ITMI20131280A1 - Produzione di materie prime e prodotti finiti atossici testati mediante un metodo innovativo a base di batteri probiotici per la determinazione della tossicità verso i batteri probiotici. - Google Patents

Produzione di materie prime e prodotti finiti atossici testati mediante un metodo innovativo a base di batteri probiotici per la determinazione della tossicità verso i batteri probiotici.

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ITMI20131280A1
ITMI20131280A1 IT001280A ITMI20131280A ITMI20131280A1 IT MI20131280 A1 ITMI20131280 A1 IT MI20131280A1 IT 001280 A IT001280 A IT 001280A IT MI20131280 A ITMI20131280 A IT MI20131280A IT MI20131280 A1 ITMI20131280 A1 IT MI20131280A1
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probiotic bacteria
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toxicity
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Description

DESCRIZIONE dell'invenzione avente per titolo: "Produzione di materie prime e prodotti finiti atossici testati mediante un metodo innovativo a base di batteri probiotici per la determinazione della tossicità verso i batteri probiotici."
La presente invenzione si riferisce a un metodo per la produzione di materie prime e di prodotti finiti indirizzati all'industria alimentare e farmaceutica privi di ogni tossicità rilevabile mediante un metodo innovativo, a base di batteri probiotici, di analisi della tossicità dei batteri probiotici.
Sono considerate materie prime tutti quei materiali o sostanze che sono alla base per la fabbricazione e produzione di altri beni tramite l'utilizzo di opportune lavorazioni e processi industriali che permettono di ottenere il prodotto finale desiderato.
Tra le materie prime utilizzate nella produzione di prodotti alimentari o integratori o dispositivi medici o prodotti farmaceutici vi sono, a titolo di esempio, gli aromi, gli estratti, i co-formulanti di origine organica e/o inorganica, gli additivi tecnologici, le vitamine, le proteine, gli amminoacidi, i peptoni, i polimeri naturali e/o di sintesi e altro ancora.
Ad esempio a titolo indicativo e, pertanto, non esaustivo, gli aromi e/o gli estratti possono essere preparati dalle piante e/o dai loro frutti.
È noto che le piante da frutto e i frutti stessi sono trattati oggigiorno, ad esempio, con sostanze chimiche al fine di preservarli dagli attacchi dei microorganismi o dei funghi o degli insetti in modo da consentire la crescita dei frutti sino ad arrivare alla loro maturazione per poi essere raccolti e consumati.
È altresì noto che a seguito di detti trattamenti, una parte delle sostanze chimiche utilizzate rimane adsorbita sulla superficie esterna del frutto, chiamata comunemente buccia o scorza. Le sostanze chimiche che sono adsorbite persistono anche a seguito di successivi lavaggi del frutto con acqua.
La buccia (Esocarpo) è lo strato protettivo esterno di un frutto (epidermide, formata a sua volta da cuticola e tessuto sclerenchimatico) o di un vegetale che può essere staccata. Lo strato protettivo esterno viene chiamato impropriamente anche scorza.
Inoltre, non si può escludere che una parte di sostanze chimiche adsorbite sulla superficie esterna del frutto possa penetrare all'interno del frutto stesso (nella polpa) a seguito di un assorbimento di dette sostanze chimiche dall'esterno verso l'interno del frutto.
Una parte dei frutti raccolti sono oggigiorno utilizzati per produrre estratti e/o aromi naturali vegetali (materie prime) che trovano impiego nell’industria alimentare, farmaceutica e nutraceutica.
Di solito, gli estratti e/o aromi naturali vegetali sono ottenuti mediante estrazione meccanica e/o chimica dei frutti interi (buccia e polpa) o della buccia e/o polpa trattati separatamente, mediante le apparecchiature e/o le tecniche note all'esperto del settore.
Ad esempio, nel caso di aromi e/o estratti e/o composti organici ottenuti per estrazione con solventi, può accadere che anche eseguendo alcune fasi di lavaggio con acqua e/o solventi chimici non si riesca ad eliminare completamente tutto il solvente utilizzato, da qui la presenza anche minima di solvente che può provocare tossicità ai batteri probiotici.
Pertanto, sarebbe auspicabile poter disporre di un metodo avente un'elevata sensibilità in grado di poter individuare sino a quando vi è una tossicità che residua in una determinata sostanza o materia prima al fine di programmare le fasi di purificazione o di lavaggio o di precipitazione da impiegare per rendere tale materia prima priva di tossicità ai batteri probiotici.
Lo stesso dicasi con riferimento ad un estratto proteico o con riferimento alla preparazione di amminoacidi. Anche in questo caso, si utilizzano reagenti e/o solventi chimici che possono residuare e provocare una tossicità ai batteri probiotici.
Lo stesso problema si può presentare anche con riferimento a materie prime inorganiche quali ad esempio il biossido di silicio molto utilizzato per formulare prodotti finiti.
Sia con riferimento agli estratti e/o aromi naturali vegetali ottenuti mediante estrazione meccanica e/o chimica che con riferimento ad altre materie prime sopra citate, preparate mediante processi di sintesi e/o di estrazione, non si può prescindere dal fatto che vi possano residuare all "interno della materia prima delle quantità minime di sostanze o composti dotate di una valenza "tossica" che impartiscono una certa tossicità intrinseca alla materia prima stessa.
Pertanto, sia con riferimento agli estratti e/o aromi naturali vegetali che con riferimento ad altre materie prime sopra citate, non si può escludere la presenza di sostanze tossiche al loro interno in una quantità variabile che può dipendere dal tipo di coltivazione adottato per il frutto e/o dalle condizioni operative adottate per eseguire l'estrazione meccanica e/o chimica .
In ogni caso, le sostanze tossiche eventualmente presenti negli estratti e/o aromi naturali vegetali e/o materie prime in genere possono dare luogo a due tipi di problemi: uno indiretto e uno diretto.
