已引起国际研究界广泛关注。
由于硅胶具有良好的化学稳定性、热稳定性以及良好的机械强度，在催化、离子交换、金属富集和色谱技术中应用很多。利用硅胶表面含有大量的活性硅羟基，用乙醇胺、二乙醇胺、乙二胺、二乙烯三胺和三乙烯四胺等胺类化合物进行表面化学键合或改性，可获得吸附性较好的改性硅胶产品。对合成的氨基化硅胶材料及其吸附性能的研究一直是人们关注的热点。目前氨基化硅胶已经广泛应用于生物医药、电化学、污水处理及杀菌剂等。本发明主要通过对一类氨基化硅胶病毒吸附特性的研究，开发一种快速、经济和高效的氨基化硅胶吸附富集诺如病毒的方法。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种操作简便、省时高效的水体中诺如病毒的富集方法，它以水体中的诺如病毒为对象，采用氨基化硅胶吸附，又在超声波辅助作用下经特定洗脱液洗脱分离，实现水体中诺如病毒的富集浓缩及检测。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种基于氨基化硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，所述方法为：将含有诺如病毒的待测污染水样与氨基化硅胶混合，在pH值为5～10的条件下，于20-30℃下振荡孵育2小时，使氨基化硅胶与病毒颗粒充分接触，孵育结束后，将氨基化硅胶悬浊液(即混合液)离心，取吸附有病毒颗粒的氨基化硅胶沉淀用少量BGT洗脱液浸泡15-30min，浸泡期间每隔30-45s用20-25KHz超声波处理(即超声波振荡辅助洗脱)5min，超声处理结束后，离心，取上清即为污染水样中的诺如病毒浓缩液，检测浓缩液中诺如病毒含量，根据浓缩倍数，获得待测污染水样中诺如病毒含量；所述氨基化硅胶是由胺类化合物与硅胶混合，采用物理包裹法制备而成，所述胺类化合物为下列之一：聚乙烯亚胺、3-氨丙基三乙氧基硅烷和N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷；所述BGT洗脱液质量组成为：2.5％牛肉浸膏，0.05％吐温80，溶剂为0.25M甘氨酸水溶液，pH 3.5。
进一步，所述含有诺如病毒的待测污染水样中病毒含量为4.39×101～4.39×1010拷贝/mL，含有诺如病毒的待测污染水样体积加入量以氨基化硅胶质量计为10ml/g。
进一步，所述胺类化合物为聚乙烯亚胺，分子量(600、1800、10000)，优选分子量为600。
进一步，所述BGT洗脱液体积用量以混合液离心获得的沉淀质量计为1.5-3ml/g。
进一步，所述硅胶粒径40-75μm，中性pH，比表面积480m2/g。
进一步，所述氨基化硅胶按如下方法制备：将活化后的硅胶与0.01-2mg/ml胺类化合物的有机溶剂溶液混合，在20-60℃下振荡培养，离心，取沉淀用溶剂洗涤之后，烘干，获得氨基化硅胶；所述有机溶剂为甲醇或甲苯，所述溶剂为0.5mol/L H2SO4水溶液、去离子水、1mol/L氨水、甲苯、丙酮或甲醇；所述胺类化合物的有机溶剂溶液体积用量以活化后硅胶质量计为10ml/g。
更进一步，所述氨基化硅胶按如下方法之一制备：(1)将硅胶加入1mol/L硝酸双蒸水溶液，加热至微沸状态，持续搅拌4小时，反应结束后，产物依次用蒸馏水和甲醇洗涤洗至中性，然后在110℃真空干燥，获得活化后的硅胶；取活化后的硅胶加入到0.5-2mg/mL聚乙烯亚胺的甲醇溶液中混匀后，60℃温度下，持续震荡20小时，4000×g离心1min，弃上清，沉淀依次用0.5mol/L H2SO4水溶液、去离子水抽滤和1mol/L氨水浸泡5min后离心去上清，沉淀于80℃30min烘干，获得聚乙烯亚胺硅胶；所述聚乙烯亚胺的甲醇溶液体积用量以活化后硅胶质量计为10ml/g；(2)将硅胶放入马弗炉内，150℃干燥过夜，获得活化后的硅胶；将活化后的硅胶加入到0.02-0.03mg/mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯混合液中混匀后，56℃温度下，持续震荡20小时，4000×g离心1min，弃上清，沉淀依次用甲苯、丙酮和甲醇洗涤，之后于105℃，5h烘干，获得3-氨丙基三乙氧基硅烷-硅胶；3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯混合液体积用量以活化后硅胶质量计为10ml/g；(3)将硅胶放入马弗炉内，150℃干燥过夜，获得活化后的硅胶；将活化后的硅胶加入到0.01-0.05mg/mL