JP2016526903A - プロバイオティクス細菌に対する毒性決定のための画期的プロバイオティクス細菌に基づく方法により試験した無毒な原材料および最終製品の製造 - Google Patents
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Abstract
Description
果樹植物および果実自体は、今日では、例えば、果実が熟すまで成長し、その後収穫および消費されることが可能となるように、微生物、真菌または昆虫による攻撃から保護するために化学物質で処理されているのは周知のとおりである。
さらに、果実の外表面に吸着した化学物質の一部が、該化学物質の果実外部から内部への吸収により果実自体に(果肉内に)浸透する可能性も無視できない。
通常、天然植物抽出物および/または香味料は、当業者に知られる装置および/または方法により、果実全体(皮および果肉)からまたは別々に処理された皮および/または果肉から機械的および/または化学的抽出により得る。
実施に際しては、プロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)、該プロバイオティクス細菌株に最適の培養基質および試験する原材料を含む、第一サンプルを調製する。
該第一サンプルの細菌数(プレート上で数えられた細胞の数)対該第二サンプルの細菌数(プレート上の細胞の数)の比が、1未満の数値となるならば、これは、パーセンテージで表したならば、原材料と接触して生存している細菌数を提供し、そして、それゆえに、またマーカーとして使用したプロバイオティクス細菌株の該原材料により誘発された殺菌率%も表す。
この場合、プロバイオティクス細菌に対する毒性の試験は、上記のような、実験室での2種の試験の設定を必要とする。
ついで、第二サンプル(内部標準)を調製し、これは該第一サンプルに使用したのと同じプロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)および最適培養基質(試験する原材料を含まない)のみを含む。
好ましくは、該第一および第二試験を、同一操作条件下に並行して行う。
本発明の方法において毒性マーカーとして使用したプロバイオティクス細菌株は、好ましくはプロバイオティクスである、ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属を含む群から選択される種に属する。
出願人は、プロバイオティクス細菌に対する毒性の程度を決定する目的で、市販の数種の最終製品を試験し、該最終製品に使用されている原材料の中で、使用されるどの原材料が最も毒性に貢献するかを同定した。
この場合、毒性試験は、成分の数と同じ数 − この事例の場合には5成分に加えて、分析対照の試験を実験室で設定することを含む。
最終製品(P1)内に他の要素/成分と共に存在している原材料であるクランベリー抽出物(4つの異なる納入業者からのロットL1、ロットL2)の毒性を決定した。
続いて、該第一試験 − Ref. 1の実際の細菌数と該第二試験の細菌数を決定した。細菌数計数は、同じ操作条件を適用して実施した。
納入業者V:ロット1(L1)およびロット2(L2)−Varクランベリー
納入業者K:ロット1(L1)およびロット2(L2)−Kemクランベリー
納入業者K:ロット1(L1)およびロット2(L2)−Kemクランベリー
納入業者P:ロット1(L1)およびロット2(L2)−Pacクランベリー
納入業者P:ロット1(L1)およびロット2(L2)−Pacクランベリー
納入業者N:ロット1(L1)およびロット2(L2)−Nutクランベリー
納入業者N:ロット1(L1)およびロット2(L2)−Nutクランベリー
好ましい態様において、例えば、下記成分A、B、C(完全調合物A+B+C)を含む最終製品の場合、本発明の方法を最終製品が、全体として(A+B+C)、プロバイオティクス細菌株に対する毒性を発揮するか否かの決定のために使用できる。
実施の観点から、第一サンプルを調製し、これはプロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)、該プロバイオティクス細菌株のための最適培養基質および試験する原材料、この場合調合物A+B+Cを含む。
好ましくは、該第一試験と第二試験を並行して同じ操作条件下で行う。
例えば、試験1を原材料Aで実施し、次のサンプルの調製を含む。
(i) 第一サンプルを調製し、これはプロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)、該プロバイオティクス細菌株のための最適培養基質および試験する原材料、この場合Aを含む。
(ii) 第二サンプル(内部標準)を調製し、これは該第一サンプルに使用したのと同じプロバイオティクス細菌株(毒性マーカー)および最適培養基質(試験する原材料無し)のみを含む。
(iii) 細菌生菌数計数を該第一サンプルおよび該第二サンプルで実施する。
(iv) 殺菌率のパーセンテージを決定する。
この方法で、調合物A+B+Cに存在する成分A、BおよびCのどれが、プロバイオティクス細菌株に対する毒性を発揮する成分であるかを同定することが可能である。毒性試験を、同じ操作条件下、最終製品−逐次的方法において示される濃度で実施する。