Il primo problema, indiretto, è relativo all'influenza che l'assunzione di dette sostanze tossiche può avere sull'alterazione della microflora probiotica intestinale e, quindi, anche sulla fisiologia del sistema digestivo a tal punto da influire sull'assorbimento delle vitamine, dei peptidi bioattivi e dei metaboliti, e permettere altresì la produzione di ammine biogene dannose, note per alterare la permeabilità intestinale e per creare tutta una serie di problemi salutistici sino ad arrivare alla produzione di nitrosamine note sostanze cancerogene, dette ammine biogene essendo prodotte da quei ceppi che hanno trovato giovamento da questa alterazione .
A tale riguardo vi è da evidenziare che, se la flora batterica probiotica viene alterata, a seguito di un aumento della colonizzazione dei batteri patogeni coliformi, quali ad esempio E. coli dotati di proprietà decarbossilanti in grado di trasformare un amminoacido in un'ammina mediante l'eliminazione del gruppo carbossilico, si vengono a produrre quantità abnormi di ammine biogene dannose.
Inoltre, uno squilibrio della microflora intestinale sembra in grado di contribuire all'insorgere di diverse patologie: diabete, malattie autoimmuni o, come è stato ipotizzato, avere un ruolo nella risposta immunitaria sbilanciata, locale e sistemica, a certi allergeni alimentari .
Il secondo problema, diretto, interessa gli effetti che dette sostanze tossiche, già in grado di uccidere le cellule di batteri probiotici, potrebbero avere nei soggetti in età pediatrica o in fase di sviluppo per un'azione tossica, immediata e/o di accumulo, non solo nei confronti delle cellule batteriche ma anche nei confronti delle cellule eucariote, particolarmente sensibili in fase di differenziazione e crescita.
Pertanto rimane la necessità, per poter produrre materie prime e prodotti finiti in modo sicuramente atossico, di poter disporre di un metodo per la determinazione della tossicità di un estratto e/o un aroma e/o una materia prima in genere che sia sicuro, semplice e pratico da utilizzare, economico e ripetibile.
In particolare, rimane la necessità di poter disporre di un metodo per la determinazione della tossicità verso i batteri probiotici dei singoli ingredienti che compongono un prodotto finito quale un alimento, un integratore, o un dispositivo medico o un farmaco.
La Richiedente ha trovato un modo innovativo, per produrre materie prime e prodotti finiti atossici, sottoponendo gli estratti e/o gli aromi e/o le materie prime in genere a un nuovo test di tossicità al fine determinarne la loro tossicità verso i batteri probiotici .
Forma oggetto della presente invenzione un metodo di produzione di materie prime e prodotti finiti atossici, grazie alla possibilità, messa a punto dalla Richiedente, di poter determinare la tossicità verso i batteri probiotici presente in dette materie prime e prodotti finiti mediante un metodo innovativo che forma anch'esso oggetto della presente invenzione.
La Richiedente ha riscontrato che la tossicità determinata con il metodo della presente invenzione dipende non solo dalla materia prima in sé utilizzata, ma anche, e soprattutto, dal tipo di estrazione meccanica e/o chimica utilizzata per produrre detta materia prima. Infatti, l'estrazione chimica di una materia prima può prevedere l'impiego di solventi chimici, alcune fasi di lavaggio o di precipitazione che possono residuare una tossicità nella materia prima stessa.
La metodica prevede una fase nella quale il ceppo di batteri probiotici (marker di tossicità) viene messo a contatto con una materia prima da testare utilizzando un quantitativo di materia prima pari a quello normalmente utilizzato nel formulato.
In pratica si prepara un primo campione che comprende il ceppo di batteri probiotici (marker di tossicità), il substrato culturale ottimale di crescita di detto ceppo batterico probiotico e la materia prima da testare.
Poi, si prepara un secondo campione (riferimento interno) che comprende lo stesso ceppo di batteri probiotici utilizzato in detto primo campione (marker di tossicità) e il solo substrato culturale ottimale di crescita (senza la materia prima da testare).
La determinazione viene eseguita mediante una conta batterica in piastra di detto primo campione e di detto secondo campione, come di seguito riportato.
Il rapporto tra la carica batterica (numero di cellule contate in piastra) di detto primo campione e la carica batterica (numero di cellule contate in piastra) di detto secondo campione fornisce un numero minore di 1 che, se espresso in percentuale, fornisce la carica batterica che è sopravvissuta al contatto con la materia prima e, quindi, esprime anche la % di mortalità indotta da detta materia prima al ceppo di batteri probiotici utilizzati come marker.
Una prima realizzazione si riferisce alla determinazione della tossicità di una materia prima quale ad esempio un estratto e/o un aroma vegetale naturale e/o materia prima in genere.
In questo caso, il test di tossicità verso i batteri probiotici prevede l'allestimento in laboratorio di due prove, come sopra descritto.
In pratica si prepara un primo campione che comprende il ceppo di batteri probiotici (marker di tossicità) , il substrato culturale ottimale di crescita di detto ceppo batterico probiotico e la materia prima da testare.
Poi, si prepara un secondo campione (riferimento interno) che comprende lo stesso ceppo di batteri probiotici utilizzato in detto primo campione (marker di tossicità) e il solo substrato culturale ottimale di crescita (senza la materia prima da testare).
La determinazione viene eseguita mediante una conta batterica in piastra di detto primo campione e di detto secondo campione, come di seguito riportato.
Preferibilmente, detta prima e seconda prova vengono svolte in parallelo alle stesse condizioni operative.
Il rapporto tra la carica batterica (numero di cellule contate in piastra) di detto primo campione e la carica batterica (numero di cellule contate in piastra) di detto secondo campione fornisce un numero minore di 1 che, se espresso in percentuale, fornisce la carica batterica che è sopravvissuta al contatto con la materia prima e, quindi, esprime anche la % di mortalità indotta da detta materia prima al ceppo di batteri probiotici utilizzati come marker.
La differenza tra la conta batterica eseguita su detta prima prova e la conta batterica eseguita su detta seconda prova fornisce una percentuale di mortalità dei batteri che fornisce un'indicazione della tossicità verso i batteri probiotici relativa a detta materia prima .