N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷的甲苯混合液中混匀后，26℃温度下，持续震荡12小时，4000×g离心1min，弃上清，沉淀依次用甲苯、丙酮和甲醇洗涤之后于105℃，5h烘干，获得N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷-硅胶；N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷的甲苯混合液体积用量以活化后硅胶质量计为10ml/g。
本发明重点是针对待测水样中诺如病毒含量低，提供一种浓缩污染水样中诺如病毒的方法，至于浓缩液中诺如病毒含量的检测可以采用本领域公知的方法进行，比如荧光定量PCR方法。具体所述浓缩液中诺如病毒含量检测方法为：采用QIAamp Viral RNA MiniKit试剂盒(购自德国凯捷公司)提取浓缩液中的诺如病毒RNA，具体步骤按照其说明书进行，提取完毕的病毒RNA于-20℃保存备用。
反转录-荧光定量PCR检测：采用One Step PrimescriptTM RT-PCR Kit进行RT-PCR扩增。扩增体系(25μL):2×buffer 12.5μL，逆转录酶和Taq酶各0.5μL，上、下游引物(20μmol/L)各0.6μL，探针(20μmol/L)0.3μL，RNA模板5μL，ddH2O 5μL。扩增条件:42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，55℃退火、延伸35s，39个循环。
绘制标准曲线：取上述NoV GII特异性PCR产物，纯化后与质粒相连，构建含有NoVGII特异性片段的重组质粒。将构建的重组质粒用蒸馏水或TE缓冲液按体积比1:10梯度稀释后，分别以各个稀释浓度作为反转录-荧光定量PCR检测模板，通过重组质粒的分子量和待测核酸总量判断病毒的拷贝数，并根据病毒原液各个稀释浓度与其对应的拷贝数之间的关系建立标准曲线(图1)。
计算诺如病毒换算公式及浓缩效率如下
Y＝-0.3288X+12.264 (1)
本发明诺如病毒污染水样中病毒含量的初步计算，推算公式如下：
Figure BDA0001041205040000042
公式(1)中Y表示病毒的数量(拷贝/μL)；X表示荧光定量PCR检测中的Ct值。公式(2)为浓缩效率计算公式。
所述的氨基化硅胶富集诺如病毒，当1g活化硅胶与10mL、1mg/mL聚乙烯亚胺的甲醇溶液作用，获得氨基化硅胶后，其中1g氨基化硅胶富集10-40mL浓度4.39×103～4.39×107拷贝/mL诺如病毒水样时，在pH值为7～9的条件下，其富集效率可达到较为稳定的81.23～87.53％之间。
所述的1g活化硅胶与10mL、0.025mg/mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液作用获得氨基化硅胶后，其中1g氨基化硅胶富集10-40mL浓度4.39×103～4.39×107拷贝/mL诺如病毒水样时，在pH值为7～9的条件下，其富集效率可达到较为稳定的60.65～65.91％之间。
所述的1g活化硅胶与10mL、0.03mg/mL N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液作用获得氨基化硅胶后，其中1g氨基化硅胶富集10-40mL浓度4.39×103～4.39×107拷贝/mL诺如病毒水样时，在pH值为6～9的条件下，其富集效率可达到较为稳定的72.65～85.76％之间。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
1.本发明浓缩病毒操作简单易行，适用于实验室和现场作业。
