CN106170556A - 通过创新性的基于益生菌的用于确定针对益生菌的毒性的方法测试的无毒原料和成品的生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种旨在用于生产食物和药物工业的原料及成品的方法，如通过创新性的基于益生菌的毒性的测试方法所检测的，所述原料及成品无任何针对益生菌的毒性。

Description

通过创新性的基于益生菌的用于确定针对益生菌的毒性的方 法测试的无毒原料和成品的生产
本发明涉及旨在用于食物和药物工业并且没有毒性的原料及成品的制作方法，所述毒性其能够通过用于分析针对益生菌的毒性的创新性方法(基于益生菌)而检测。
原料被认为是作为制造和生产其他产品的基础的所有材料或物质，所述其他产品通过使用能够获得所需成品的合适的加工和工业处理来制造和生产。
举例而言，用于生产食品或补充剂或医学装置或药物产品的原料包括调味剂、提取物、有机和/或无机来源的助剂(co-formulant)、技术添加剂、维生素、蛋白质、氨基酸、蛋白胨、天然和/或合成聚合物等等。
说明性而非穷举性地举例而言，可以从植物和/或其果实制备调味剂和/或提取物。
公知的是，目前例如用化学物质处理结果植物及其果实，以保护其免受微生物或真菌或昆虫的攻击，从而使果实能够生长直到达到成熟，然后收获和消费。
同样公知的是，该处理后，一部分所用的化学物质保持吸附在果实的外表面(通常称为果皮或外皮)上。在用水连续洗涤果实后被吸附的化学物质也存留。
果皮(外果皮(exocarp))是可以剥离的果实或植物的保护性外层(表皮，其进而由角质层和厚壁组织组成)。保护性外层也被不正确地称为外皮。
此外，不能排除一部分吸附在果实外表面上的化学物质可能渗透到果实自身中(渗透到果肉中)，结果所述化学物质从果实外部吸收到内部。
目前收获的部分果实用于生产在食物、药物和营养品工业中应用的天然植物性提取物和/或调味剂(原料)。
通常，天然植物性提取物和/或调味剂，借助于本领域技术人员已知的设备和/或技术，通过机械和/或化学提取从全果实(果皮和果肉)或从单独处理的果皮和/或果肉获得。
例如，在通过用溶剂提取获得的调味剂和/或提取物和/或有机化合物的情况下，可能会发生即使用水和/或有机溶剂进行数次洗涤步骤也不能成功地完全消除所有所用溶剂的情形，因此即使少量存在也引起对益生菌的毒性。
所以，期望的是能够存在下述方法，其具有高敏感性和能够鉴定直到何时在给定物质或原料中仍存在残留毒性，以安排用于使原料没有对益生菌的毒性的纯化或洗涤或沉淀工序。
这也适用于蛋白质提取或氨基酸制备。在该情况下，也使用了可能作为残留物遗留并引起对益生菌的毒性的化学试剂和/或溶剂。
对于广泛用于配制成品的无机原料，例如二氧化硅，其自身也存在同样的问题。
对于通过化学和/或机械提取获得的天然植物性提取物和/或调味剂以及对于通过合成和/或提取工艺制备的其他上述原料，不能忽视下述事实，即在原料内可能存在少量的赋有“毒”性的物质或化合物，其对原料自身赋予一定的固有毒性。
因此，对于天然植物性提取物和/或对于其他上述原料，不能排除其中存在各种量的毒性物质，所述量取决于果实所采用的栽培类型和/或进行机械和/或化学提取所采用的操作条件。
在任何情况下，在天然植物性提取物和/或调味剂和/或原料中存在的任何毒性物质通常引起两种问题：间接问题和直接问题。
前者(或间接问题)与下述影响有关，即，所述毒性物质的摄入能够改变肠道益生微生物丛，因而也影响消化系统的生理机能，以至于会影响维生素、生物活性肽和代谢物的吸收，并类似地允许产生有害的生源胺(biogenic amine)，已知这改变肠道渗透性并且引起一系列的健康问题，甚至达到产生作为公知的致癌性物质的亚硝胺的程度，所述生源胺由获益于上述改变的菌株产生。