La Richiedente, a titolo esemplificativo e pertanto non esaustivo, ha testato alcuni aromi ed estratti presenti sul mercato come, ad esempio, l'aroma di limone e di mirtillo che sono impiegati anche per la preparazione di prodotti finiti. Lo scopo di questi test era quello di verificare se detti alimenti o materie prime (aromi di limone e di mirtillo) possedevano una loro tossicità intrinseca verso i batteri probiotici.
Per questo motivo, dette materie prime (aromi di limone e di mirtillo) sono state posti a contatto con determinati ceppi di batteri lattici o bifidi batteri probiotici, in particolari condizioni operative.
I ceppi di batteri probiotici utilizzati come marker di tossicità nel metodo della presente invenzione appartengono alla specie scelta dai gruppi comprendenti lattobacilli e bifido batteri, preferibilmente probiotici .
Forme preferite prevedono l'impiego di un ceppo di batteri tra quelli elencati in Tabella 1.
I test eseguiti su detti alimenti o materie prime (aromi di limone e di mirtillo) hanno mostrato una tossicità acuta nei confronti dei ceppi di batteri probiotici utilizzati come marker di tossicità. In pratica, sono stati testati due estratti di limone (materia prima) e due estratti di mirtillo (materia prima), provenienti da fornitori diversi. Si è potuto verificare che un primo estratto di limone e un secondo di mirtillo provocavano una tossicità acuta, 57% e 58% di mortalità rispettivamente, nei confronti dei ceppi di batteri probiotici impiegati aventi una carica teorica iniziale di 6xl0<9>CFU/g. Le prove sono state eseguite utilizzando il ceppo di batteri probiotici Lactobacillus acidophilus LA02 LMG P-21381 depositato dalla società Anidral Srl il 31.01.2002, e il ceppo di batteri probiotici Bifidobacterium animalis subsp. Lactis BS01 LMG P-21384 depositato dalla società Anidral Srl il 31.01.2002.
A questo punto la Richiedente ha replicato le suddette prove utilizzando, al posto degli aromi di mirtillo e di limone presenti sul mercato, degli aromi ottenuti solo dalla polpa dei frutti (limone e mirtillo) mediante una blanda spremitura. In pratica, sia nel caso del limone che del mirtillo, la buccia è stata preventivamente separata dalla polpa e solo quest 'ultima è stata sottoposta ad una estrazione meccanica in condizioni blande, secondo apparecchiature e metodiche note all'esperto del settore. In questo, con gli estratti/materie prime ottenute da un'estrazione della polpa in condizioni blande, la tossicità verso i batteri probiotici rilevata è risulta essere inesistente, infatti utilizzando una carica iniziale del ceppo di batteri probiotici pari a 6,7xl0<9>UFC/g si è ottenuto con il succo di mirtillo 6,5xl0<9>UFC/g e con il succo di limone 6,4xl0<9>UFC/g, quindi valori molto migliori rispetto al caso precedente con una tossicità molto bassa e una mortalità prossima allo zero.
Allo stesso modo dell'estratto di limone e di mirtillo sono state testate altre materie prime come di seguito riportato.
La Richiedente ha testato alcuni prodotti finiti presenti sul mercato al fine di determinare il grado di tossicità verso i batteri probiotici e individuare, tra le materie prime usate in detti prodotti finiti, quali tra le materie prime utilizzate contribuivano in maggior misura alla tossicità.
In una realizzazione preferita, si procede con la determinazione della tossicità verso i batteri probiotici di una materia prima, quale ad esempio un estratto e/o un aroma, che si trova all "interno di un formulato avente, ad esempio 5 componenti in totale, di un prodotto finito.
In questo caso, il test di tossicità prevede l'allestimento in laboratorio di un numero di prove pari a quello dei componenti, in questo caso esemplificativo ci sono 5 componenti, più il riferimenti di analisi.
Al fine di mostrare la potenzialità della presente invenzione, la Richiedente ha testato una serie di campioni di estratto di mirtillo rosso (Cranberry) da utilizzarsi nella preparazione di un prodotto finito, ad esempio PI.
È stata determinata la tossicità della materia prima, estratto di mirtillo rosso -Cranberry (lotto LI, lotto L2 , provenienti da quattro fornitori diversi) che dovrà essere presente assieme ad altri componenti/ingredienti all'interno di un prodotto finito (PI).
In questo caso, sono state allestite due prove. In una prima prova, è stata preparata una miscela costituita dal ceppo di batteri probiotici, ad esempio LS01 (utilizzato come marker di tossicità) . Questa prima prova rappresenta il riferimento interno dell'analisi -Rif. 1. La carica batterica teorica attesa è pari a 25 MLD/ dose (riferimento interno).
In una seconda prova, è stata preparata una miscela contenente il ceppo di batteri probiotici LS01 (utilizzato come marker di tossicità) assieme con un primo estratto di mirtillo rosso -LI e L2, in detto prodotto finito, proveniente da fornitori diversi.
Detta prima e seconda conta batterica sono state svolte in parallelo alle stesse condizioni operative e con gli stessi quantitativi di quelli presenti in detto prodotto finito .
Successivamente è stata determinata la conta batterica reale di detta prima prova -Rif. 1 e la conta batterica di detta seconda prova. La conta batterica è stata eseguita adottando le stesse condizioni operative.
Fornitore V: lotto 1 (LI) e lotto 2 (L2) -mirtillo Var Fornitore V: lotto 1 (LI) e lotto 2 (L2) -mirtillo Var Fornitore K: lotto 1 (LI) e lotto 2 (L2) -mirtillo Kem Fornitore K: lotto 1 (LI) e lotto 2 (L2) -mirtillo Kem Fornitore N: lotto 1 (LI) e lotto 2 (L2) -mirtillo Pac Fornitore N: lotto 1 (LI) e lotto 2 (L2) -mirtillo Pac Fornitore N: lotto 1 (LI) e lotto 2 (L2) -mirtillo Nut Fornitore N: lotto 1 (LI) e lotto 2 (L2) -mirtillo Nut
Le varie forniture di materia prima Cranberry (lotti) sono state introdotte nella miscela per i test di tossicità in funzione del loro contenuto di proantocianidine (almeno 1,5% (HPLC) ), in modo da garantire la stessa concentrazione di tale ingrediente nel prodotto finito PI.