2.采用了氨基化硅胶富集病毒的技术，氨基化硅胶富集病毒可有效减少病毒富集浓缩时的PCR抑制剂，突出操作简便、分离速度快、可重复性好、成本低和不需要大型昂贵仪器适合现场操作等优点。
3.使用超声波辅助BGT洗脱液洗脱氨基化硅胶表面的病毒，有助于病毒的洗脱效率的提高。
4.有效的缩短了常规方法中诺如病毒的检测时间和成本。
5.本发明中聚乙烯亚胺硅胶有较好的富集诺如病毒的能力，表现为1g氨基化硅胶富集10-40mL浓度4.39×103～4.39×107拷贝/mL诺如病毒水样时，在pH值为7～9的条件下，其浓缩效率可达到较为稳定的81.23～87.53％之间。是未氨基化的原硅胶浓缩效率的7-8倍；同时也显著高于3-氨丙基三乙氧基硅烷氨基硅胶(60.65～65.91％)和N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷氨基硅胶(72.65～85.76％)的浓缩效率。
(四)附图说明
图1诺如病毒的荧光定量PCR的Ct值与诺如病毒相应拷贝数的标准曲线。
图2pH值对氨基化硅胶病毒吸附率的影响。
图3氨基化硅胶病毒富集能力。
图4氨基化硅胶病毒浓缩示意图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明采用上海阿拉丁生化科技股份有限公司的硅胶，粒径40-75μm，中性pH，比表面积480m2/g。氨基材料采用上海阿拉丁生化科技股份有限公司的胺类化合物包括聚乙烯亚胺(分子量600)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(分子量221.37)和N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(分子量222.36)。
本发明实施例所述BGT洗脱液质量组成为：2.5％牛肉浸膏、0.05％吐温80、溶剂为0.25M甘氨酸水溶液，pH 3.5。
实施例1、聚乙烯亚胺硅胶材料富集水体中诺如病毒的效率
(1)聚乙烯亚胺硅胶材料的制备
硅胶活化：将10g硅胶移至三角烧瓶中，加入50ml、1mol/L的硝酸的双蒸水溶液，加热至微沸状态，持续搅拌4小时，反应结束后，产物依次用蒸馏水和甲醇洗涤至中性，然后在110℃真空干燥，即制备出活化硅胶10g。
物理包裹：称取1g活化后的硅胶加入到10mL聚乙烯亚胺的甲醇溶液(1.0mg/mL)中混匀后，60℃温度下，持续震荡20小时，4000×g离心1min，弃上清，沉淀依次用0.5mol/LH2SO4水溶液、去离子水抽滤和1mol/L氨水浸泡5min后离心去上清，之后沉淀于80℃烘干30min，获得聚乙烯亚胺硅胶1g。
(2)pH值对聚乙烯亚胺硅胶富集诺如病毒影响(图2)
将1g制备的聚乙烯亚胺硅胶加入到10mL诺如病毒浓度为4.39×107(拷贝/mL)的水样中，分别在不同pH值(pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10)的条件下，于室温下孵育2小时，4000×g离心1min。使上清与沉淀分离，沉淀转入新的EP管中，按照步骤(4)和(5)进行分析，以未氨基化的原硅胶为对照，结果见图2。
(3)病毒浓度对聚乙烯亚胺硅胶富集诺如病毒影响(图3)
取浓度为4.39×1010拷贝/mL的诺如病毒水样，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8的方式依次用蒸馏水递减稀释。取8份步骤(1)制备的聚乙烯亚氨硅胶，每份1g，分别加入到10mL不同浓度(4.39×1010、4.39×109、4.39×108、4.39×107、4.39×106、4.39×105、4.39×104、4.39×103、4.39×102和4.39×101拷贝/mL)的诺如病毒水样中，分别在pH值为7的条件下，于室温下孵育2小时，4000×g离心1min。使上清与沉淀分离，沉淀转入新的EP管中，按照步骤(4)和(5)进行分析，以未氨基化的原硅胶为对照，结果见图3。
(4)聚乙烯亚胺硅胶中病毒的洗脱
向步骤(2)、(3)的沉淀1g中分别加入1.5mL BGT洗脱液，浸泡20min，期间每隔30-45s用超声波(20-25KHz)振荡5min。超声结束后，4000×g离心1min，收集上清。