在这点上，应该强调的是，如果由于赋有脱羧性的能够通过消除羧基而使氨基酸转化成胺的大肠菌群病原性细菌(例如大肠杆菌)的定殖的增加而改变益生菌丛，则会产生有害的异常量的生源胺。
此外，肠道微生物丛的失衡似乎能够导致出现各种病症：糖尿病和自体免疫疾病，或者据假设会在对一些食物过敏原的不平衡的局部和全身免疫响应方面起作用。
第二问题或直接问题涉及已经能够杀死益生菌细胞的所述毒性物质在处于儿童年龄或处在发育阶段的个体中可能具有的效应，该效应由于即刻和/或累积的毒性作用所致，其不仅针对细菌细胞也针对真核细胞，后者在分化期和生长期特别敏感。
因此，仍然需要以确保无毒的方式产生原料和成品，并且需要存在用于确定提取物和/或调味剂和/或原料的毒性的有把握的、简单实用、经济且可重复的方法。
特别是，仍然需要用于确定构成成品(例如食物、补充剂或医学装置或药品)的个体成分对于益生菌的毒性的方法。
申请人已经发现生产无毒原料和成品的创新性途径，其通过使通常的提取物和/或调味剂和/或原料进行新毒性测试以确定其针对益生菌的毒性来进行。
本发明的主题是一种用于生产无毒原料和成品的方法，该方法有赖于申请人提供的能够通过创新性方法确定针对在所述原料和成品中存在的益生菌的毒性的可能性，该创新性方法同样也形成本发明的主题。
申请人已经发现用本发明的方法确定的毒性不仅取决于所用原料本身，而且最重要的是，还取决于用于生产所述原料的机械和/或化学提取的类型。事实上，原料的化学提取可能包括使用化学溶剂，以及能够在原料自身留下残留毒性的一些洗涤或沉淀步骤。
所述方法包括其中使益生菌菌株(毒性标志物)与待测原料接触的步骤，所用的原料的量与制剂中通常使用的量相等。
在实践方面，制备第一样品，其包含益生菌菌株(毒性标志物)、所述益生菌菌株的最佳培养物质和待测原料。
接着制备第二样品(内部参照)，其包括所述第一样品中使用的相同益生菌菌株(毒性标志物)，以及仅最佳培养基质(无待测原料)。
如下所述，通过所述第一样品和所述第二样品的细菌板计数进行所述确定。
所述第一样品的细菌计数(板上数出的细胞数)与所述第二样品的细菌计数(板上数出的细胞数)之比给出小于1的数值，如果将其表示为百分比，其提供与原料接触时存活的细菌的计数，因此还表示在用作标志物的益生菌中由所述原料引起的死亡率％。
第一实施方式涉及确定原料的毒性，所述原料例如通常的天然植物性提取物和/或调味剂和/或原料。
在该情况下，测试针对益生菌的毒性需要在实验室里如上所述建立2个测试。
在实践方面，制备第一样品，其包含益生菌菌株(毒性标志物)、所述益生菌菌株的最佳培养基质和待测原料。
接着制备第二样品(内部参照)，其包括所述第一样品中使用的相同益生菌菌株(毒性标志物)，以及仅最佳培养基质(无待测原料)。
如下所述，通过所述第一样品和所述第二样品的细菌板计数进行所述确定。
优选的是，所述第一和第二测试在相同的操作条件下平行地进行。
所述第一样品的细菌计数(板上数出的细胞数)与所述第二样品的细菌计数(板上数出的细胞数)之比给出小于1的数值，如果将其表示为百分比，其提供与原料接触时存活的细菌的计数，因此还表示在用作标志物的益生菌中由所述原料引起的死亡率％。
在所述第一测试中进行的细菌计数和在所述第二测试中进行的细菌计数之间的差异提供细菌致死率的百分比，这提供了与所述原料相关的针对益生菌的毒性的指示。
通过非穷举性实例，申请人测试了市场中存在的数种调味剂和提取物，例如柠檬和蓝莓调味剂，其也用于制备成品。这些测试的目的在于验证所述食物或原料(柠檬和蓝莓调味剂)是否拥有针对益生菌的固有毒性。
出于该理由，使所述原料(柠檬和蓝莓调味剂)在特定操作条件下与给定的益生乳酸菌(lactic bacteria)或双歧杆菌接触。