Tabella 2
Miscela da testare Lotto Carica % mortalità MLD/dose vs Rif. 1
Ceppo di batteri 25
LS01 (carica reale -Rif. 1)
Miscela: ceppo di LI 1,2 95 batteri LS01+
estratto di mirtillo
Var [Fornitore V]
Miscela: ceppo di L2 0,9 96 batteri LS01
estratto di mirtillo
Var [Fornitore V]
Miscela: ceppo di LI 0,8 97 batteri LS01
stratto di mirtillo
Kem [Fornitore K]
Miscela: ceppo di L2 2 91 batteri LS01
stratto di mirtillo
Kem [Fornitore K]
Ceppo di batteri 22
S01 (carica reale -Rif. 1)
Miscela: ceppo di LI 20 9 batteri LS01
stratto di mirtillo
Pac [Fornitore P]
Miscela: ceppo di L2 20 9 batteri LS01
stratto di mirtillo
Pac [Fornitore P]
Ceppo di batteri 20
S01 (carica reale -Rif. 1)
Miscela: ceppo di LI 14 30 batteri LS01
estratto di mirtillo
Nut [Fornitore N]
Miscela: ceppo di L2 9 55
batteri LS01
estratto di mirtillo
Nut [Fornitore N]
Le prove di cui alla Tabella 2 sono state anche ripetute con i ceppi di batteri probiotici riportati alla Tabella I con i numeri 9, 33, 39, 46, 54, 59, 73, 84, 95, 101, 116, 130, 138, 143, 169 e 185 ottenendo risultati molto simili a quelli riportati in detta Tabella 2.
La differenza tra la conta batterica eseguita su detta prima prova -Rif.l e la conta batterica eseguita su detta seconda prova fornisce una percentuale di mortalità del ceppo di batteri probiotico LS01 che fornisce un'indicazione della tossicità relativa a detto estratto di mirtillo nei confronti di detto ceppo.
La carica in cellule vitali, ottenuta dalla conta batterica, determinata in detta prima prova e in detta seconda prova permette di stabilire se la materia prima testata esercita un effetto tossico sulle cellule del ceppo di batteri probiotici LS01 presente in detto prodotto finito PI.
II decremento percentuale della carica batterica rispetto al riferimento -Rif.l è espresso come mortalità % indotta dalla materia prima oggetto del test di tossicità della presente invenzione.
La Richiedente ha applicato il metodo sopra descritto anche a un estratto di limone e mirtillo (Blueberry), presenti in un prodotto finito, ottenendo risultati comparabili a quelli sopra ottenuti con il Cranberry.
La Tabella 2 mostra che vi sono degli estratti, ad esempio estratto di mirtillo che è comunemente impiegato per formulare prodotti finiti, ma la stessa considerazione vale anche con riferimento ad altre materie prime, che conferiscono tossicità ai prodotti finiti e, di conseguenza, anche all'organismo dei soggetti che utilizzano detti prodotti finiti.
Pertanto, con la presente invenzione è possibile mettere a punto le formulazioni di prodotti finiti quali integratori alimentari o dispositivi medici o prodotti farmaceutici privi di tossicità o con una tossicità molto ridotta in quanto è possibile individuare se le materie prime utilizzate conferiscono tossicità verso i batteri probiotici.
Nel contesto della presente invenzione un decremento percentuale della carica batterica rispetto al riferimento interno [(Conta batterica del campione di analisi) /(Conta batterica del riferimento interno)] mortalità % indotta dalla materia prima compresa da 1 a 5% significa nessuna mortalità; un valore compreso da maggiore di 5 a 15% significa una mortalità bassa, ma ancora accettabile; un valore compreso da maggiore di 15 a 25% significa mortalità media-alta, mentre oltre il 25 % siamo di fronte a una mortalità acuta.
Il metodo della presente invenzione trova valida applicazione, per esempio, per testare la presenza di eccipienti o materie prime tossiche, utilizzate nei formulati di integratori e dispositivi medici (prodotti finiti) , come ad esempio aroma arancio, cartamo, carota nera, estratto di mirtillo etc.).
Il metodo della presente invenzione è di seguito illustrato a scopo esemplificativo e, pertanto, non limitativo della portata della presente invenzione.
In una realizzazione preferita, nel caso di un prodotto finito contenente ad esempio i seguenti componenti A, B, C (formulato completo A+B+C) si può utilizzare il metodo della presente invenzione al fine di determinare se il prodotto finito nel suo insieme (A+B+C) esplica una tossicità nei confronti dei ceppi di batteri probiotici.
In questo caso, il test di tossicità verso i batteri probiotici prevede l'allestimento in laboratorio di due prove .
In pratica si prepara un primo campione che comprende il ceppo di batteri probiotici (marker di tossicità), il substrato culturale ottimale di crescita di detto ceppo batterico probiotico e la materia prima da testare, in questo caso il formulato A+B+C.
Poi, si prepara un secondo campione (riferimento interno) che comprende lo stesso ceppo di batteri probiotici utilizzato in detto primo campione (marker di tossicità) e il solo substrato culturale ottimale di crescita (senza la materia prima da testare).
La determinazione viene eseguita mediante una conta batterica in piastra di detto primo campione e di detto secondo campione.
Preferibilmente, detta prima e seconda prova vengono svolte in parallelo alle stesse condizioni operative.
Se il rapporto tra la carica batterica (numero di cellule contate in piastra) di detto primo campione e la carica batterica (numero di cellule contate in piastra) di detto secondo campione fornisce un numero minore di 1, ad esempio 0,55 (o 55%), vuole dire che la carica batterica che è sopravvissuta al contatto con la materia prima è del 55% e, quindi, la % di mortalità indotta da A+B+C al ceppo di batteri probiotici utilizzati come marker è del 45%.
Se emerge appunto una tossicità nei confronti del ceppo di batteri probiotici utilizzato come marker, il passo successivo è quello di andare a determinare quale, tra i componenti A, B e C che compongono il prodotto finito (A+B+C), esercita la tossicità riscontrata.