(5)定量测定诺如病毒的富集效率
提取诺如病毒RNA：采用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒(购自德国凯捷公司)提取步骤(4)上清中的诺如病毒RNA，具体步骤按照其说明书进行，提取完毕的病毒RNA于-20℃保存备用。
反转录-荧光定量PCR检测：采用One Step PrimescriptTM RT-PCR Kit进行RT-PCR扩增。扩增体系(25μL):2×buffer 12.5μL，逆转录酶和Taq酶各0.5μL，上、下游引物(20μmol/L)各0.6μL，探针(20μmol/L)0.3μL，RNA模板5μL，ddH2O 5μL。扩增条件:42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，55℃退火、延伸35s，39个循环。
绘制标准曲线：取上述NoV GII特异性PCR产物，纯化后与质粒相连，构建含有NoVGII特异性片段的重组质粒。将构建的重组质粒用蒸馏水或TE缓冲液按体积比1:10梯度稀释后，分别以各个稀释浓度作为反转录-荧光定量PCR检测模板，通过重组质粒的分子量和待测核酸总量判断病毒的拷贝数，并根据病毒原液各个稀释浓度与其对应的拷贝数之间的关系建立标准曲线(图1)。
计算诺如病毒换算公式及浓缩效率如下
Y＝-0.3288X+12.264 (1)
Figure BDA0001041205040000071
公式(1)中Y表示病毒的数量(拷贝/L)；X表示荧光定量PCR检测中的Ct值。公式(2)为浓缩效率计算公式。
本发明诺如病毒污染水样中病毒含量的初步计算，推算公式如下：
Figure BDA0001041205040000072
表1 运用聚乙烯亚胺硅胶检测污染水样中诺如病毒含量
Figure BDA0001041205040000073
a检出值(拷贝/mL)＝(浓缩值(拷贝/mL)×浓缩体积)/(原始污染水样体积(mL))
表2 诺如病毒NoV GII特异性引物和探针
Figure BDA0001041205040000074
(6)聚乙烯亚胺硅胶吸附病毒能力
结果表明：当1g活化硅胶与10mL、1mg/mL聚乙烯亚胺的甲醇溶液作用，可获得氨基化硅胶；氨基化硅胶与诺如病毒的吸附效果受到病毒溶液酸碱度的影响，当pH值在2-6时，吸附效果不稳定，且较小。而pH值在7-9时，吸附效果较好(图2)。同时，氨基化硅胶吸附病毒能力的研究表明，诺如病毒的浓度对氨基化硅胶的富集效果也有影响。图2的结果表明在pH值为7～9的条件下，1g氨基化硅胶富集10mL浓度4.39×103～4.39×107拷贝/mL诺如病毒水样时，其富集效率可达到较为稳定的81.23～87.53％之间。
实施例2、3-氨丙基三乙氧基硅烷-硅胶材料富集水体中诺如病毒的效率
(1)3-氨丙基三乙氧基硅烷-硅胶材料的制备
将硅胶放入马弗炉内，150℃干燥过夜。将1g干燥后的硅胶加入到10mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯混合液(0.03mg/mL)中混匀后，56℃温度下，持续震荡20小时，4000×g离心1min，弃上清，沉淀依次用甲苯、丙酮和甲醇洗涤之后于105℃，5h烘干，获得3-氨丙基三乙氧基硅烷-硅胶1g。
(2)pH值对3-氨丙基三乙氧基硅烷-硅胶富集诺如病毒影响(图2)
将1g步骤(1)制备的3-氨丙基三乙氧基硅烷-硅胶加入到10mL诺如病毒浓度为4.39×107(拷贝/mL)的水样中，分别在不同pH值(pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10)的条件下，于室温下孵育2小时，4000×g离心1min。使上清与沉淀分离，沉淀转入新的EP管中，按照步骤(4)和(5)进行分析，以未氨基化的原硅胶为对照，结果见图2。
(3)病毒浓度对3-氨丙基三乙氧基硅烷-硅胶富集诺如病毒影响(图3)