在本发明方法中用作毒性标志物的益生菌菌株属于选自由乳杆菌(lactobacilli)和双歧杆菌组成的组的物种，优选是益生菌性的。
优选实施方式设想使用表1所列出的菌株中细菌菌株。
表1
对所述食物或原料(柠檬和蓝莓调味剂)进行的测试显示了针对用作毒性标志物的益生菌菌株的急性毒性。在实践方面，测试了来自不同供应商的两种柠檬提取物(原料)和两种蓝莓提取物(原料)。可以验证第一柠檬提取物和第二蓝莓提取物引起针对所用益生菌菌株的急性毒性，分别为57％和58％死亡率，所述益生菌菌株具有6×109CFU/g的起始理论载量。使用由Anidral Srl公司于2002年1月31日保藏的益生菌菌株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA02LMG P-21381和由Anidral Srl公司于2002年1月31日保藏的益生菌菌株动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)BS01LMG P-21384进行该测试。
在这点上，申请人使用仅从果实(柠檬和蓝莓)的果肉通过温和挤压获得的调味剂代替市场上存在的蓝莓和柠檬调味剂重复了上述测试。在实践方面，在柠檬和蓝莓两种情况下，都将果皮事先与果肉分离，并且仅使后者在温和条件下使用本领域技术人员已知的设备和方法进行机械提取。在该情况下，使用在温和条件下从果肉的提取物获得的提取物/原料，发现不存在针对益生菌的毒性；事实上，使用起始载量等于6.7×109CFU/g的益生菌菌株，使用蓝莓果汁获得6.5×109CFU/g，使用柠檬果汁获得6.4×109CFU/g，因此获得了比之前情况好得多的值，并且毒性极低，死亡率接近零。
以与柠檬和蓝莓提取物相同的方式测试了其他原料，如下所述。
申请人测试了市场上存在的数种成品，目的是确定针对益生菌的毒性程度，并且鉴定在所述成品使用的原料中哪些所用原料对毒性最具贡献。
在优选实施方式中，确定原料针对益生菌的毒性，原料例如是具有例如总共5种成分的成品的配方内的提取物和/或调味剂。
在该情况下，毒性测试包括在实验室中建立一定数量的测试，该数量等于成分的数量(在该示例性情况下存在5种成分)加上分析参照。
为了显示本发明的潜力，申请人测试了在将用于成品(例如P1)制备中的蔓越莓提取物的一系列样品。
确定了原料蔓越莓提取物(批次L1、批次L2，来自不同供应商)的毒性，所述原料必须与成品(P1)内的其他组分/成分一同存在。
在该情况下，建立两种测试。在第一测试中，制备由益生菌菌株(例如LS01(用作毒性标志物))组成的混合物。该第一测试表示内部分析参照：Ref.1。预期的理论细菌计数等于25MLD/剂量(内部参照)。
在第二测试中，制备了含有益生菌菌株LS01(用作毒性标志物))与来自不同供应商的所述成品中的第一蔓越莓提取物(L1和L2)的混合物。
在相同的操作条件下以与所述成品中存在的量相同的量平行地进行所述第一和第二细菌计数。
随后，确定所述第一测试(Ref.1)的真实细菌计数和所述第二测试的细菌计数。采用相同的操作条件进行细菌计数。
供应商V：批次1(L1)和批次2(L2)–Var蔓越莓
供应商V：批次1(L1)和批次2(L2)–Var蔓越莓
供应商K：批次1(L1)和批次2(L2)–Kem蔓越莓
供应商K：批次1(L1)和批次2(L2)–Kem蔓越莓
供应商P：批次1(L1)和批次2(L2)–Pac蔓越莓
供应商P：批次1(L1)和批次2(L2)–Pac蔓越莓
供应商N：批次1(L1)和批次2(L2)–Nut蔓越莓
供应商N：批次1(L1)和批次2(L2)–Nut蔓越莓