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− 生存している、生存可能細胞の濃度=培養培地で増殖でき、明瞭なコロニー(CFU/gまたはml)を形成できる、細胞数/単位(gまたはml)
−CFU/gまたはml=コロニー形成単位、すなわち生存している、生存可能細胞の濃度の測定単位
− MIC=最小阻止濃度
LAPTg培地、基底培地:
− バクトペプトン(動物タンパク質の酵素加水分解物) 15g
− トリプトン(カゼインの膵臓加水分解物) 10g
− 酵母抽出物 10g
− Tween 80 1ml
− 寒天 15g
− 蒸留水 900mlまで適量
註:上記の重量の精度は±5%であると解釈すべきである
使用時、溶解(8.1)後、1体積の10%グルコース溶液(濾過により滅菌)を基底培地に添加し、最終グルコース濃度10g/リットルとする。
− フルクトース 2.50g
− KH2PO4 2.50g
− バクトトリプトン 10.00g
− ソイトンペプトン 1.50g
− カザミノ酸類 3.00g
− 酵母抽出物 10.00g
− Tween 80 1.00g
− ブロモクレゾールグリーン 20.00ml
− 寒天 20.00g
− 蒸留水 1000ml
最終pH=6.90+0.10。
液体細菌培養の再構成および連続的10進希釈 − ペプトン食塩水溶液
− バクトペプトン 1.0g
− 塩化ナトリウム(NaCl) 8.5g
− 蒸留水 1000mlまで適量
(凍結乾燥)細菌培養は複数用量または複数単位で調製しない。
リン酸緩衝液pH6.8
− 塩化ナトリウム(NaCl) 5.00g
− KH2PO4 3.78g
− Na2HPO4 4.77g
− 蒸留水 1000mlまで適量
リン酸緩衝液pH6.8
− 塩化ナトリウム(NaCl) 5.00g
− KH2PO4 3.78g
− Na2HPO4 4.77g
− 蒸留水 1000mlまで適量
最終製品が油分および/または脂質物質を含むならば、1%Tween 80を緩衝液pH6.8に添加する必要がある(5.5.2.1)。
8.1 各プレート約12±1mlの培地が必要であることを考慮して、調製すべきプレートの数に十分な量のLAPTg培地(5.1)を溶解(パラグラフ8.5.5の注参照)。
サンプルの同じ希釈物上での計数の実施を計画しているならば、LAPTg培地自体だけでなく、1種以上の選択剤(N)を添加した同培地を、N倍した(プレートの数)を考慮すべきである。培地を恒温水浴に45℃±0.5の温度で少なくとも3時間置く;
8.2.1 抗生物質
・ バンコマイシン
原液 1mg/ml(0.45μm濾過で滅菌)
希釈剤 水
使用濃度 1μg/ml
正の選択 偏性のおよび通性のヘテロ発酵生物ラクトバチルス属(例えばラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイなど)。
負の選択 感受性ホモ発酵生物ラクトバチルス属(例えばラクトバチルス・アシドフィルス群)およびビフィドバクテリウム属のような株。
保存:1.5ml量を+4℃で15日または−20℃で最長4ヶ月まで。
原液 10mg/ml(0.45μm濾過で滅菌)
希釈剤 エタノール
使用濃度 7μg/ml
正の選択 MIC>4μg/mlの株(例えばLPC00)
負の選択 高感受性の株(MIC<2μg/ml)。
保存:2ml量で−20℃で最長4ヶ月まで。
原液 1mg/ml クリンダマイシン+10mg/ml シプロフロキサシン(0.45μm濾過で滅菌)
希釈剤 水(シプロフロキサシンがあまり溶けない場合、1〜2滴の濃乳酸添加)。
使用濃度 0.1μg/ml クリンダマイシンおよび10μg/ml シプロフロキサシン
正の選択 ラクトバチルス・アシドフィルス群
負の選択 ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ビフィドバクテリウム属、ラクトコッカス属およびストレプトコッカス・サーモフィルス。
保存:シプロフロキサシンについて1.5ml量を−20℃で最長6ヶ月まで(クリンダマイシンは測定せず)。
原液 1mg/ml(0.45μm濾過で滅菌)
希釈剤 水
使用濃度 0.1μg/ml
正の選択 MIC>1の株(例えばビフィドバクテリウム・ロングムPCB133)
負の選択 ストレプトコッカス・サーモフィルス(例えばYO8)およびMIC≦0.016の他の株。
保存:1.5ml量を−20℃で最長2年まで。
原液 10mg/ml(0.45μm濾過で滅菌)
希釈剤 水
使用濃度 100μg/ml
正の選択 MIC>256の株(例えばLGG、LPC08、LC01)
負の選択 LP01、LP02、ラクトバチルス・アシドフィルス群およびMIC<24の他の感受性株。
保存:1.5ml量を−20℃で最長2年まで。
原液 10mg/ml(0.45μm濾過で滅菌)
希釈剤 水
使用濃度 50μg/ml
正の選択 ビフィドバクテリウム属
負の選択 ラクトバチルス属。
保存:1.5ml量を−20℃で最長6ヶ月まで
原液 10mg/ml(0.45μm濾過で滅菌)
希釈剤 水(シプロフロキサシンがあまり溶けない場合、1〜2滴の濃乳酸添加)
使用濃度 5μg/ml
正の選択 LP02
負の選択 LF10。
保存:1.5ml量を−20℃で最長6ヶ月まで