取浓度为4.39×1010拷贝/mL的诺如病毒水样，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8的方式依次用蒸馏水递减稀释。取8份步骤(1)制备的3-氨丙基三乙氧基硅烷-硅胶，每份1g，分别加入到10mL不同浓度(4.39×1010、4.39×109、4.39×108、4.39×107、4.39×106、4.39×105、4.39×104、4.39×103、4.39×102和4.39×101拷贝/mL)的诺如病毒水样中，分别在pH值为7的条件下，于室温下孵育2小时，4000×g离心1min。使上清与沉淀分离，沉淀1g转入新的EP管中，按照步骤(4)和(5)进行分析，以未氨基化的原硅胶为对照，结果见图3。
(4)3-氨丙基三乙氧基硅烷-硅胶中病毒的洗脱
分别向步骤(2)和(3)的EP管中加入1.5mL BGT洗脱液，浸泡吸附有病毒的氨基化硅胶沉淀30min，期间每隔30-45s用超声波(20-25KHz)超声处理5min。超声处理结束后，4000×g离心1min，收集上清。
(5)定量测定诺如病毒的富集效率
测定方法同实施例1。
(6)3-氨丙基三乙氧基硅烷-硅胶吸附病毒能力
结果表明：当1g活化硅胶与10mL、0.025mg/mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲醇溶液作用，可获得氨基化硅胶；氨基化硅胶与诺如病毒的吸附效果受到病毒溶液酸碱度的影响，当pH值在2-6时，吸附效果不稳定，且较小。而pH值在7-9时，吸附效果较好(图2)。同时，氨基化硅胶吸附病毒能力的研究表明，诺如病毒的浓度对氨基化硅胶的富集效果也有影响。图2的结果表明在pH值为7～9的条件下，1g氨基化硅胶富集10mL浓度4.39×103～4.39×107拷贝/mL诺如病毒水样时，其富集效率可达到较为稳定的60.65～65.91％之间。
实施例3、N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷-硅胶材料富集水体中诺如病毒的效率
(1)N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷-硅胶材料的制备
将硅胶放入马弗炉内，150℃干燥过夜。将1g干燥后的硅胶加入到10mL N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷的甲苯混合液(0.04mg/mL)中混匀后，26℃温度下，持续震荡12小时，在40℃下4000×g离心1min，弃上清，沉淀依次用甲苯、丙酮和甲醇洗涤之后于105℃，5h烘干，之后在60℃下干燥6小时，获得N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷-硅胶1g。
(2)pH值对N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷-硅胶富集诺如病毒影响(图2)
将1g制备的N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷-硅胶加入到10mL诺如病毒浓度为4.39×107(拷贝/mL)的水样中，分别在不同pH值(pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10)的条件下，于室温下孵育2小时，4000×g离心1min。使上清与沉淀分离，沉淀转入新的EP管中，按照步骤(4)和(5)进行分析，以未氨基化的原硅胶为对照，结果见图2。
(3)病毒浓度对N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷-硅胶富集诺如病毒影响(图3)
取浓度为4.39×1010拷贝/mL的诺如病毒水样，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8的方式依次用蒸馏水递减稀释。取8份步骤(1)制备的N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷-硅胶，每份1g，分别加入到10mL不同浓度(4.39×1010、4.39×109、4.39×108、4.39×107、4.39×106、4.39×105、4.39×104、4.39×103、4.39×102和4.39×101拷贝/mL)的诺如病毒水样中，分别在pH值为7的条件下，于室温下孵育2小时，4000×g离心1min。使上清与沉淀分离，1g沉淀转入新的EP管中，按照步骤(4)和(5)进行分析，以未氨基化的原硅胶为对照，结果见图3。