In questo caso, il metodo prevede la preparazione di tre prove (prova 1, prova 2 e prova 3) come indicato sotto.
Ad esempio, la prova 1 viene eseguita sulla materia prima A e prevede l'allestimento dei seguenti campioni:
(i) Si prepara un primo campione che comprende il ceppo di batteri probiotici (marker di tossicità), il substrato culturale ottimale di crescita di detto ceppo batterico probiotico e la materia prima da testare, in questo caso A.
(ii) Si prepara un secondo campione (riferimento interno) che comprende lo stesso ceppo di batteri probiotici utilizzato in detto primo campione (marker di tossicità) e il solo substrato culturale ottimale di crescita (senza la materia prima da testare).
(iii) Si procede con una conta batterica in piastra di detto primo campione e di detto secondo campione.
(iv) Si calcola la percentuale di mortalità.
Analogamente con la stessa metodica vengono preparate la prova 2 con la materia prima B e la prova 3 con la materia prima C.
In questo modo è possibile individuare chi, tra i componenti A, B e C presenti nel formulato A+B+C, è il componente che esplica la tossicità nei confronti dei ceppi di batteri probiotici. I test di tossicità vengono eseguiti alle stesse condizioni operative e alle concentrazioni indicate nel prodotto finito -approccio sequenziale .
Per la conta in piastra si segue il metodo, riportato di seguito a titolo esemplificativo e non limitativo di un metodica analitica, che prevede una tradizionale conta microbiologica con risospensione iniziale del campione, diluizioni seriali in opportuno diluente, piastramento in terreno agarizzato e conta delle colonie dopo incubazione nelle condizioni ottimali. Sono da ritenere conformi (ridotta tossicità o non tossicità alcuna) gli eccipienti/materie prime che determinano una mortalità in piastra confrontabile con quello del campione di riferimento .
Come detto sopra si applica una conta totale, differenziale e/o selettiva in terreno agarizzato, di batteri lattici e bifidobatteri ad uso probiotico, presenti da soli o in miscela nel campione da sottoporre alla determinazione del titolo in cellule vive e vitali.
La formulazione del medium colturale è tale da garantire 10 sviluppo di tutte le varie specie di batteri probiotici appartenenti ai suddetti gruppi microbici e nel caso consentirne la discriminazione attraverso l'aggiunta al medium di agenti selettivi (generalmente antibiotici e/o zuccheri) o differenziali (generalmente indicatori dì viraggio pH e/o ossidoriduzione).
11 metodo prevede l'utilizzo del terreno agarizzato LAPTg, la cui formulazione consiste unicamente nella presenza di due differenti fonti azotate, di uno zucchero, quale fonte di carbonio, e di estratto di lievito quale fonte di vitamine del gruppo B e fattori di crescita. L'assenza di sali organici, inorganici e di sostanze ad azione selettiva consente una crescita rigogliosa di tutte le varie specie di batteri probiotici appartenenti al genere Lactobacillus e Bif idobacterium .
Addizionando un agente selettivo e/o differenziale al LAPTg agar è possibile effettuare conte differenziate dei probiotici presenti in una miscela complessa. Gli agenti selettivi (generalmente antibiotici e/o zuccheri) o differenziali (generalmente indicatori di viraggio pH e/o ossidoriduzione) sono scelti, caso per caso, sulla base delle specifiche caratteristiche genotipiche e fenotipiche dei ceppi costituenti la miscela.
Nel caso in cui il campione da analizzare sia costituito da una miscela di due o più ceppi di lattobacilli e bif idobatteri è consigliabile affiancare alla conta selettiva in LAPTg una valutazione qualitativa dei ceppi costituenti la miscela utilizzando il terreno HHD. Per ulteriori dettagli, riferimento viene fatto ai seguenti articoli scientifici
Molecular Cloning a Laboratory Manual (Sambrook, Fritsch, Maniatis) ;
- Susceptibility of Lactobacillus spp. To antimicrobìal agents. M. Danielsen A. Wind. 2002;
Antibiotic Susceptibility of Lactobacillus and Bifidobacterium species from Human Gastrointestinal tract , S. Delgrado A.B. Florez B. Mayo, 2005;
- ISO 6887-1:2000
Preparazione terreno LAPTg : FONT DE VALDEZ, G, e coll. : Influence of thè recovey medium on thè viability of injured freeze-dried lactic acid bacteria Mìlchwissenschaft 40 (9) 518-520 (1985).
- UNI EN ISO 6887-1:2000 "Acqua peptonata tamponata"
A differential medium for thè enumeration of homofermentative and heterofermentative lactic acid bacteria . LC. McDonald R.F. McFeeters, M.A. Daeschel and HP Felming, Applied and Enviromental Microbiology. June 1987: 1382-1384.
Sigle e abbreviazioni:
- titolo in cellule vive e vitali = n° di cellule/unità (g o mi) in grado di crescere nel mezzo colturale, formando colonie distinte (UFC/g o mi)
- UFC/g o mi = Unità Formanti Colonia ovvero unità di misura del titolo in cellule vive e vitali
- MIC = Minima Concentrazione Inibente
Il metodo prevede l'utilizzo del terreno agarizzato LAPTg, la cui formulazione consiste unicamente nella presenza di due differenti fonti azotate, di uno zucchero, quale fonte di carbonio, e di estratto di lievito quale fonte di vitamine del gruppo B e fattori di crescita. L'assenza di sali organici ed inorganici e di sostanze ad azione selettiva consente una crescita rigogliosa di tutte le varie specie di batteri probiotici appartenenti al genere Lactobacillus e Bifidobacterium. Addizionando un agente selettivo e/o differenziale al LAPTg agar è possibile effettuare conte differenziate dei probiotici presenti in una miscela complessa. Gli agenti selettivi (generalmente antibiotici e/o zuccheri) o differenziali (generalmente indicatori di viraggio pH e/o ossidoriduzione) sono scelti, caso per caso, sulla base delle specifiche caratteristiche genotipiche e fenotipiche dei ceppi costituenti la miscela (vedi 8.2). Nel caso in cui il campione da analizzare sia costituito da una miscela di due o più ceppi di lattobacilli, bifidobatteri è consigliabile affiancare alla conta selettiva in LAPTg una valutazione qualitativa dei ceppi costituenti la miscela utilizzando il terreno HHD.