将各种原料(蔓越莓)供应品(批次)基于其原花青素含量(至少1.5％(HPLC))引入用于毒性测试的混合物中，以确保该成分在成品P1中的浓度相同。
表2
使用表1中所示的编号为9、33、39、46、54、59、73、84、95、101、116、130、138、143、169和185的益生菌菌株也重复表2的测试，获得的结果与表2中所示结果非常相似。
在所述第一测试(Ref.1)中进行的细菌计数和在所述第二测试中进行的细菌计数之间的差提供益生菌菌株LS01的死亡率百分比，其提供所述蔓越莓提取物针对所述菌株的毒性的指示。
如所述第一测试和在所述第二测试中所确定的获自细菌计数的活细胞载量，使得可以确立所测试原料是否对在所述成品P1中存在的益生菌菌株LS01的细胞发挥毒性作用。
将在细菌计数方面相对于参照(Ref.1)的百分比减少表示为由进行本发明的毒性测试的原料引起的死亡率％。
申请人进一步将上述方法应用至成品中存在的柠檬和蓝莓提取物，获得与以上使用蔓越莓相当时的结果。
表2显示某些常用于配制成品的提取物(例如蔓越莓提取物)会对成品赋予毒性并且因此也对使用该成品的个体的身体赋予毒性，但是同样也适用于其它原料。
因此，利用本发明可以开发无毒或毒性极大减少的成品的配方，所述成品例如膳食补充剂或医学装置或药物产品，因为可以鉴定所用原料是否赋予针对益生菌的毒性。
在本发明的背景下，相对于内部参照的细菌载量的百分比减少[(测试样品的细菌计数)/(内部参照的细菌计数)]＝由原料引起的死亡率％，其为1％至5％表示无死亡率；大于5％至15％的值表示低死亡率，仍然可接受；大于15％至25％的值表示中等至高死亡率，而超过25％则面对急性死亡率。
本发明的方法例如在测试用在补充剂和医学装置(成品)的配方中的毒性赋形剂或原料(例如橙调味剂、红花、黑胡萝卜(black Carrot)、蓝莓提取物等)的存在时具有有效应用。
以下通过实例说明本发明的方法，并且因此不限制本发明的范围。
在优选实施方式中，在含有例如以下成分A、B、C(完全配方A+B+C)的成品的情况下，可以使用本发明的方法以确定作为整体(A+B+C)的成品是否发挥针对益生菌菌株的毒性。
在该情况下，针对益生菌的毒性的测试包括在实验室里建立2个测试。
在实践方面，制备第一样品，其包含益生菌菌株(毒性标志物)、所述益生菌菌株的最佳培养基质和待测原料(在该情况下为配方A+B+C)。
接着制备第二样品(内部参照)，其包括所述第一样品中使用的相同益生菌菌株(毒性标志物)，以及仅最佳培养基质(无待测原料)。
如下所述，通过所述第一样品和所述第二样品的细菌板计数进行所述确定。
优选的是，所述第一和第二测试在相同的操作条件下平行地进行。
如果所述第一样品的细菌计数(板上数出的细胞数)与所述第二样品的细菌计数(板上数出的细胞数)之比给出小于1的数值，例如0.55(或55％)，这意味着与原料接触后存活的细菌的计数是55％，因此，在用作标志物的益生菌菌株中由A+B+C引起的死亡率％是45％。
确切地说，如果出现针对用作标志物的益生菌菌株的毒性，则下一步将确定构成成品(A+B+C)中的成分A、B和C中的哪一种发挥所检测的毒性。
在该情况下，所述方法包括准备如下所述的三个测试(测试1、测试2和测试3)。
例如，对原料A进行测试1，该测试1包括制备以下样品：
(i)制备第一样品，其包含益生菌菌株(毒性标志物)、所述益生菌菌株的最佳培养基质和待测原料(在该情况下为A)。
(ii)接着制备第二样品(内部参照)，其包括所述第一样品中使用的相同益生菌菌株(毒性标志物)，以及仅最佳培养基质(无待测原料)。
(iii)对所述第一样品和所述第二样品进行细菌板计数。
(iv)确定死亡率百分比。