8.5.1 滅菌ピペットを使用して1mlの一次希釈をまたは液体であるならばサンプル培養から直接1mlを、9mlの無菌希釈剤を含む試験管に移す;
8.5.2 ピペットを初期懸濁液に1cmより深く入れない;
8.5.3 各希釈後にピペットを交換;
8.5.4 希釈物をメカニカル・シェーカーで徹底的に均質化し、試験管を3回、5秒以上の時間ボルテックス処理し、10−2の希釈を得る;
8.5.5 希釈10−2を使用してこれらの工程を反復し、プレートで培養したとき、相当数のコロニーを生じる微生物の濃度が得られるまでさらに希釈する;
2連続10進希釈(例えば:10−8、10−9)の播種は、10〜300の間の細胞数を含む2個の連続的希釈が見られることを可能にしなければならない。サンプルに含まれる細胞数について明確に理解していないならば、2連続を超える10進希釈(例えば:10−5、10−6、10−7、10−8、10−9、10−10)を播種し、10〜300の間に入る数のコロニーを生じるもののみを考慮する。
サンプル再構成から、連続希釈がペトリ皿上の培養培地と接触する時(8.6)までの時間は30分を超えてはならないことに注意すべきである
ΣCは全プレート上で計数されたコロニーの合計であり
n1は第一希釈で計数されたプレートの数であり
n2は第二希釈で計数されたプレートの数であり
dは第一の計数をした希釈である
希釈10−8のプレート:250
希釈10−9のプレート: 23
結果:
a) LAPTg培地のみを用いて調製したこのシリーズのプレートから得られた数は分析に付したサンプル中のプロバイオティクス細菌の総負荷を表し;
b) 選択剤を添加したLAPTg培地を用いて調製したシリーズのプレートから得られた数は、選択剤として該培地に添加された特定の物質の存在下で複製できる株の負荷を表し;
c) 選択的培地を用いて得た個々のプロバイオティクス株に関する数から、LAPTgでの総数(a参照)との差異を計算することにより、選択剤存在下で発育しなかった残りの株の数を導くことが可能であり;
d) HHD培地への播種により、混合してサンプルに存在する異なる株を目視により区別し、LAPTg培地で選択的に数えることが可能となる。
アロエ試験:殺菌率は5%に等しいと判明した。
クエン酸試験:殺菌率は2%に等しいと判明した。
アラビノガラクタン試験:判明した殺菌率は6%に等しい。
ラズベリー香味料試験:判明した殺菌率は2%に等しい。
ラズベリー香味料試験:判明した殺菌率は26%に等しい。
ブルーベリー試験:判明した殺菌率は5%に等しい。
二酸化ケイ素試験:判明した殺菌率は50%に等しい。
二酸化ケイ素試験:判明した殺菌率は28%に等しい。
二酸化ケイ素試験:判明した殺菌率は23%に等しい。
タラガム試験:判明した殺菌率は14%に等しい。
ビタミンB1、B2およびB6試験:判明した殺菌率は33%に等しい。
ゼオライト試験:判明した殺菌率は2%に等しい。
Claims (8)
- 無毒食品または医薬品原材料を産生する方法であって、該原材料を予め確立された細菌負荷のプロバイオティクス細菌株と接触させて置く第一工程および該プロバイオティクス細菌株に対して該原材料が発揮する毒性による該細菌負荷の減少を決定する第二工程を含む、方法。
- 該第一工程が
− 予め確立された濃度、好ましくは1×106〜1×109CFU/gに入る濃度のプロバイオティクス細菌株マーカー、該プロバイオティクス細菌株の増殖用の最適培養基質および試験する食品または医薬品原材料を含む第一試験サンプルおよび
− 該第一サンプルと同じ予め確立された濃度の同じプロバイオティクス細菌株、該プロバイオティクス細菌株の増殖用の最適培養基質および試験する食品または医薬品原材料を含む第二試験サンプル(内部標準)
の調製を含む、請求項1に記載の方法。 - 該第二工程が該第一および該第二試験サンプルの細菌数計数の実施を含む、請求項1に記載の方法。
- 該細菌数計数を、初期サンプルを再懸濁する工程、適当な希釈剤での連続希釈を製造する工程、寒天培地に播種する工程および最適条件下でインキュベーション後にコロニーを計数する工程を含む方法により実施する、請求項3に記載の方法。
- 該第一試験サンプルの細菌数(プレート上で数えられた細胞の数)対該第二試験サンプル(内部標準)の細菌数(プレート上で数えられた細胞の数)の比を決定する、請求項4に記載の方法。
- プロバイオティクス細菌に対する毒性のマーカーとして使用するプロバイオティクス細菌株をラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属から選択する、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 該食品または医薬品原材料が香味料、抽出物、有機および/または無機起源の補助剤、科学技術添加物、ビタミン類、タンパク質、アミノ酸類、ペプトン類、天然および/または合成ポリマー類およびその他からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の無毒食品または医薬品原材料の製造方法を使用して、選択したプロバイオティクス細菌に対して毒性がない原材料を含む、食品または栄養補助食品または医療用品または医薬製品を製造する方法。
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