Materiali e reagenti:
Medium LAPTg, Medium Base:
- Bacto Peptone (idrolizzato proteine animali) g 15 - Tryptone (idrolizzato pancreatico di caseina) g 10 - Estratto di lievito g 10
- Tween 80 mi 1
- Agar g 15
- Acqua distillata q.b. a mi 900
Nota: le pesate sopraindicate sono intese con una accuratezza del 5%
Sciogliere i componenti nell'acqua distillata, eccetto l'agar. Controllare il pH ed eventualmente correggere a 6,55+0,05, quindi addizionare l'agar e sciogliere in bagnomaria. Dispensare il terreno ancora caldo nei bibby, e sterilizzare in autoclave a 121°C per 15 minuti; il pH dopo sterilizzazione dovrà essere 6,5+0,5 a 25°C±1.
Medium completo:
Al momento dell'uso, dopo scioglimento (8.1), addizionare al terreno base un volume di una soluzione di glucosio al 10%, sterilizzata per filtrazione, tale da avere una concentrazione finale di glucosio pari a 10 g / litro.
Medium HHD :
Fruttosio 2,50 g
KH2P04 2,50 g
Bacto Tryptone 10.00 g
Soytone Peptone 1,50 g
Casamino acids 3.00 g
Estratto di lievito 10,00 g
Tween 80 1,00 g Bromocresolgreen 20,00 ml
Agar 20,00 g
Acqua distillata 1000ml
pH finale = 6,90 0,10.
Etanolo, filtri per siringa 0.45μιη sterili monouso, Minisart, diluenti per la ricostituzione dei campioni: Ricostituzione di colture batteriche liquide ed allestimento diluizioni decimali seriali Soluzione fisiologica peptonata
- bacto peptone g 1,0
- cloruro di sodio (NaCl ) g 8,5 g
- acqua distillata q.b. a ml 1000 Ricostituzione di colture batteriche anidre (liofilizzati) e prodotti finiti con probiotici in forma libera (non micro incapsulati).
Colture batteriche liofilizzate non confezionate in dosi o unità
Buffer fosfato pH 6,8
- cloruro di sodio (NaCl ) g 5,00
- KH2P04g 3,78
- Na2HP04g 4,77
- acqua distillata q.b. a ml 1000
Bustine, capsule, compresse, tablets, ovuli e sottotappi di flaconcini:
Buffer fosfato pH 6,8
- cloruro di sodio (NaCl ) g 5,00
- KH2P04g 3,78
- Na2HP04g 4,77
- acqua distillata q.b. a mi 1000 Sciogliere i componenti in acqua distillata, riscaldando se necessario. Verificare che il pH sia 6,8±0,10. Dispensare i diluenti in bibby, sterilizzare in autoclave a 121°C per 15 minuti, conservare al buio e a temperatura di 4-5°C, per non più di un mese.
Nel caso in cui i prodotti finiti contenessero oli e/o sostanze lipidiche è necessario addizionare al buffer pH 6.8 (5.5.2.1) l'l% di Tween 80.
Kit per anareobiosi (AnaeroGEN - Oxoid) : lega chimicamente ossigeno sviluppando C02; siringhe piccole da 10ml, non sterili acquistabili anche in farmacia; soluzione L-cisteina HCl al 5%fin: pesare 5g di L-cisteina cloridrato 1-idrato (BDH 370553) e portare a 100ml con acqua mQ, dopodiché filtrare in provetta falcon sterile con filtro 0.45μιη e conservare a 4°C±2 fino ad 1 anno (tale soluzione dovrà essere addizionata al medium LAPTg per ottenere una concentrazione finale dello 0,05%).
Procedimento .
8.1 Sciogliere il terreno LAPTg (5.1) in quantità sufficiente per il n° di piastre che si dovranno allestire (vedi N.B. al punto 8.5.5), considerando che per ogni piastra sono necessari circa 12 ± 1 mi di terreno .
Se si prevede la conta delle stesse diluizioni del campione, oltre che nel terreno tal quale LAPTg, anche nello stesso addizionato di uno o più agenti selettivi (N) considerare il (n° di piastre) moltiplicato per N. Lasciare termostatare il terreno in bagnetto alla temperatura di 45°C ± 0,5 per almeno 3 ore;
8.2 Elenco agenti selettivi e relativa preparazione 8.2.1 Antibiotici
> VANCOMICINA
soluzione stock lmg/ml (sterilizzata per filtrazione 0,45μπι)
diluente acqua
concentrazione d'uso 1 pg/ml
selezione positiva lattobacilli eterofermentanti obbligati e facoltativi (es. L. plantarum, L. rhamosus, L. casei, L. paracasei etc.).
selezione negativa ceppi sensibili quali lattobacilli omofermentanti (es. L. acidophilus group) e bifidobatteri .
Conservazione: aliquote da l,5ml a 4°C per 15 giorni o a -20°C fino a 4 mesi.
> CLORAMFENICOLO
soluzione stock 10mg/ml (sterilizzata per filtrazione 0,45pm)
diluente etanolo
concentrazione d'uso 7Dpg/ml
selezione positiva ceppi con MIC > 4 pg/ml (es. LPC 00) selezione negativa ceppi a maggiore sensibilità (MIC < 2 pg/ml).
Conservazione: aliquote da 2 mi a -20°C fino a 4 mesi > CLINDAMICINA CIPROFLOXACINA
soluzione stock lmg/ml clindamicina 10mg/ml ciprofloxacina (sterilizzate per filtrazione 0,45μτη) diluente acqua (in caso di scarso scioglimento della ciprofloxacina aggiungere 1-2 gocce di acido lattico concentrato).