类似地，用相同方法准备使用原料B的测试2和使用原料C的测试3。
以此方式，可以鉴定在配方A+B+C存在的成分A、B和C中哪一些是发挥针对益生菌菌株的毒性的成分。在相同的操作条件并且以在成品中指示出的浓度进行毒性测试(连续法)。
对于板计数，采用下文作为测试方法的非限制性实例所描述的方法，该方法包括常规的微生物计数，首先使样品再悬浮，在合适的稀释剂中连续稀释，在琼脂化的培养基上铺平板，并在最佳条件下温育后进行集落计数。测定出与参照样品相当的板死亡率的赋形剂/原料被认为是相符(毒性减少或无任何毒性)。
如下文所注解，对用于益生菌应用的乳酸菌和双歧杆菌进行总的、区分性和/或选择性(在琼脂化培养基)的计数，所述乳酸菌和双歧杆菌在待确定活的活力细胞浓度的样品中单独存在或以共混物存在。
配制培养基以确保属于上述微生物组的所有各种益生菌物种的生长，并且必要时，通过添加选择性试剂(通常为抗生素和/或糖)或区分性试剂(通常为pH和/或氧化还原颜色变化指示剂)。
该方法提供琼脂化培养基LAPTg的应用，所述的配方仅由存在的两种不同的N源、作为碳源的糖和作为维生素B及生长因子来源的酵母提取物组成。不存在有机和无机盐和具有选择性作用的物质使得所有的属于乳杆菌属和双歧杆菌属的各个益生菌物种可以蓬勃生长。
通过对LAPTg琼脂添加选择性和/或区分性试剂，可以对存在于复合混合物中的益生菌进行区分性计数。基于构成混合物的菌株的特定基因型和表型特征，视情况选择选择性试剂(通常为抗生素和/或糖)或区分性试剂(通常为pH和/或氧化还原颜色变化指示剂)。
如果待分析样品由两种以上乳杆菌和双歧杆菌的混合物组成，建议将LAPTg的选择性计数与使用HHD培养基对组成混合物的菌株进行的定量评估结合。更进一步的细节参考以下科技论文：
-Molecular Cloning a Laboratory Manual(Sambrook,Fritsch,Maniatis)；
-Susceptibility of Lactobacillus spp.to antimicrobialagents.M.Danielsen A.Wind.2002；
-Antibiotic Susceptibility of Lactobacillus and Bifidobacteriumspecies from Human Gastrointestinal tract,S.Delgrado A.B.Florez B.Mayo,2005；
-ISO 6887-1:2000；
-Preparation of LAPTg medium:FONT DE VALDEZ,G,and Coll.:Influence ofthe recovery medium on the viability of injured freeze-dried lactic acidbacteria Milchwissenschaft 40(9)518-520(1985)；
-UNI EN ISO 6887-1:2000“Buffered Peptone Water”；
-A differential medium for the enumeration of homofermentative andheterofermentative lactic acid bacteria.LC.McDonald R.F.McFeeters, M.A.Daeschel and HP Felming.Applied and Environmental Microbiology.1987年6月:1382-1384。
首字母缩写：
-活的活力细胞的浓度＝能够在培养基中生长并且形成不同集落的细胞数量/单
位(g或ml)(CFU/g或ml)