(4)N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷-硅胶中病毒的洗脱
分别向步骤(2)和(3)的EP管中加入1.5mL BGT洗脱液浸泡吸附有病毒的氨基化硅胶沉淀30min，期间每隔45s用超声波(20-25KHz)超声作处理5min。超声处理结束后，4000×g离心1min，收集上清。
(5)定量测定诺如病毒的富集效率
测定方法同实施例1。
(6)N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷-硅胶吸附病毒能力
结果表明：当1g活化硅胶与10mL、0.03g/mL N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液作用，可获得氨基化硅胶；氨基化硅胶与诺如病毒的吸附效果受到病毒溶液酸碱度的影响，当pH值在2-5时，吸附效果不稳定，且较小。而pH值在6-9时，吸附效果较好(图2)。同时，氨基化硅胶吸附病毒能力的研究表明，诺如病毒的浓度对氨基化硅胶的富集效果也有影响。图2的结果表明在pH值为6～9的条件下，1g氨基化硅胶富集10mL浓度4.39×103～4.39×107拷贝/mL诺如病毒水样时，其富集效率可达到较为稳定的72.65～85.76％之间。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其构架形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出简单的推演活替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
Figure IDA0001041205120000011

Claims (2)

1.一种非疾病诊断的基于聚乙烯亚胺硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，其特征在于所述方法为：将含有诺如病毒的待测污染水样与聚乙烯亚胺硅胶混合，在pH值为5～10的条件下，于20-30℃下振荡孵育2小时，孵育结束后，将混合液离心，取沉淀用BGT洗脱液浸泡15-30min，浸泡期间，每隔30-45s用20-25KHz超声波震荡辅助洗脱5min，离心，取上清即为污染水样中的诺如病毒浓缩液，检测浓缩液中诺如病毒含量，根据浓缩倍数，获得待测污染水样中诺如病毒含量；所述BGT洗脱液质量组成为：2.5％牛肉浸膏，0.05％吐温80，溶剂为0.25M甘氨酸水溶液，pH 3.5；所述BGT洗脱液体积用量以混合液离心获得的沉淀质量计为1.5～3ml/g；所述聚乙烯亚胺硅胶按如下方法制备：将硅胶加入1mol/L硝酸的双蒸水溶液，加热至微沸状态，持续搅拌4小时，反应结束后，产物依次用蒸馏水和甲醇洗涤洗至中性，然后在110℃真空干燥，获得活化后的硅胶；取活化后的硅胶加入到0.5-2mg/mL聚乙烯亚胺的甲醇溶液中混匀后，60℃温度下，持续震荡20小时，4000×g离心1min，弃上清，沉淀依次用0.5mol/L H2SO4水溶液、去离子水抽滤和1mol/L氨水浸泡5min后离心去上清，之后于80℃30min烘干，获得聚乙烯亚胺硅胶；所述硝酸双蒸水溶液体积用量以硅胶质量计为5mL/g；所述聚乙烯亚胺的甲醇溶液体积用量以活化后硅胶质量计为10ml/g；所述硅胶粒径40-75μm，中性pH，比表面积480m2/g。
2.如权利要求1所述非疾病诊断的基于聚乙烯亚胺硅胶浓缩检测水体中诺如病毒的方法，其特征在于所述含有诺如病毒的待测污染水样体积加入量以聚乙烯亚胺硅胶质量计为10-40mL/g。
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