Concentrazione d'uso 0,1 pg/ml clindamicina e 10 pg/ml ciprofloxacina
selezione positiva L. acidophilus group
selezione negativa L. rhamosus, L. casei, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. delbrueckii, bifidobatteri, lattococchi e Streptococcus thermophilus.
Conservazione aliquote da 1,5 mi a -20°C fino a 6 mesi per ciprofloxacina (clindamicina n.d.).
> CEFUROXIME
soluzione stock lmg/ml (sterilizzata per filtrazione 0,45pm)
diluente acqua
concentrazione d'uso 0,lpg/ml
selezione positiva ceppi con MIC > 1 (es. B. longum PCB 133)
selezione negativa Streptococcus thermophilus (es YO 8) ed altri ceppi con MIC ≤ 0,016.
Conservazione aliquote da 1,5 mi a -20°C fino anche a 2 anni .
> CEFOXITINA
soluzione stock 10 mg/ml (sterilizzata per filtrazione 0,45pm)
diluente acqua
concentrazione d'uso 100pg/ml
selezione positiva ceppi con MIC > 256 (es. LGG, LPC 08, LC 01)
selezione negativa LP 01, LP 02, L. acidophilus group ed altri ceppi sensibili con MIC < 24.
Conservazione aliquote da 1,5 mi a -20°C fino anche a 2 anni .
> MUPIROCINA
soluzione stock 10 mg/ml (sterilizzata per filtrazione 0,45pm)
diluente acqua
concentrazione d'uso 50pg/ml
selezione positiva Bifidobatteri
selezione negativa Lattobacilli.
Conservazione aliquote da 1,5 mi a -20°C fino a 6 mesi > CIPROFLOXACINA (selezione positiva LP02 in miscela con LF10).
soluzione stock 10 mg/ml (sterilizzata per filtrazione 0,45pm)
diluente acqua (in caso di scarso scioglimento aggiungere 1-2 gocce di acido lattico concentrato)
concentrazione d'uso 5pg/ml
selezione positiva LP02
selezione negativa LF10.
Conservazione aliquote da 1,5 mi a -20°C fino a 6 mesi 8.2.2 Altre condizioni selettive.
8.3 Nel caso in cui il campione da analizzare sia costituito da una miscela di due o più ceppi di lattobacilli, bifido batteri e/o è consigliabile affiancare alla conta in LAPTg una valutazione qualitativa dei ceppi costituenti la miscela utilizzando il terreno HHD. Sciogliere il suddetto terreno e lasciarlo termostatare così come descritto per il terreno LAPTg. Dopodiché distribuire il terreno in ragione di 12 ± 1 mi in piastre petri e lasciare solidificare;
8.4 Nel caso si preveda l'uso di un o più agenti selettivi, aggiungere ad una aliquota (es. 100ml per circa 8 piastre) del terreno LAPTg sciolto la soluzione di antibiotico o altro agente selettivo, necessario per la discriminazione dei ceppi costituenti il campione, alla concentrazione finale indicata, in una bottiglia sterile;
8.5 Preparare le diluizioni decimali successive del campione (sec. la ISO 6887-1:2000 par.9.2.)
8.5.1 Trasferire, per mezzo di una pipetta sterile, 1 mi di diluizione primaria, o direttamente dalla coltura campione se liquida, in una provetta contenente 9 mi di diluente sterile;
8.5.2 non introdurre la pipetta per oltre 1 cm all'interno della sospensione iniziale;
8.5.3 cambiare pipetta ad ogni diluizione;
8.5.4 omogenizzare accuratamente la diluizione con un agitatore meccanico, vortexando la provetta per 3 volte per un tempo non inferiore ai 5 secondi, ottenendo così la diluizione IO<'2>;
8.5.5 ripetere queste operazioni utilizzando la diluizione IO<’2>e diluire ulteriormente, sino a quando non si ottenga una concentrazione di microrganismi che, cresciuti in piastra, diano un numero di colonie significativo;
Da notare che la semina di n. 2 diluizioni decimali successive (es.: 10<‘8>, IO<’9>) dovrebbe permettere di trovare due diluizioni contigue contenenti un numero di cellule compreso tra 10 e 300. Nel caso in cui non si abbia alcuna idea circa il numero di cellule contenute nel campione, è necessario seminare più di 2 diluizioni decimali successive (es.: IO<'5>, IO<'6>, 10<'>, IO<"8>, IO<'9>, 10<' 10>), considerando poi solo quelle che danno origine ad un numero di colonie compreso tra 10 e 300.
8.6 distribuire 1 mi, prelevato dalle diluizioni del campione ritenute appropriate (8.5.5), nelle piastre petri ;
8.7 aggiungere il terreno LAPTg nella prima serie di piastre e LAPTg addizionato dell'agente selettivo nella seconda serie, in ragione di 12 ± 1 mi;
Da notare che il tempo intercorso tra la ricostituzione del campione ed il momento in cui la diluizione seriale viene a contatto in piastra petri con il terreno di coltura (8.6) non deve essere maggiore di 30 minuti 8.8 mescolare terreno e campione in maniera uniforme con movimento prima rotatorio e poi traslatorio orizzontale e verticale;
8.9 lasciare solidificare per 15-20 minuti;
8.10 nel caso di campioni costituiti da una miscela di due o più ceppi di lattobacilli, bifidobatteri e/o per cui si suggerisce l'utilizzo del terreno HHD, addizionare ΙΟΟμΙ delle diluizioni appropriate alle piastre di HHD pronte (8.3) e distribuire omogeneamente il campione per spatolamento;
8.11 incubare le piastre capovolte a 37+ 1°C per 72h in condizioni di anaerobiosi (giare Gas Pack kit per anaerobiosi). Per le modalità d'uso del sistema per anaerobiosi, seguire le istruzioni allegate al kit.