-CFU/g或ml＝集落形成单位，即活的活力细胞的浓度的度量单位
-MIC＝最小抑制浓度
该方法提供使用琼脂化培养基LAPTg，配方仅由存在的两种不同的N源、作为碳源的糖和作为维生素B及生长因子来源的酵母提取物组成。不存在有机和无机盐和具有选择性作用的物质使得所有的属于乳杆菌属和双歧杆菌属的各个益生菌物种可以蓬勃生长。通过对LAPTg琼脂添加选择性和/或区分性试剂，可以对存在于复合混合物中的益生菌进行区分性计数。基于构成混合物的菌株的特定基因型和表型特征，视情况选择选择性试剂(通常为抗生素和/或糖)或区分性试剂(通常为pH和/或氧化还原颜色变化指示剂)(参见8.2)。如果待分析样品由两种以上乳杆菌和双歧杆菌的混合物组成，建议将LAPTg的选择性计数辅以使用HHD培养基对组成混合物的菌株进行的定量评估。
材料和试剂
LAPTg培养基，基础培养基：
-细菌蛋白胨(动物蛋白的酶促水解物)15g
-胰蛋白胨(酪蛋白的胰酶水解物)10g
-酵母提取物10g
-Tween 80ml 1
-琼脂g 15
-适量蒸馏水至900ml
注意：以上所示重量理解为具有±5％的精度t
将除琼脂之外的成分溶于蒸馏水中。检查pH并且必要时校正至6.55±0.05，然后添加琼脂并在水浴中溶解。将培养基在尚温热时加入Bibby烧杯中，并在高压釜中于121℃灭菌15分钟，灭菌后在25℃±1的pH应该是6.5±0.5。
完全培养基:
使用时，溶解(8.1)后，向基础培养基添加1体积的经过滤灭菌的10％葡萄糖溶液，从而具有10g/L的葡萄糖终浓度。
HHD培养基:
最终pH＝6.90+0.10
乙醇、Minisart一次性使用无菌0.45μm注射式过滤器、用于重建样品的稀释剂：
液体细菌培养物的重建和连续10倍稀释的制品-蛋白胨盐水溶液
-细菌蛋白胨 1.0g
-氯化钠(NaCl) 8.5g
-足量蒸馏水至 1000ml
具有游离形式益生菌(未微胶囊化)的无水(冻干)细菌培养物和成品的重建。
(冻干)细菌培养物未以剂量或单位制备
磷酸盐缓冲液pH 6.8
袋剂(Sachet)、胶囊剂、丸剂、片剂、栓剂和瓶内盖(undercaps of bottles)：
磷酸盐缓冲液pH 6.8
将组分溶于蒸馏水中，必要时加热。检查pH为6.8±0.10。将稀释剂加入Bibby烧杯中，在高压釜中于121℃灭菌15分钟，在暗处于4℃至5℃贮存不多于1个月。
如果成品含有油和/或脂质物质，必须向pH6.8的缓冲液添加1％Tween 80(5.5.2.1)。
厌氧试剂盒(AnaeroGen-Oxoid):化学结合氧，产生CO2；小的10ml无菌注射器也可购自药房；5％fin L-半胱氨酸HCl溶液：称量5g L-半胱氨酸盐酸盐1-水合物(BDH370553)，用MQ水补足至100ml；然后在无菌离心管中用0.45μm过滤器过滤，并在+4℃±2贮存至多1年(该溶液必须添加至LAPTg培养基以获得0.05％的终浓度)。
步骤
8.1 以对于要准备的板的数量而言足够的量(参见段落8.5.5的“注意”)将LAPTg培养基(5.1)溶解，考虑到对于每个板需要约12±1ml培养基。
如果计划对所述样品不仅在所述LAPTg培养基中还在补充有一种或多种选择性试剂(N)的相同LAPTg培养基中的相同稀释液进行计数，考虑将(板的数量)乘以N。使培养基在恒温水浴中于45℃±0.5静置至少3小时。
8.2 选择性试剂和对应制品的列表
8.2.1 抗生素
·万古霉素
贮存：1.5ml等分试样，在+4℃贮存15天或在-20℃至多4个月。
·氯霉素
贮存:2ml等分试样，在-20℃贮存至多4个月。
·克林霉素+环丙沙星
贮存：对于环丙沙星，1.5ml等分试样在-20℃贮存至多6个月(克林霉素未确定(n.d.)).