Calcolo dei risultati: Verificare la presenza delle colonie osservandole sotto la lente del visore per piastre e contare esclusivamente le piastre contenenti un numero di colonie compreso tra 10 e 300. Il risultato sarà espresso come UFC, cioè Unità Formanti Colonia. Esprimere il risultato utilizzando la seguente formula:
∑C
(3⁄4 0,1 n2)d
dove :
∑C è la somma delle colonie contate su tutte le piastre ni è il numero di piastre contate nella prima diluizione n2è il numero di piastre contate nella seconda diluizione
d è la diluizione da cui sono state ottenute le prime conte
Esempio :
Piastre della diluizione 10 250 Piastre della diluizione 10 23 Risultato:
250 23
-=248 IO<"8>UFC/g
(1 0,1) IO<'8>
Arrotondare il risultato ottenuto a due cifre significative. Il risultato dell'esempio riportato sarà quindi 250 10<"s>UFC/g o mi nel caso di campioni liquidi (per il dettaglio dell'espressione risultati in funzione della specifica tipologia. Nel caso di campioni spatolati in HHD esaminare visivamente le diverse morfologie delle colonie cresciute che identificano i diversi ceppi di lattobacilli e bifidobatteri presenti in miscela.
Effettuata la conta e la disamina delle colonie cresciute in piastra (punto 9) si ha: Nel caso di campioni monoceppo: la conta ottenuta dalle piastre di LAPTg tal quale rappresenta la carica totale del batterio probiotico costituente il campione.
Nel caso di campioni costituiti da una miscela di due o più ceppi di lattobacilli e bifido batteri:
a) la conta ottenuta dalla serie di piastre nel terreno tal quale LAPTg rappresenta la carica totale dei batteri probiotici nel campione sottoposto ad analisi ;
b) la conta ottenuta dalla serie di piastre allestite in terreno LAPTg addizionato dell'agente selettivo rappresenta la carica del/i ceppi che sono stati in grado di replicare in presenza di quella specifica sostanza addizionata al terreno quale forza selettiva.
c) dalla conta relativa ai singoli ceppi probiotici, ottenuta in terreno selettivo, è possibile poi ricavare la conta del/dei rimanenti ceppi che non si sono sviluppati in presenza dell'agente selettivo per differenza con la conta totale (punto a) in LAPTg tal quale .
d) la semina in terreno HHD consente di discriminare visivamente i diversi ceppi presenti nel campione in miscela e selettivamente enumerati in terreno LAPTg.
La Richiedente ha testato le seguenti materie prime con il metodo della presente invenzione utilizzando, in più prove, i ceppi di batteri probiotici, come marker di tossicità, indicati con i numeri 17, 22, 41, 60, 74, 98, 121, 145, 174 e 182 in Tabella 1.
Dati sperimentali mostrano che in molti casi si è riscontrata, in maniera inaspettata, una tossicità sempre presente a vari livelli e una % mortalità consistente .
Prova con Aloe: mortalità riscontrata pari a 5%.
Prova Acido Citrico: mortalità riscontrata pari a 2%. Prova Arabinogalattano : mortalità riscontrata pari a 6%.
Prova Aroma Lampone: mortalità riscontrata pari a 2%.
Prova Aroma Lampone: mortalità riscontrata pari a 26%.
Prova Mirtillo: mortalità riscontrata pari a 5%.
Prova Biossido di silicio: mortalità riscontrata pari a 50%.
Prova Biossido di silicio: mortalità riscontrata pari a 28%.
Prova Biossido di silicio: mortalità riscontrata pari a 23%.
Prova Gomma di Tara: mortalità riscontrata pari a 14%.
Prova Vitamina Bl, B2 e B6: mortalità riscontrata pari a 33%.
Prova Zeolite: mortalità riscontrata pari a 2%.

Claims (8)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un metodo di produzione di una materia prima alimentare o farmaceutica atossica che prevede una prima fase nella quale detta materia prima viene messa a contatto con una carica batterica prestabilita di un ceppo di batteri probiotici e una seconda fase nella quale si determina la riduzione di detta carica batterica dovuta alla tossicità esercitata da detta materia prima nei confronti di detto ceppo di batteri probiotici.
  2. 2. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta prima fase prevede la preparazione di: - un primo campione di analisi comprendente il ceppo di batteri probiotici marker a una concentrazione prestabilita, preferibilmente ad una concentrazione compresa da lxlO<6>a lxlO<9>UFC/g, il substrato culturale ottimale di crescita di detto ceppo di batteri probiotici e la materia prima alimentare o farmaceutica da testare, e - un secondo campione di analisi (riferimento interno) comprendente lo stesso ceppo di batteri probiotici di detto primo campione alla stessa concentrazione prestabilita, il substrato culturale ottimale di crescita di detto ceppo batterico probiotico e la materia prima alimentare o farmaceutica da testare.
  3. 3. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta seconda fase prevede una conta batterica da eseguire su detto primo e detto secondo campione di analisi.
  4. 4. Il metodo secondo la rivendicazione 3, in cui detta conta batterica viene eseguita con un metodo che prevede una fase nella quale il campione iniziale viene risospeso, una fase nella quale si eseguono le diluizioni seriali in un opportuno diluente, una fase di piastramento in terreno agarizzato e una fase di conta delle colonie dopo incubazione alle condizioni ottimali.
  5. 5. Il metodo secondo la rivendicazione 4, in cui si determina il rapporto tra la carica batterica (numero di cellule contate in piastra) di detto primo campione di analisi e la carica batterica (numero di cellule contate in piastra) di detto secondo campione di analisi (riferimento interno).
  6. 6. Il metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui i ceppi di batteri probotici utilizzati come marker di tossicità verso i batteri probiotici stessi sono scelti tra i Lactobacilli e Bifido batteri.
  7. 7. Il metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui detta materia prima alimentare o farmaceutica è scelta dal gruppo comprendente gli aromi, gli estratti, i co-formulanti di origine organica e/o inorganica, gli additivi tecnologici, le vitamine, le proteine, gli amminoacidi, i peptoni, i polimeri naturali e/o di sintesi e altro.
  8. 8. Un metodo di produzione di prodotti alimentari o integratori alimentari o dispositivi medici o prodotti farmaceutici comprendenti materie prime atossiche verso i batteri probiotici selezionate mediante il metodo di produzione di una materia prima alimentare o farmaceutica atossica secondo una o più delle rivendicazioni precedenti 1-7.
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