·头孢呋辛
贮存:1.5ml等分试样，在-20℃至多2年。
·头孢西丁
贮存:1.5ml等分试样，在-20℃下至多2年。
·莫匹罗星
贮存:1.5ml等分试样，在-20℃至多6个月
·环丙沙星(阳性选择LP02与LF10的共混物)
贮存:1.5ml等分试样，在-20℃至多6个月
8.2.2 其他选择性条件
8.3 如果待分析样品由两种以上乳杆菌和双歧杆菌的混合物组成，建议将LAPTg的选择性计数辅以使用HHD培养基对组成混合物的菌株进行的定量评估。将上述培养基溶解，并如LAPTg培养基所述一样将其置于恒温水浴中。然后将培养基以12±1ml的量分配在Petri板中，使其固化；
8.4 如果计划使用一种或多种选择性试剂，在无菌瓶中向溶解的LAPTg培养基的等分试样(例如对于约8个板为100ml)以规定的终浓度添加用于区分组成样品的菌株所需的抗生素溶液或其它选择性试剂；
8.5 制备样品的连续10倍稀释液(ISO 6887-1:2000的章节Ia，9.2段)
8.5.1 使用无菌移液管将1ml的第一稀释液(如果是液体则直接移取1ml样品培养液)添加至含有9ml无菌稀释液的试管中；
8.5.2 不要将移液管深入起始悬浮液超过1cm；
8.5.3 每次稀释后更换移液管；
8.5.4 用机械振荡器充分将稀释液匀质化，振摇试管3次，每次不少于5秒，以获得稀释液10-2；
8.5.5 使用10-2稀释液重复这些步骤，并且进一步稀释直到获得在板上培养时给出显著集落数的微生物浓度；
注意：接种2个连续10倍稀释液(例如10-8、10-9)应该使得能够看到两个临近稀释液含有10～300个细胞数量。如果不清楚包含在样品中的细胞数量，需要的是接种超过2个连续10倍稀释液(例如10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10)，然后仅考虑产生包含10～300个集落数的那些。
8.6 将从判断为合适(8.5.5)的样品稀释液抽取的1ml分配至Petri板上；
8.7 以12±1ml的量在第一系列的板上添加培养基LAPTg，并且在第二系列上添加补充有选择性试剂的LAPTg；
注意：样品重建和系列稀释液与Petri板上的培养基接触(8.6)的时刻之间经过的时间必须不超过30分钟。
8.8 首先利用旋转移动、然后水平和垂直平移来均匀地混合培养基和样品；
8.9 允许进行15至20分钟固化；
8.10 在由两种以上乳杆菌和双歧杆菌菌株的混合物组成的样品和/或对其推荐使用HHD培养基的情况下，添加100μl合适稀释液至HHD(8.3)的分型板(ready plate)，并用药匙均匀地分配样品；
8.11 在厌氧条件(Gas-Pak+厌氧试剂盒)下将板翻转在37±1℃温育72小时。关于如何使用厌氧系统，遵循包含在试剂盒中的说明书。
结果的计算：通过在板观察器的透镜下观察集落而验证集落的存在，并且专门对含有10～300个集落数的板进行计数。结果表示为CFU，即集落形成单位。使用以下公式表达结果：
Σ C ( n 1 + 0 , ln 2 ) d
其中：
ΣC是对所有板计得的集落的总和
n1是第一稀释度下计数的板的数量
n2是第二稀释度下计数的板的数量
d是从其获得第一计数的稀释度
实施例:
10-8稀释度的板:250
10-9稀释度的板:23
结果
250 + 23 ( 1 + 0.1 ) 10 - 1 = 24810 - 8 C F U / g
使获得的结果四舍五入为两位有效数字。在液体样品的情况下所示实例的结果会是250 10–8CFU/g或ml(具体结果的表达基于特定类型)。在HHD中展开的样品的情形中，目视检查培养的集落中的不同形态，从而鉴定出共混物中存在的乳杆菌和双歧杆菌的各种菌株。
进行计数并检查板培养的集落(步骤9)后，将得到：在单菌株样品的情况下，如此从具有LAPTg的板获得的计数表示组成样品的益生菌载量的总载量。
在由两种以上乳杆菌和双歧杆菌菌株组成的样品的情况下：
a)如此从用LAPTg培养基制备的一系列板获得的计数表示进行分析的样品中的益生菌的总载量；
b)用补充有选择性试剂的LAPTg培养基制备的一系列板获得的计数表示能够在添加至培养基作为选择性试剂的特定物质的存在下进行复制的菌株的载量；
c)从用选择性培养基获得的个体益生菌的计数，可以通过与LAPTg中的总计数(a)项)之差推断出在选择性试剂的存在下没有发育的其余菌株的计数；
d)在HHD培养基中接种使得可以目视区分共混物形式的样品中存在的不同菌株，并且在LAPTg培养基中选择性计数。
在使用表1中所示的益生菌菌株(编号17、22、41、60、74、98、121、145、174)作为毒性标志物的多次测试中，申请人用本发明方法测试了以下原料。
实验数据显示，在许多情况下意想不到地发现毒性总是以不同水平存在，且具有实质性的死亡率％。
芦荟(Aloe)测试：发现死亡率等于5％。
柠檬酸测试：发现死亡率等于2％。
阿拉伯半乳聚糖测试：发现死亡率等于6％。
树莓(Raspberry)调味剂测试：发现死亡率等于2％。
树莓调味剂测试：发现死亡率等于26％。
蓝莓测试：发现死亡率等于5％。
二氧化硅测试：发现死亡率等于50％。
二氧化硅测试：发现死亡率等于28％。
二氧化硅测试：发现死亡率等于23％。
塔拉胶(Tara gum)测试：发现死亡率等于14％。
维生素B1、B2和B6测试：发现死亡率等于33％。
沸石测试：发现死亡率等于2％。

Claims (8)

1.一种用于生产无毒食物或药物原料的方法，所述方法包括其中使所述原料与预设定细菌载量的益生菌菌株接触的第一步骤，和确定因所述原料针对所述益生菌菌株发挥的毒性而造成的所述细菌载量的减少的第二步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一步骤包括制备：
-第一测试样品，所述第一测试样品包含预设定浓度、优选1×106CFU/g～1×109CFU/g浓度的益生菌菌株标志物、用于生长所述益生菌菌株的最佳培养基质和待测食物或药物原料，和
-第二测试样品(内部参照)，所述第二测试样品包含相同预设定浓度的与所述第一样品相同的益生菌菌株、用于生长所述益生菌菌株的最佳培养基质和待测食物或药物原料。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第二步骤包括对所述第一测试样品和所述第二测试样品进行细菌计数。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述细菌计数使用包括以下步骤的方法进行：使起始样品再悬浮的步骤、在合适稀释剂中制备系列稀释液的步骤、在琼脂化培养基中铺平板的步骤和在最佳条件下温育后将集落计数的步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其中确定所述第一测试样品的细菌计数(板上数出的细菌数量)与所述第二测试样品(内部参照)的细菌计数(板上数出的细菌数量)之比。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用作针对益生菌的毒性的标志物的益生菌菌株选自乳杆菌和双歧杆菌。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述食物或药物原料选自由调味剂、提取物、有机来源的助剂和/或无机来源的助剂、技术添加剂、维生素、蛋白质、氨基酸、蛋白胨、天然聚合物和/或合成聚合物等组成的组。
8.一种用于生产食品或膳食补充剂或医学装置或药物产品的方法，所述方法使用前述权利要求1～7中的一项或多项所述的用于生产无毒食物或药物原料的方法进行，所述食品或膳食补充剂或医学装置或药物产品包含针对所选益生菌无毒的原料。
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